通过红外激光辅助微模式控制细胞几何

摘要

这里提出的协议使微型模式能够自动制造，使细胞形状标准化，以研究哺乳动物细胞中的细胞骨结构。这种用户友好型技术可以与市售成像系统建立，不需要标准细胞生物学实验室无法使用的专用设备。

摘要

微模式是细胞生物学界的一项既定技术，用于研究细胞隔间的形态和功能之间的联系，同时规避自然细胞与细胞变异引起的并发症。为了标准化细胞形状，细胞要么被限制在3D模具中，要么通过粘合岛控制粘合几何形状。然而，基于光刻和深紫外线蚀刻的传统微模式技术在很大程度上依赖于洁净室或专用设备。在这里，我们展示了一种红外激光辅助微模式技术（微光托邦），该技术由道尔等人修改，可通过市售成像系统方便设置。在此协议中，我们使用尼康 A1R MP+ 成像系统，通过红外 （IR） 激光器生成微缩精度的微模式，从而消融聚乙烯醇涂层盖片上的预设区域。我们采用自定义脚本，在未配备硬件自动对焦的系统中实现高效、准确的自动模式制造。我们表明，这种红外激光辅助微模式（微光托位）协议导致定义的模式，细胞只附加和采取所需的形状。此外，由于细胞形状的标准化，大量细胞的数据可以平均化。与此协议生成的模式，结合高分辨率成像和定量分析，可用于相对较高的吞吐量屏幕，以识别干扰形式和函数之间联系的分子玩家。

引言

细胞形状是组织形态形成1、细胞迁移^2、细胞增殖³和基因表达⁴等基本生物过程的关键决定因素。细胞形状的变化是由细胞细胞的动态重新排列之间的复杂平衡驱动的，细胞体的动态重新排列使等离子膜变形，外在因素，如施加在细胞上的外力，以及细胞细胞和细胞基质粘附5的几何^形状。例如，迁移间质细胞，在前沿聚合一个密集的活性蛋白网络，推动等离子膜向前推进，并创建一个宽的跛脚^皮6，而活体肌素收缩性收回细胞的狭窄尾随边缘，以分离细胞从其当前位置^7，8。破坏信号事件，导致这种特殊的细胞骨结构扰动形状和极性，并减缓细胞迁移^9。此外，上皮板弯曲在胃结石需要基于肌素的阿皮收缩，导致细胞及其邻居成为楔形^10。虽然这些研究强调了细胞形状的重要性，但细胞形状固有的异质性阻碍了确定将形态与功能联系起来的机制的努力。

为此，在过去三十年中，已经开发出许多操纵细胞形状的方法。这些方法通过用三维模具约束细胞或通过细胞外基质 （EC....

研究方案

1. 盖滑预处理

1. 准备吱吱作响的干净盖片，如沃特曼-斯托勒，1998^年25年描述。
2. 准备 1% （3-氨基丙基） 三氧硅烷 （APTMS） 溶液，并在溶液中孵育盖片 10 分钟，轻轻搅拌。确保盖片在解决方案中自由移动。
3. 用dH₂O清洗两次盖片，每次5分钟。
4. 准备 0.5% 谷氨酸 （GA） 溶液，并在摇床上将溶液中的盖片孵育 30 分钟。对于 25 个盖片，使用 50 mL 的谷氨酸醛溶液。确保盖片在解决方案中自由移动。
5. 用 dH₂O 清洗三次，每次 10 分钟。
6. 使用定制的盖片微调器旋转 30s 的干盖片。封面滑动微调器的详细描述已于^{26 日发布} ，可在线（https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/）。激活的盖片可在带分隔线的盒子中以 +4 °C 的速度存储长达一个月，以便它们彼此分开。

2. PVA 涂层

1. 将PVA（98%水解PVA，MW 98000）与dH₂O混合，以制作5.6%的解决方案。
2. 在 90 °C 的水浴中溶解混合物，并在加热时立即通过生物安全柜中的 ....

结果

通过微观模式获得的实验数据的质量在很大程度上取决于模式的质量。为了确定使用上述方法生成的图案的质量，我们首先使用反射显微镜来评估盖唇照片消融区域的形状和大小。我们发现，每个图案看起来非常类似于消融面膜，并显示清晰的板和表面，反射光均匀 （图2B）.各种形状和尺寸可以打印取决于所需的细胞骨架构，但我们使用的十字弓形状，最适合我们的目的。.......

讨论

上述结果表明，所述的 IR 激光辅助微模式（微光托管）协议提供了各种形状的可重复粘附模式，能够操作细胞形状和细胞细胞结构。虽然在显微相位法出现之前和之后都开发出许多微模式方法，但这种方法具有若干优点。首先，它不需要专业设备和清洁室，通常只在工程部门内找到。事实上，随着多光子显微镜在生物学部门越来越常见，显微光学扩展了多光子显微镜的应用，并增加了潜在的用户.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA