Kanserle İlişkili Fibroblastların Tümör Büyümesindeki Rolünü Araştırmak İçin Bir Fare Modeli

Özet

Kanser hücrelerini ve fibroblastları birlikte enjekte etmek ve zamanla tümör büyümesini izlemek için bir protokol sağlanır. Bu protokol, fibroblastların tümör büyümesinin düzenleyicileri olarak rolünün moleküler temelini anlamak için kullanılabilir.

Özet

Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), tümörü teşvik eden bir mikro çevre oluşturarak tümör büyümesinde önemli bir rol oynayabilir. CAF'ların tümör mikroortamındaki rolünü inceleyen modeller, fibroblastların, farklı dokulardan fibroblastların ve fibroblastlardaki spesifik genetik faktörlerin fonksiyonel önemini anlamak için yararlı olabilir. Fare modelleri, in vivo bağlamda tümör büyümesine ve ilerlemesine katkıda bulunanları anlamak için gereklidir. Burada, kanser hücrelerinin fibroblastlarla karıştırıldığı ve tümör geliştirmek için farelere verildiği bir protokol sağlanır. Zaman içindeki tümör boyutları ve nihai tümör ağırlıkları belirlenir ve gruplar arasında karşılaştırılır. Açıklanan protokol, CAF'ların tümör büyümesi ve ilerlemesindeki fonksiyonel rolü hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir.

Giriş

Tümör mikroçevresinde, en belirgin hücre tiplerinden biri kanserle ilişkili fibroblasttır (CAF)¹. Bu karsinomla ilişkili fibroblastlar tümör baskılayıcı bir rol oynayabilir ^2,3. Örneğin, S100A eksprese eden fibroblastlar, kanserojenleri kapsülleyebilen ve karsinom oluşumuna karşı koruma sağlayabilen kollajenleri salgılar⁴. Ayrıca, pankreas kanserinde α-düz kas aktini (SMA) pozitif miyofibroblastların tükenmesi immünsüpresyona neden olur ve pankreas kanseri ilerlemesini hızlandırır². CAF'lar ayrıca kanser hücreleri ile birlikte gelişebilir ve tümör ilerlemesini teşvik edebilir 5,6,7,8. Fibroblastlar, tümörü teşvik eden bir ortam yaratan hücre dışı matriks proteinlerini sentezleyebilir ve salgılayabilir⁸. Bu hücre dışı matriks proteinleri, tümör ilerlemesi ile ilişkili olan dokunun mekanik sertleşmesine neden olabilir ^9,10. Biriken hücre dışı matriks, bağışıklık infiltrasyonunu inhibe eden fiziksel bir bariyer görevi görebilir¹¹. CAF'lar tarafından matriks birikimi de tümör invazyonu ile ilişkilendirilmiştir, çünkü CAF'lar tarafından üretilen fibronektinin tümör invazyonunu teşvik ettiği gösterilmiştir¹². CAF'lar anjiyogenezi teşvik eder ve dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), interlökin-6 (IL-6) ve CXC-kemokin ligand 12 (CXCL12)^13,14,15 salgılayarak immünosüpresif hücreleri tümör mikroçevresine alır. Tümör büyümesini teşvik etmedeki merkezi rolleri nedeniyle, kanserle ilişkili fibroblastlar anti-kanser tedavisi için ortaya çıkan bir hedeftir 6,16,17,18.

Aşağıdaki protokol, fibroblastların tümör büyümesinin iyi kurulmuş ve yaygın olarak kullanılan bir fare modelinde tümörlerin büyümesini nasıl etkilediğini test etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Fibroblastların tümör mikroortamındaki önemini anlamak için, büyümelerini izlemek için kanser hücrelerini farelere sokmak için standart protokol, kanser hücresi girişi ile fibroblastları içerecek şekilde değiştirildi. Kanser hücreleri deri altından veya intradermal olarak sokulabilir. İntradermal giriş, cildin kendisinden kaynaklanan tümörlerle sonuçlanır. Kanser hücrelerinin ve fibroblastların farelere birlikte enjekte edildiği ksenogreftler, fibroblastların, fibroblastların alt popülasyonlarının ve protein faktörlerinin kanser büyümesini teşvik etme yeteneğindeki rolünü incelemek için önemli bir metodolojik araçtır 19,20,21. Kanser hücrelerinin ve fibroblastların farelere birlikte enjeksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu yöntem, fibroblastların varlığını veya yokluğunu karşılaştırmak, farklı kaynaklardan fibroblastları karşılaştırmak için^{kullanılabilir 20} veya fibroblastları spesifik proteinlerin ekspresyonu olan ve olmayan fibroblastları karşılaştırmak^{için 19}. Kanser hücreleri ve fibroblastlar tanıtıldıktan sonra, zamanla tümör boyutu izlenebilir. Deneylerin sonunda, tümörler diseke edilebilir ve tartılabilir. Zaman içinde tümör büyümesi izlenerek, farklı faktörlerin önemi diseke edilebilir.

Fibroblastların tümör büyümesindeki rolünü incelemek için olası alternatif yaklaşımlar vardır. Örnek olarak, fibroblastlarda tercihen ifade edilen sürücülerle genlerin dokuya özgü nakavtını sağlayan Cre-loxed tabanlı modeller vardır. Bu tür yaklaşımlar ayrıca tümör progresyonu için fibroblastlarda spesifik genlerin ve yolakların rolünü araştırmak için fırsatlar sağlar. Cre-lox tabanlı yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, sağlanan protokol, fibroblastların rolünü izlemek için önemli ölçüde daha hızlı bir yaklaşımı temsil edecektir, çünkü tümör büyümesi sadece birkaç hafta içinde izlenecektir. Sağlanan yaklaşım aynı zamanda önemli ölçüde daha ucuzdur, çünkü genetiği değiştirilmiş farelerin kolonilerinin üretilmesini ve barındırılmasını gerektirmez. Sağlanan protokol, fare kolonileri geliştirmeye ihtiyaç duymak yerine shRNA'lar kullanarak farklı genlerin yıkılmasının etkisini hızlı bir şekilde test etmek için kullanılabilir. Sağlanan yaklaşım aynı zamanda daha esnektir, çünkü farklı sayıda fibroblastın, farklı kanser hücrelerinin ve fibroblastların farklı oranlarının, farklı genlerin yıkılmasına ve hatta farklı doku bölgelerinden veya türlerden fibroblastların karşılaştırılmasına izin verecektir. Bir Cre-lox yaklaşımı, fibroblastların farelerde daha fizyolojik bir bağlamda bulunması avantajına sahip olacaktır.

Burada bildirilen protokol, fibroblastların tümör büyümesi üzerindeki etkilerini hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde izlemek isteyen bilim adamları için değerli olacaktır. Bu protokol, tümör büyümesi üzerine tümör büyümesi üzerine farklı kaynaklardan fibroblastların veya fibroblastların farklı alt kümelerini araştıran bilim adamları için özellikle değerlidir. Tümör başlangıcının fizyolojik bir bağlamda gerçekleşmesi önemliyse, genetik olarak tasarlanmış fare modelleri düşünülmelidir.

Bu deneyleri gerçekleştirmek için birkaç olası yaklaşım vardır. Bağışıklık yetkin fareler, fibroblast-immün hücre etkileşimlerinin araştırılmasına izin verecek konakçı olarak kullanılabilir. Bağışıklık yetkin fare modelleri için, fare kanseri hücreleri ve fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) enjekte edilmelidir. MEF'lerin kullanımı ayrıca, araştırmacının, ilgilendiği bir genin varlığını veya yokluğunu test etmek için çok çeşitli nakavt fare suşlarından yararlanmasına izin verir. Alternatif olarak, bağışıklık yetersizliği olan fareler, insan kanser hücrelerinden türetilen farelerde tümörlerin büyümesini teşvik etmede insan fibroblastlarının rolünü test etmek için kullanılabilir. Kanser hücrelerinin tanıtımı deri altından veya ortotopik olarak yapılabilir. Melanom için, aşağıda tarif edildiği gibi, tümör-fibroblast karışımı, bir melanomun gelişeceği cilt içindeki yeri daha yakından simüle eden ortotopik enjeksiyon için intradermal olarak enjekte edilebilir.

Protokol

Açıklanan tüm deneyler, Los Angeles'taki Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

NOT: Fare suşu için konakçı farelerle eşleşen kanser hücrelerini ve fibroblastları seçin. Konakçı farenin cinsiyetiyle eşleşen kanser hücrelerini ve fibroblastları seçin. Fareleri üreme kolonilerinden alın veya saygın satıcılardan satın alın. Tümörleri ~ 8-10 haftalık farelere tanıtın. Kürklü fareler, saç folikülü döngüsünün telojen veya dinlenme aşamasında olacaktır. Kanser hücresine 0.5 ila 3 fibroblast oranı için plan yapın.

1. Deney için kullanılacak uygun fare sayısını belirleyin

1. Çalışmaları gerçekleştirmeden önce, çalışmalar için kullanılacak uygun fare sayısını belirlemek için bir güç analizi yapın. Belirtilen güce sahip bir denemenin örnek boyutunu belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
   n = (Z(_1-α/2)+Z_(1-β)/ES₎₂
   Seçilen anlamlılık düzeyi α ise (genellikle 0,05), 1-α/2 = 0,975 ve Z=1,960.
   β güçtür ve eğer %80 güç isteniyorsa, o zaman Z=0.84.
   
   ES, etki boyutu = \μ_{1-μ 0}\/σ
   burada μ 0, H₀ hipotezi altındaki ortalamadır, μ 1, H₁ hipotezi altındaki ortalamadır ve σ, faiz^22'nin sonucunun standart sapmasıdır.
   NOT: Örneklem büyüklüğünün hesaplanması hakkında daha fazla bilgi²² bulunabilir.

2. Enjeksiyon için kanser hücreleri üretin

1. Aşağıdaki denklemle ilgili büyüme oranını belirleyin:
   Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t
   
   NOT: 24 saat içinde iki katına çıkan hücreler için bir örnek gösterilmiştir
   İki katına çıkma süresi = ln(2)/büyüme oranı
   24 saat = ln(2)/büyüme hızı
   24*büyüme oranı = .693
   Büyüme hızı = .693/24= .028875
2. Plakalanacak kanser hücrelerinin sayısını ve enjeksiyondan önce hücrelerin büyümesi gereken süreyi belirleyin.
   NOT: Oluşan her tümör için 0.25-1 milyon kanser hücresi enjekte edilir.
3. Denkleme göre yeterli sayıda hücre oluşturmak için gereken gün sayısını hesaplayın
   N(t)=N(0)e^gr*t
   burada N(t) t zamanındaki hücre sayısıdır, N(0) 0 zamanındaki hücre sayısıdır, gr büyüme hızıdır ve t zamandır.
   NOT: 12 tümörün her birine 10⁶ hücre üretmek için 500.000 hücreyi büyütmek için bu hesaplamalara bir örnek. Bu hesaplamalara dayanarak, gerekli sayıda hücreyi büyütmek için 5 gün yeterlidir:
   N(t)=N(0)e^gr*t
   12 x 10⁶ = 500.000e^(gr*t)
   12 x 10⁶ = 500.000e ^{(.028875 * t)}
   24=e^(.028875*x)
   ln(24)=0,028875x
   3,178=0,028875x
   X=110 saat= 4,59 gün
   Hücrelerin plakaya yapışması ve toplama sırasında kaybolan hücreler için fazladan zaman tanıyın.
4. Plaka kanseri hücreleri.
   NOT: Kültürlü hücrelerle çalışırken eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.
   NOT: Mikropların havadan numunelere girmesini en aza indirmek için laminer akış başlığında hücre manipülasyonları gerçekleştirin. Doku kültürü başlığını kullanmadan önce ultraviyole ışıkla tedavi edin. Steril teknik ve sadece steril hücre kültürü plastik eşyaları ve doku kültürü ile işlenmiş plakalar, pipetler ve konik tüpler gibi sarf malzemeleri kullanın.
   1. Şişedeki hücre sayısına ve kaplandıktan sonra istenen hücre konsantrasyonuna bağlı olarak doku kültürü plakalarının doğru sayısını ve boyutunu hesaplayın.
   2. Doku kültürü plakalarını etiketleyin.
   3. 37 °C'de suyla bir su banyosu hazırlayın.
   4. Aliquot ortamını konik tüplere yerleştirin ve 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. Birçok kanser hücresi, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenerek yetiştirilebilir.
   5. Gerekli sayıda dondurulmuş hücre şişesini sıvı azot dondurucudan çıkarın.
      NOT: Sıvı nitrojen dondurucudaki hücreleri tutarken dondurucu eldivenleri kullanın.
   6. Yavaşça sallarken su banyosundaki hücre şişelerini hızla çözün.
      NOT: Steriliteyi korumak için şişeleri tutarken eldivenlere etanol ekleyin.
   7. Bir doku kültürü başlığında steril teknik kullanarak, hücreleri 10 mL DMEM +% 10 FBS içeren 15 mL'lik bir konik tüpe pipetin.
   8. Hücre karışımını 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
   9. Süpernatantı steril emme veya steril 10 mL pipet ile yavaşça çıkarın.
   10. Peletteki hücreleri nazikçe 1 mL DMEM +% 10 FBS'ye yeniden askıya alın.
   11. Yeniden askıya alınan hücreleri steril bir p1000 ile etiketli bir doku kültürü plakasına pipetin.
   12. Steril 10 mL pipetler kullanılarak, serum ile doku kültürü plakalarına pipet ortamı.
   13. Doku kültürü plakalarını 37 °C'de %5 CO₂ ile bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
5. Enjeksiyon için yeterli kanser hücresi üretmek için kanser hücrelerini genişletin.
   NOT: Akıcılık için hücreleri ışık mikroskobu ile izleyin. Her iki ila üç günde bir veya hücrelerin% 100 birleşmeye ulaşmasını önlemek için gerektiğinde tripsinizi yapın. Çok sayıda hücre gerekiyorsa, çok sayıda hücreyi alan ve orta verimli bir şekilde büyütmek için hiperşişeler (Malzeme Tablosu) kullanın. Hücrelerin her geçirilmesi gerektiğinde, şu prosedürü izleyin:
   1. Ortamı steril emme veya steril 10 mL pipet ile plakadan çıkarın.
   2. Sıcak fosfat tamponlu salin (PBS) üzerine pipetleyerek plakayı nazikçe yıkayın. Ardından PBS'yi steril emme veya pipet ile çıkarın.
   3. PBS'de 5 mL 1x Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 'yi 10 cm'lik bir plaka için hücrelere pipet edin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   4. Hücreleri plakadan çıkarmak için nazik dokunuşlarla plakadan hücreleri çıkarın.
   5. Steril 10 mL pipet kullanarak, hücreleri konik tüplerde% 10 FBS serumu ile DMEM'e toplayın.
   6. Konik tüpleri 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
   7. Süpernatantı dökerek çıkarın. Hücre peleti görünür olmalıdır. Tüpün içinde kaldığından emin olmak için izleyin.
   8. Peletlenmiş hücreleri 1 mL DMEM + %10 FBS ekleyerek ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın.
   9. Aliquot hücreleri DMEM +% 10 FBS ile uygun boyuttaki yeni doku kültürü plakalarına yeniden askıya alır (10 mL'lik bir ortam, 10 cm'lik bir doku kültürü plakası için uygundur).

3. Enjeksiyon için fibroblastlar üretin

NOT: Primer fibroblastlar çok fazla iki katına çıktıktan / pasajdan sonra yaşlanacaktır. Primer fibroblastların sınırlı sayıda pasajdan veya iki katına çıkmadan sonra kullanılması önemlidir. Fibroblastların fare veya insan derisinden büyüdüğü geçiş veya iki katına çıkma sayısını takip edin. Primer insan dermal fibroblastları için 15'ten az pasajı olan fibroblastları kullanın. Fare embriyonik fibroblastları için 9'dan az pasajlı fibroblastlar kullanın. Fibroblastlar birleştiklerinde değişirler. Fibroblastları yaklaşık% 90 birleştiklerinde tripsizleştirin. Fibroblastlar, nasıl kültürlendiklerine bağlı olarak farklı özelliklere sahip olacaktır. Birçok bilim adamı, doku benzeri ortamları daha etkili bir şekilde yakalayan 3D kollajen matrisleri gibi doku kültürü plakalarından daha fizyolojik olarak ilgili substratlar üzerinde kültürlemeyi teşvik eder^23,24,25.

1. Fibroblast hücrelerinin büyüme hızını belirlemek için bölüm 2.1'deki denklemi kullanın.
2. Fibroblastları genişletmek için gereken gün sayısını belirlemek için bölüm 2.2'deki denklemi kullanın.
3. Fibroblastları, kanser hücrelerinin ve fibroblastların aynı gün enjeksiyona hazır olmasını sağlamak için uygun günde uygun ortamı kullanarak bölüm 2.3'te açıklandığı gibi plakalayın.
4. Bölüm 2.4'te açıklanan prosedürleri takiben gerekli olan yeterli sayıda fibroblast üretmek için fibroblastları uygun ortamda genişletin.

4. Enjeksiyon için fareleri hazırlamak için fareleri tıraş edin

NOT: Farelerle çalışırken laboratuvar önlükleri, saç ağları, ayakkabı kılıfları ve eldivenler giyin.

1. Enjeksiyondan bir ila iki gün önce, Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi kurallarına uygun olarak, fareleri uyuşturun. Anestezi için izofluran kullanıyorsanız, izofluran ve_O2 karışımı kullanın. Fareleri bir anestezi odasına yerleştirin ve anesteziyi indüklemek için bir izofluran (% 5) /_O2 karışımı ekleyin. Daha sonra, anestezinin cerrahi düzlemini sabit bir izofluran (% 2) / O₂ karışımı akışıyla korumak için burun konisini anestezi altındaki hayvanın üzerine yerleştirin.
2. Farenin ayak parmağını sıkıştırarak ve farenin hareket etmediğini doğrulayarak uygun cerrahi anestezi düzleminde olduklarından emin olmak için hayvanları kontrol edin.
3. Cerrahi bıçak # 40 ile bir hayvan kesme makinesi kullanarak, kürk çıkarılana kadar hayvan kesme makinesini cildin üzerinden birkaç kez geçirerek kürkü farelerin yanlarındaki uygun konumlardan yavaşça çıkarın.
4. Anesteziden iyileşene kadar fareleri izleyin.

5. Kanser hücrelerini ve fibroblastları enjeksiyon için hazırlayın

NOT: Kanser hücreleri ve fibroblastlar toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede, tercihen 30 dakika içinde enjekte edilmelidir. Enjeksiyon sabahında, kanser hücrelerini ve fibroblastları doku kültürü plakalarından ayrı olarak toplayın. Her hücre türü için aşağıdaki adımları gerçekleştirin:

1. Ortamı doku kültürü plakasından nazik steril emme ile veya ortamdan pipetleyerek çıkarın.
2. Hücreleri bozmadan 5 mL PBS üzerine nazikçe pipetin. PBS'yi döndürün. PBS'yi emme veya pipetle PBS'den nazikçe aspire edin.
3. PBS'deki 5 mL Tripsin-EDTA'yı hücre tabakasına nazikçe pipetleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
4. Hücreleri yerinden çıkarmak için hafif dokunuşlarla plakadan hücreleri çıkarın. Hücreleri 10 mL'lik bir pipet ile birkaç kez pipet edin ve hücreleri% 10 FBS ile DMEM içeren konik bir tüpe aktarın.
5. Konik tüpleri 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
6. Süpernatantı yavaşça dökerek çıkarın, hücre topağını koruyun. Hücre peletini PBS ile iki kez yıkayın. Her seferinde, hücrelere 10 mL PBS pipetleyin. Bir p1000 pipet ile yavaşça karıştırın.
7. Hücreleri adım 5.5'teki gibi santrifüj edin. PBS'yi bir pipetle yavaşça çıkarın ve tekrarlayın.
8. Yıkanmış, peletlenmiş hücreleri 1 mL PBS'de bir p1000 ile yeniden askıya alın.
9. Bir hemositometre slaytını alkolle temizleyin ve kurutun.
10. Hücre karışımının 100 μL'sini bir tüpe pipet edin ve% 0.32'lik nihai bir Tripan mavisi konsantrasyonu için 400 μL% 0.4 Tripan mavisi ekleyin.
11. Hücre karışımını oda dolana kadar pipetleyerek kapak kapağının altındaki cam hemositometrenin odalarını nazikçe doldurun.
12. Bir mikroskop kullanarak, 10x hedefin ızgara çizgilerine odaklanın.
13. Canlı, lekesiz hücreleri ve mavi hücreleri 16 karelik bir kümede sayın.
14. 16 karelik 4 setin tümünü sayın.
15. 16 kareden oluşan 4 kümeden berrak ve mavi hücreler için hücre sayısının ortalamasını alın ve 10.000 ile çarpın. Tripan mavisinden 1:5 seyreltmeyi düzeltmek için 5 ile çarpın.
16. Son sayımlar, canlı ve ölü hücreler için hücrelerdeki konsantrasyon / mL'dir. Toplam kanser hücresi ve fibroblast sayısını belirlemek için hacimle çarpın. Canlı olan hücrelerin fraksiyonunun% >80 olduğunu doğrulayın.
17. Planlanan tüm enjeksiyonlar için yeterli sayıda melanom hücresi ve fibroblast olduğunu onaylayın, enjeksiyonlar sırasında en az% 20 örnek kaybı olduğunu varsayarsak.
18. Gerekli sayıda hücreyi yeni bir konik tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile pelet edin (5 dakika boyunca 180 x g).
19. Süpernatantı 10 mL'lik bir pipetle çıkarın.
20. Peletin gerekli konsantrasyonda uygun miktarda Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) GRADE PBS (intradermal enjeksiyon için tümör başına 50 μL ve deri altı enjeksiyonu için tümör başına 100 μL) içinde tekrar askıya alınması.

6. Kanser hücrelerini ve fibroblastları farelere enjekte edin

NOT: Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanırsa, her fareye, her bir kanatta bir tane olmak üzere iki tümör enjekte edin. Hangi farenin sağ ve sol kanatlarda hangi enjeksiyonu alacağını rastgele belirleyin. Enjekte edilecek fare sayısına bağlı olarak, fareleri uyuşturun ve kanser hücrelerini ve fibroblastları farelere gruplar halinde enjekte edin.

1. Kanser hücrelerinin deri altı enjeksiyonu için
   1. Fareleri bölüm 4.1'de açıklandığı gibi uyuşturun.
   2. Tıraş olmuş cildi alkollü çubuklarla silin.
   3. Steril bir şırıngayı istenen miktarda hücre veya hücre karışımı ile doldurun ve şırıngayı 27 gauge iğne ile kapatın.
      NOT: Hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı gerektiği gibi hareket ettirin. Hücreler şırıngaya sokulduktan sonra, kümelenmeyi önlemek için şırıngaları sürekli olarak ters çevirerek şırıngaların içindeki hücreleri iyi karıştırılmış halde tutun.
   4. İğneyi farenin yan tarafındaki deri altı bölgesine yerleştirin ve hücreleri yavaşça fareye enjekte edin. Subkutan enjeksiyon için tümör başına 100 μL hücre süspansiyonu kullanın (enjeksiyon başına 100 μL'den fazla hacim kullanılması önerilmez).
   5. Anesteziden iyileşene kadar fareleri izleyin. Gerekirse, farelerin tamamen iyileşmesine yardımcı olmak için farelere kulübeler ve / veya ısıtma pedleri gibi ekstra yalıtım malzemeleri sağlayın.
2. Kanser hücrelerinin intradermal enjeksiyonları için
   1. Fareleri bölüm 4.1'de açıklandığı gibi uyuşturun.
   2. Tıraş olmuş cildi alkollü çubuklarla silin.
   3. Steril bir şırıngayı istenen miktarda hücre veya hücre karışımı ile doldurun ve şırıngayı 27 gauge iğne ile kapatın.
      NOT: Hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı gerektiği gibi hareket ettirin. Hücreler şırıngaya sokulduktan sonra, kümelenmeyi önlemek için şırıngaları sürekli olarak ters çevirerek şırıngaların içindeki hücreleri iyi karıştırılmış halde tutun.
   4. Farenin yan tarafındaki cildin intradermal bölgesine 27 gauge bir iğne yerleştirin ve hücreleri faredeki intradermal bölgeye yavaşça enjekte edin. İntradermal enjeksiyon için tümör başına 50μL hücre süspansiyonu kullanın (enjeksiyon başına 50 μL'den fazla hacim kullanılması önerilmez).
   5. Anesteziden iyileşene kadar fareleri izleyin. Farelerin sıkıntıda olduğuna dair işaretler varsa, bir veterinere danışın. Gerekirse, farelerin tamamen iyileşmesine yardımcı olmak için farelere kulübeler ve / veya ısıtma pedleri gibi ekstra yalıtım malzemeleri sağlayın.

7. Tümör büyümesi sırasında fareleri izleyin

1. Fareleri herhangi bir ağrı veya sıkıntı belirtisi (kambur duruş, kıvranma, seslendirme, kafes boyunca uzanma, karınlarını kafes tabanının dibine bastırma veya kafesin etrafında hareket etme isteksizliği) veya apse oluşumu için günlük olarak izleyin. Farelerin sıkıntıda olduğuna dair işaretler varsa, bir veterinere danışın.
2. Tümörler oluştuktan sonra, tümör hacmini yaklaşık iki ila üç günde bir ölçün. Kaliperlerle tümör uzunluğunu (en uzun taraf) ve genişliği (uzunluğa dikey) ölçün.
   NOT: En iyi uygulamalar, verilerdeki değişkenliği azaltmak için aynı kişinin deney boyunca bu ölçümleri gerçekleştirmesidir. Ölçümler için, fareleri bölüm 4.1'de açıklandığı gibi uyuşturun
3. Tümör hacimlerini Hacim = 0.5 x (Uzunluk x Genişlik²) formülüyle hesaplayın.

8. Tümörleri toplayın ve tümör ağırlıklarını ölçün

1. Tümör büyümesi kurum Hayvan Bakımı Komitesi tarafından kurulan deneysel bir son noktaya ulaştığında fareleri ötenazi yapın. Fareleri bir odaya yerleştirin ve solunumun kesilmesinden bir dakika sonra basınçlı CO₂ ile oda havasının yavaş (dakikada% 20-30) yer değiştirmesiyle ötenazi yapın.
2. Farelerde servikal çıkık gerçekleştirin. Kemirgenleri sert, düz bir yüzeyde tutun. Kafatasının tabanındaki boynun arkasına sağlam bir kalem veya başka bir nesne yerleştirin. Kuyruğun tabanını tutan el ile geriye doğru çekerken nesne kafayı kısıtlayarak hızlı bir şekilde ileri ve aşağı itin. Palpasyonla omuriliğin koptuğunu onaylayın.
   NOT: Servikal çıkık deneyimli laboratuvar personeli tarafından yapılmalıdır.
3. Deneydeki her fare için, nefes alma, kalp atışı ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt olmadığını kontrol ederek farenin artık hayatta olmadığını doğrulayın.
4. Steril bir neşter ve cerrahi makas kullanarak, tüm tümörü fareden çıkarın. Cerrahi makas ile, tümör olmayan dokuyu tümörden kesin.
5. Tümörü analitik bir terazide tartın ve tümör ağırlığını kaydedin.

9. Tümör hacimlerinin ve tümör ağırlıklarının istatistiksel analizi

1. Her gruptaki tümör hacimlerini tekrarlanan ölçümlerle varyans analizi (ANOVA) ile karşılaştırın. Fare başına iki tümör enjekte edilmişse eşleştirilmiş analiz yapın.
2. İki kuyruklu bir test kullanarak ANOVA ile gruplar arasındaki tümör ağırlıklarını karşılaştırın. Tukey'in post-hoc testi daha sonra hangi grupların birbirinden önemli ölçüde farklı olduğunu belirlemek için kullanılabilir. Fare başına iki tümör enjekte edilmişse eşleştirilmiş analiz yapın.

Sonuçlar

A2058 insan melanom hücreleri ve primer insan dermal fibroblastları steril koşullar altında kültürlendi. Hücreler toplandı ve PBS ile üç kez yıkandı. İmmün yetmezlikli fareler (NU / J - Foxn1 çıplak suşu), yalnızca 0.25 milyon A2058 melanom hücresi ile bir kanatta deri altından enjekte edildi. Diğer kanatta, farelere 0.25 milyon A2058 melanom hücresi ve 0.75 milyon fibroblast karışımı enjekte edildi. Hücreler, bağışıklık yetmezliği olan 12 fareye enjekte e...

Tartışmalar

Şekil 1'deki deneyde, insan dermal fibroblastlarının insan A2058 melanom hücreleri ile birlikte tanıtılması, melanom hücrelerinin birlikte enjekte edilen fibroblastlar olmadan tanıtıldığından daha büyük tümörlerle sonuçlandı. Bu fark, tümör hacmine ve tümör ağırlığına bağlı olarak kolayca tespit edilebilir. Sonuçlar, kanserle ilişkili fibroblastların tümör büyümesini destekleyebileceğine dair birçok raporla tutarlıdır^5,6,7,8

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
26G Needles	Fisher Scientific	14-826-10
Alcohol swabs	Fisher Scientific	326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40	WAHL Professional	8787-450A
Athymic nude mice (NU/J)	The Jackson labs	002019	These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells	ATCC	ATCC® CRL-11147™	This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks	Fisher Scientific	14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g	Fisher Scientific	14-432-22
Countess Cell Counting Chamber	Fisher Scientific	C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	11965-118
Fetal bovine serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet	Celltreat	667210B
Sterile 5 ml serological pipet	Celltreat	229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns	Fisher Scientific	09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	15400054
Sterile tissue-culture grade PBS	Fisher Scientific	50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet	Celltreat	667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes	Genesee Scientific	25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes	Genesee Scientific	25-260
Trypan blue	Fisher Scientific	C10228