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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Abstract

La motilità è fondamentale per la sopravvivenza e il successo di molte specie batteriche. Esistono molte metodologie per sfruttare la motilità per comprendere i percorsi di segnalazione, per chiarire la funzione e l'assemblaggio delle parti flagellari e per esaminare e comprendere i modelli di movimento. Qui dimostriamo una combinazione di tre di queste metodologie. La motilità nell'agar morbido è la più antica, offrendo una forte selezione per isolare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione nei ceppi compromessi dalla motilità, dove la motilità viene ripristinata attraverso una seconda mutazione. La tecnica di tethering cellulare, utilizzata per la prima volta per dimostrare la natura rotante del motore flagellare, può essere utilizzata per valutare l'impatto degli effettori di segnalazione sulla velocità del motore e la sua capacità di cambiare direzione rotazionale. Il saggio "border-crossing" è più recente, dove i batteri del nuoto possono essere innescati per passare a muoversi collettivamente come uno sciame. In combinazione, questi protocolli rappresentano un approccio sistematico e potente per identificare i componenti del macchinario di motilità e per caratterizzare il loro ruolo in diverse sfaccettature del nuoto e dello sciame. Possono essere facilmente adattati per studiare la motilità in altre specie batteriche.

Introduzione

I batteri impiegano molte appendici per il movimento e la dispersione nelle loro nicchie ecologiche1. La motilità guidata dalla flagella è la più veloce di queste, promuovendo la colonizzazione di località favorevoli in risposta ai segnali ambientali e contribuendo in modo significativo alla capacità patogena di alcunespecie 2,3. I batteri flagellati possono nuotare individualmente in liquido sfuso o sciamare collettivamente su una superficie semi-solida4. La flagella extracellulare si attacca e viene guidata da motori rotanti incorporati nella membrana, che sfruttano la potenza dei gradienti ionici per generare coppia che causala rotazione 1,2,4,5,6,7,8. In E. coli, i cui motori funzionano a una coppia costante 9 , l'uscita del motore può essere classificata in termini di velocità di rotazione e commutazione del rotore tra direzioni antiorario (CCW) e in senso orario (CW). La rotazione CCW promuove la formazione di un fascio flagellare coerente che spinge la cella in avanti (corsa), mentre un interruttore transitorio in direzione rotazionale (CW) fa sì che il fascio si smonti parzialmente o completamente10e la cella riorienti la sua direzione di nuoto (tumble). E. coli in genere corre per un secondo e cade per un decimo di secondo. La frequenza di commutazione del rotore o "tumble bias" è controllata dal sistema di segnalazione chemiotassi, in cui i chemorecettori transmembrana rilevano segnali chimici esterni e li trasmettono tramite fosforelay al motore flagellare per estendere le corse in risposta agli attrattori, o sopprimerle in risposta asostanze chimiche tossiche 11,12. La motilità del nuoto viene saggiata in un agar morbido dello 0,3%.

Durante lo sciame, i batteri navigano su una superficie semi-solida come un collettivo denso, dove branchi di batteri srotoleggiano in un movimento vorticosocontinuo 2,13,14,15. Gli sciami di E. coli mostrano una fisiologia chemiosensoriale alterata (distorsione della caduta inferiore), velocità più elevate e maggiore tolleranza agli antimicrobici sulle cellule che nuotano nel liquido sfuso16,17. Gli sciami variano nella loro implementazione di una pletora di strategie che aiutano il movimento, tra cui la produzione di tensioattivi, l'iperflagellazione e l'allungamento cellulare2. Lo sciame offre ai batteri un vantaggio competitivo sia in contesti ecologici checlinici 18,19,20. Ci sono due categorie di batteri brulicanti: sciami temperati, che possono sciamare solo su supporti solidificati con agar 0,5-0,8%, e sciami robusti, che possono navigare attraverso concentrazioni di agar piùelevate 21.

Esistono una varietà di saggi per interrogare la motilità del nuoto e la sua regolazione. Se compromessa da mutazioni o condizioni ambientali, la motilità stessa offre una forte selezione per identificare le mutazioni soppressori del guadagno di funzione. Questi soppressori possono essere veri revertanti della mutazione originale, o pseudo-revertanti, dove una seconda mutazione ripristina la funzionalità. Tali mutanti possono essere identificati dal sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Un'alternativa alla selezione imparziale del soppressore è una strategia di mutagenesi mirata distorta (ad esempio, mutagenesi PCR). Queste metodologie spesso fanno luce sulla funzione o sulla regolazione ambientale dell'apparato di motilità. Se l'obiettivo è quello di studiare la funzione motoria, allora il ripristino della motilità di tipo selvaggio misurata in agar morbido potrebbe non indicare necessariamente il ripristino della produzione motoria di tipo selvaggio. Il saggio di tethering cellulare, in cui le cellule sono attaccate a una superficie di vetro da un singolo flagello e la rotazione del corpo cellulare viene successivamente monitorata, può essere il saggio iniziale di scelta per valutare il comportamento motorio. Sebbene siano ora disponibili metodologie più sofisticate per monitorare le proprietà del motore, la necessaria configurazione e applicazione di pacchetti software per l'analisi del movimento limita il loro usodiffuso 22,23,24,25. Il saggio di tethering cellulare richiede solo che la flagella sia tranciata, consentendo l'attacco dei filamenti corti a uno scivolo di vetro, seguito da una videoregistrazione della rotazione del corpo cellulare. Sebbene le velocità motorie registrate siano basse in questo saggio a causa dell'elevato carico che il corpo cellulare esercita sul flagello, questo saggio ha comunque contribuito a preziose intuizioni sulle risposte chemiotattiche26,27,28,29e rimane un valido strumento investigativo come discusso di seguito.

La motilità brulicante pone una serie diversa di sfide ai ricercatori. La selezione dei soppressori di guadagno di funzione funziona solo in sciami che producono abbondanti tensioattivi e sciamiprontamente 13. I non produttori tensioattivi come E. coli sono esigenti per quanto riguarda la scelta dell'agar, la composizione dei media e l'umiditàdell'ambiente 2,13,14,21. Una volta stabilite le condizioni di sciame, il saggio di attraversamento dellafrontiera 17 è una metodologia utile per interrogare la capacità di uno sciame di navigare in condizioni nuove / difficili. Sebbene i protocolli presentati di seguito riguardino E. coli, possono essere facilmente adattati per l'applicazione in altre specie.

Protocollo

1. Isolamento dei mutanti soppressori in ceppi carenti di motilità

NOTA: Utilizzare questo metodo come un ampio "catch-all" per identificare la natura generale del difetto di motilità.

  1. Preparazione piastra soft-agar
    NOTA: Soft-agar, noto anche come motilità o agar da bagno, è un agar a bassa percentuale (~0,2-0,35% w/v), a lungo usato per saggiare chemiotassi31,32.
    1. Aggiungere 3 g di bacto-agar (0,3% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O (acqua a doppia distillazione) al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.
    2. Autoclave per 20 min a 121 °C.
    3. Lasciare raffreddare con delicata agitazione utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando la temperatura raggiunge circa 50 °C, versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare che l'agar fuso si metta con coperchio in posizione per almeno 1 h, da utilizzare entro 16 ore.
  2. Preparazione della cultura, inoculazione e isolamento dei mutanti soppressori
    NOTA: E. coli inoculato al centro di mezzi ricchi di nutrienti solidificati con agar morbido consumano nutrienti localmente, creando un gradiente nutritivo che seguono. Mentre si spostano verso l'esterno, compaiono "anelli" definiti (Figura 1A), che sono correlati a specifici chemioatattanti a cui i batteri rispondono. Difetti nel sistema chemiotassi o componenti strutturali del motore flagella possono compromettere le prestazioni in questo saggio. Spesso, i mutanti con un vantaggio di motilità sorgono durante lo screening e possono essere visti emergere da singoli o da più punti lungo la periferia dell'anello, da dove "divampano"(Figura 1C). Si noterà che il bordo più esterno del fronte di nuoto contrasta prontamente con l'agar morbido vergine non colato.
    1. Coltivare colture notturne del ceppo desiderato carente di motilità in 5 mL di Brodo di Lennox (LB; 10 g/L di triptono, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L NaCl, Tabella dei Materiali)a 30 °C con scuotimento orizzontale (220 r.p.m.). Il giorno seguente, la sottocultura (diluizione 1:100) in LB fresco, crescendo nelle stesse condizioni fino alla fase esponenziale (OD600 di 0,6).
    2. Inoculare 6 μL della coltura al centro di una piastra di agar morbido (1.1) utilizzando una pipetta, spingendo la punta sterile caricata nell'agar per espellere delicatamente il contenuto. Trasferimento a 30 °C e incubare (Figura 1B), fino a quando i "brillamenti" di motilità sono evidenti, emanando dal punto di inoculazione o dalla periferia degli anelli di motilità, tipicamente in 24-36 h(Figura 1C).
      NOTA: Nei saggi di motilità, inoculare un ceppo di tipo selvatico insieme agli isolati mutanti per il confronto. Questo ceppo di tipo selvatico mostrerà i caratteristici anelli chemiotattici concentrici(Figura 1A)e riempirà la piastra entro 8-10 ore.
    3. Utilizzare un filo-loop sterile per sollevare le cellule dalla regione e dalla striscia "flare" per purificare singole colonie su una piastra di agar duro LB (LB preparata come sopra, solidificata con bacto-agar da 15 g/L).
    4. Scegli singole colonie dalla piastra di striscia usando un anello di filo sterile e purificale striature per singole colonie per garantire l'isolamento di una colonia "pura" isolata.
  3. Conferma e caratterizzazione dei mutanti soppressori
    1. Verificare che i mutanti soppressori isolati abbiano ripristinato la motilità. Preparare piastre di agar morbido (1.1) e colture per ceppi di interesse (come al punto 1.2.1), compresi i tipi selvatici e il ceppo iniziale "carente di motilità" per il confronto.
    2. Inoculare le piastre (come in 1.2.2) e incubare a 30 °C per 8-10 h.
    3. Registrare il diametro dell'anello più esterno (bordo del cerchio) e confrontare per stabilire quale degli isolati ha sostanzialmente ripristinato la motilità.
      NOTA: Si raccomanda di fotografare le lastre durante tutto il corso del tempo dell'esperimento. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare un dispositivo "secchiello diluce" 30, in cui una fotocamera digitale è montata sopra una sorgente luminosa per una migliore illuminazione per misurare il diametro della colonia di nuoto e distinguerla dall'agar non raggruppato.
    4. Soggetto isolato in WGS come richiesto, consentendo una sufficiente "copertura della sequenza" per identificare positivamente le mutazioni che hanno ripristinato la funzione di tipo selvaggio.

2. Quantificare il comportamento motorio della flagella tramite il tethering cellulare

NOTA: utilizzare questo metodo quando il normale comportamento run-tumble (chemiotaxis) sembra essere compromesso.

  1. Preparazione della cultura e tosatura della flagella
    1. Preparare una cultura di fase esponenziale del ceppo di interesse come descritto al passaggio 1.2.1.
    2. Pellet 10 mL di cellule per centrifugazione a 2.000 x g per 3 minuti prima di rimescolare in 10 mL di Motiliity Buffer sterilizzato con filtro (MB; Tampone fosfato di potassio da 10 mM [0,0935 M K2HPO4, 0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], NaCl da 10 mM, 75 mM KCl).
      NOTA: MB supporta la motilità, ma non supporta la crescita batterica
    3. Ripetere il passaggio 2.1.2 altre due volte prima di rimospendere il pellet finale in 1 mL di MB.
    4. Trasferire la sospensione cellulare in una siringa da 1 ml e attaccare un ago 23G all'estremità. Assemblare un identico apparato siringa/ago e fissare i due insieme tramite 6 pollici di tubi di polietilene (diametro interno di 0,58 mm) strettamente infilati su ogni punta dell'ago.
    5. Tosare la flagella (sono fragili e si rompono facilmente) passando delicatamente la sospensione cellulare avanti e indietro da una siringa all'altra 50x, con 1 min di pausa tra ogni 10 passaggi.
    6. Centrifugare le cellule tranciate a 2.000 x g per 3 minuti e rimombidare in un volume finale di 500 μL di MB.
  2. Preparazione delle diapositive e tethering cellulare
    1. Preparare una camera di fissazione delle celle impilando un coverslip da 18 mm x 18 mm su uno scivolo da microscopio in vetro da 3 pollici x 1 pollice x 1 mm, separato da nastro a doppia parte (Figura S1).
    2. Sciacquare la camera con soluzione di polilisina 0,01% (w/v) applicandosi sulla parte superiore della camera. Inclinare il bordo inferiore (il coverslip flush con lo scivolo del microscopio) su un tergicristallo (carta velina) per aiutare a disegnare la soluzione attraverso la camera (Figura S1). Quindi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
    3. Lavare la camera tre volte con 40 μL di MB utilizzando come descritto al passaggio 2.2.2
    4. Aggiungere 40 μL della sospensione cellulare tranciata (preparata sopra) nella parte superiore della camera e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al coperchio.
    5. Sciacquare delicatamente la camera con 40 μL di MB come in 2.2.3 per rimuovere le celle non attaccate.
  3. Registrazione e quantificazione della rotazione cellulare
    1. Trasferire lo scivolo del microscopio caricato con celle tethered allo stadio del microscopio.
    2. Utilizzando la microscopia a contrasto di fase e un obiettivo 100x, scansionare la popolazione alla ricerca di cellule fissate in posizione e ruotare su un singolo asse, o cioè rotazioni lisce su un punto fisso piuttosto che presentarsi con un angolo in cui la cella si muove in uscita e fuori fuoco (Video 1).
    3. Utilizzare un microscopio commerciale e la fotocamera associata. Aprire il software associato, assicurarsi che le celle di interesse siano a fuoco e fare clic sull'acquisizione video per registrare la rotazione delle celle per un minuto (a 10 fotogrammi al secondo o superiore).
    4. Dalla riproduzione video, quantificare il numero di rotazioni complete al minuto e il numero di volte in cui la cella cambia direzione (frequenza di commutazione).
      NOTA: Le velocità di rotazione e la frequenza di commutazione possono essere troppo veloci per essere misurate a occhio, quindi si consiglia di utilizzare un software video che offre una riproduzione lenta / fine o adotta un sistema software automatizzato per quantificare i patternrotazionali 33. Un'alternativa sarebbe aumentare la viscosità dell'MB usando la cellulosa metile (o agente simile) per aiutare a rallentare e risolvere la rotazione di batteri più veloci o compensare quando sono in uso telecamere con bassi framerate.
    5. Ripetere il passaggio 2.3.2 con repliche biologiche per compilare una rappresentazione della popolazione di interesse.

3. Preparazione di sciami in un saggio di attraversamento della frontiera

NOTA: Utilizzare questo metodo per valutare l'impatto di una mutazione o condizione sulla motilità di gruppo. Swarm-agar si riferisce all'agar dove la percentuale è tipicamente superiore a quella di soft-agar. Nell'agar morbido (0,3 %), le cellule nuotano individualmente all'interno dell'agar. Nell'agar dello sciame (0,5% e oltre), le cellule si muovono come gruppo sulla superficie. Mentre le piastre dello sciame devono essere utilizzate come descritto in dettaglio qui, le piastre da bagno hanno una durata di conservazione più lunga e possono essere utilizzate per diversi giorni. La nostra preferenza personale è da utilizzare in 1-2 giorni.

  1. Preparazione dell'agar sciame
    1. Aggiungere 5 g di agar Eiken (0,5% w/v) e 20 g di LB in un pallone inferiore rotondo da 2 L. Aggiungere 1 L di ddH2O al pallone e mescolare uniformemente la sospensione utilizzando un'asta di agitazione e una piastra di agitazione magnetica.
    2. Autoclave per 20 min a 121 °C.
    3. Lasciare raffreddare con delicata agitazione per evitare bolle d'aria utilizzando l'asta / piastra come sopra. Quando si aggiungono circa 50 °C, aggiungere glucosio sterilizzato con filtro per una concentrazione finale dello 0,5 %.
    4. Versare 25 mL in piastre di Petri sterili (100 mm x 15 mm) e lasciare impostare a temperatura ambiente per almeno 14 ore e non più di 20 ore. Non conservare per un uso futuro.
  2. Inoculazione e incubazione di piastre sciame
    1. Inoculare 6 μL di una coltura medio-esponenziale (preparata come in 1,2) individuando sopra l'agar.
    2. Lasciare il coperchio spento per 5-10 minuti e sostituire quando l'inoculo si è asciugato nella superficie dell'agar.
    3. Incubare a 30 °C per 8 ore. Evita la tentazione di ispezionare i progressi dello sciame rimuovendo il coperchio, in quanto ciò contribuirà all'asciugatura dell'agar e compromette lo sciame.
      NOTA: Il tempo di incubazione può variare a seconda del fenotipo di deformazione. Alcune mutazioni isolate possono ostacolare la capacità di sciame e richiederanno una ridotta percentuale di agar o un periodo di incubazione più prolungato.
  3. Preparazione di targhe di dosaggio transfrontaliere
    NOTA: Questo saggio utilizza una piastra di Petri modificata, in cui una divisione di plastica (bordo) crea due camere, anziché una (Figura 2A). Ogni camera può essere preparata indipendentemente dall'altra, offrendo condizioni diverse per lo sciame, prima di "collegare" le due. A seconda del design sperimentale, la prima camera (designata a sinistra) può essere preparata con agar da bagno (0,3% w/v) o agar sciame (0,5% w/v) da cui i batteri possono migrare attraverso il confine nella camera destra contenente agar sciame +/- qualsiasi integratore o sfida richiesta (ad esempio, antibiotici). La migrazione su entrambi gli agar viene tipicamente misurata/confrontata registrando il diametro più ampio della colonizzazione batterica (da bordo a bordo) dal punto originale di inoculazione.
    1. Preparare l'agar da bagno come descritto al punto 1.1, se necessario.
    2. Preparare l'agar dello sciame come descritto al punto 3.1.
    3. Versare ~30 mL di agar sciame (con l'integrazione desiderata se necessario) nella camera destra di una piastra di Petri a doppio compartimento (100 mm x 15 mm), al punto in cui è livellata con il divisore di plastica tra le camere, ma non traboccante a sinistra(Figura 2B).
    4. Dopo che l'agar si è indurito, riempire la camera sinistra con ~ 30 mL di agar da bagno o sciame, di nuovo al punto di contatto con il diviso di plastica(Figura 2C). Prima di impostarlo, utilizzare una punta sterile per trascinare delicatamente l'agar oltre il bordo per collegare i due lati con un ponte di agar alto ~ 1 mm che si estende per l'intera lunghezza della divisione (Figura 2D).
    5. Lasciare asciugare la piastra a temperatura ambiente (3.1).
      NOTA: Un metodo alternativo per creare il ponte è consentire all'agar della camera sinistra di asciugarsi e quindi pipettare lentamente ~ 100 μL di agar sciame fuso lungo il divisore di plastica per collegare le due camere (3.4). Inoculare le piastre sulla camera sinistra come sopra dettagliato per nuotare (1.2.2) o sciame (3.2) agar, prima di incubare a 30 °C per 12-16 ore, o fino a quando gli sciami non hanno fatto progressi sufficienti sulla camera destra per consentire confronti tra ceppi di interesse.

Risultati

L'isolamento degli pseudo-revertanti in un ceppo E. coli la cui motilità è compromessa da alti livelli della molecola di segnalazione c-di-GMP, è stato descritto in recente lavoro del nostro laboratorio34. Questo ceppo (JP1442) ha ospitato due mutazioni: ΔyhjH e ΔycgR. YhjH è la fosfodiesterasi più attiva che degrada il c-di-GMP in E. coli. L'assenza di YhjH porta ad elevati livelli di c-di-GMP e all'inibizione della motilità. YcgR è un effettore c-di-G...

Discussione

L'isolamento e la caratterizzazione delle mutazioni soppressori hanno contribuito con successo all'identificazione dei componenti chiave del sistema chemiotassi35,36,37,nonché della macchina motorestessa 38,39,40. Durante l'utilizzo del protocollo 1, è importante includere più repliche indipendenti per garantire l'isolamento di un am...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione gm118085 dei National Institutes of Health e in parte dalla Robert Welch Foundation (sovvenzione F-1811 a R.M.H.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, DihydrateFisher Scientific02-002-786
Eiken agarEiken Chemical Co. JapanE-MJ00Essential for E. coli swarming
Glucose D (+)Fisher Scientific410955000
LB (Lennox) BrothFisher ScientificBP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%)Sigma-AldrichP8920
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6)OlympusOr equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided TapeFisher50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mmFisher12-550-343
Olympus BX53 microscopeOlympusBX53Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter)Fisher ScientificFB0875712For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)Perkin Elmer9908265
Round Petri Dish with 2 CompartmentsVWR89200-944For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G)Fisher Scientific14-826A
Sterile Syringe - 1 mLFisher scientific14-955-450
Task/Tissue wipesFisher scientific06-666Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mmVWR48366205
XM10 cameraOlympusXM10Or equivalent microscope camera

Riferimenti

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