通过红外激光辅助微模式控制细胞几何

摘要

这里提出的协议使微型模式能够自动制造，使细胞形状标准化，以研究哺乳动物细胞中的细胞骨结构。这种用户友好型技术可以与市售成像系统建立，不需要标准细胞生物学实验室无法使用的专用设备。

摘要

微模式是细胞生物学界的一项既定技术，用于研究细胞隔间的形态和功能之间的联系，同时规避自然细胞与细胞变异引起的并发症。为了标准化细胞形状，细胞要么被限制在3D模具中，要么通过粘合岛控制粘合几何形状。然而，基于光刻和深紫外线蚀刻的传统微模式技术在很大程度上依赖于洁净室或专用设备。在这里，我们展示了一种红外激光辅助微模式技术（微光托邦），该技术由道尔等人修改，可通过市售成像系统方便设置。在此协议中，我们使用尼康 A1R MP+ 成像系统，通过红外 （IR） 激光器生成微缩精度的微模式，从而消融聚乙烯醇涂层盖片上的预设区域。我们采用自定义脚本，在未配备硬件自动对焦的系统中实现高效、准确的自动模式制造。我们表明，这种红外激光辅助微模式（微光托位）协议导致定义的模式，细胞只附加和采取所需的形状。此外，由于细胞形状的标准化，大量细胞的数据可以平均化。与此协议生成的模式，结合高分辨率成像和定量分析，可用于相对较高的吞吐量屏幕，以识别干扰形式和函数之间联系的分子玩家。

引言

细胞形状是组织形态形成1、细胞迁移^2、细胞增殖³和基因表达⁴等基本生物过程的关键决定因素。细胞形状的变化是由细胞细胞的动态重新排列之间的复杂平衡驱动的，细胞体的动态重新排列使等离子膜变形，外在因素，如施加在细胞上的外力，以及细胞细胞和细胞基质粘附5的几何^形状。例如，迁移间质细胞，在前沿聚合一个密集的活性蛋白网络，推动等离子膜向前推进，并创建一个宽的跛脚^皮6，而活体肌素收缩性收回细胞的狭窄尾随边缘，以分离细胞从其当前位置^7，8。破坏信号事件，导致这种特殊的细胞骨结构扰动形状和极性，并减缓细胞迁移^9。此外，上皮板弯曲在胃结石需要基于肌素的阿皮收缩，导致细胞及其邻居成为楔形^10。虽然这些研究强调了细胞形状的重要性，但细胞形状固有的异质性阻碍了确定将形态与功能联系起来的机制的努力。

为此，在过去三十年中，已经开发出许多操纵细胞形状的方法。这些方法通过用三维模具约束细胞或通过细胞外基质 （ECM） 蛋白质的图案沉积控制细胞几何学来达到他们的目标，这种技术称为微模式¹¹。在这里，我们将回顾一些技术，已经获得了多年来的流行。

最初作为微电子应用的方法而开创，软光刻为基础的微接触印刷已明确成为崇拜者的最爱^12。主晶圆首先通过选择性地将光层涂层硅基板的区域暴露在光照射下制造，留下图案表面^13。然后，将弹性体（如 PDMS）倒入主晶圆上，生成一个软"标记"，将 ECM 蛋白质转移到所需的基板^11、14上。一旦制造，主晶圆可用于铸造许多 PDMS 邮票，产生高可重复性的微模式¹²。然而，由于光刻过程冗长，这些模式无法轻易调整。这个过程还需要高度专业化的设备和清洁室，这些设备和洁净室通常不在生物学部门。

最近，据报道，使用深紫外线进行直接印刷是为了规避传统光刻方法带来的限制。深紫外线通过光罩定向到涂有聚L-lysine-嫁接-聚乙二醇的玻璃盖唇的选择性区域。暴露在深紫外线下的化学组在不使用感光连杆的情况下进行光转换，使 ECM 蛋白¹⁵具有结合性。缺乏感光链接器使图案盖片在室温下保持稳定超过7个月^15。这种方法避免使用洁净室和光刻设备，需要较少的专业培训。然而，对光罩的要求仍然给需要随时可用的模式变化的实验带来了巨大的障碍。

除了通过在二维表面上控制 ECM 蛋白质沉积来操纵细胞几何的方法外，其他方法还试图通过将细胞限制在 3D 微结构中来控制细胞形状。许多研究已经调整了软石版印刷为基础的方法，以产生3D，而不是2D，PDMS室，以调查在胚胎，细菌，酵母和植物^{16，17，18，19}的形状依赖生物过程。双光子聚合（2PP）还率先采用微晶硅技术，可制造出分辨率为²⁰纳米的复杂3D水凝胶脚手架。2PP依赖于双光子吸附原理，即在股骨脉冲中交付的两个光子同时被分子（在此情况下的光启动器）吸收，从而实现光聚合物²¹的局部聚合。这项技术已被大量用于打印3D脚手架，模仿人体组织的原生ECM结构，并已被证明诱导低光化学损伤细胞^22。

10年前，微型磷酸盐的首次亮相让研究人员有机会制造微型模式，同时避免无法访问和专用的设备。微光托管通过使用红外激光^23、24在活性玻璃表面涂上多乙烯醇（PVA）的选择性区域，在微米尺度上创建模式。ECM 蛋白仅附着在底层玻璃表面，而不是 PVA，然后作为生化线索，使控制扩散动力学和细胞形状。这种方法还具有优越的灵活性，因为模式可以随时实时更改。在这里，我们使用商用多光子成像系统提供微光托邦的分步协议。所述协议专为快速和自动地制造大型图案而设计。我们证明，这些模式通过限制细胞-ECM粘附的几何形状，有效地控制了细胞形状。最后，我们证明，描述的模式技术调节细胞的组织和动态。

研究方案

1. 盖滑预处理

1. 准备吱吱作响的干净盖片，如沃特曼-斯托勒，1998^年25年描述。
2. 准备 1% （3-氨基丙基） 三氧硅烷 （APTMS） 溶液，并在溶液中孵育盖片 10 分钟，轻轻搅拌。确保盖片在解决方案中自由移动。
3. 用dH₂O清洗两次盖片，每次5分钟。
4. 准备 0.5% 谷氨酸 （GA） 溶液，并在摇床上将溶液中的盖片孵育 30 分钟。对于 25 个盖片，使用 50 mL 的谷氨酸醛溶液。确保盖片在解决方案中自由移动。
5. 用 dH₂O 清洗三次，每次 10 分钟。
6. 使用定制的盖片微调器旋转 30s 的干盖片。封面滑动微调器的详细描述已于^{26 日发布} ，可在线（https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/）。激活的盖片可在带分隔线的盒子中以 +4 °C 的速度存储长达一个月，以便它们彼此分开。

2. PVA 涂层

1. 将PVA（98%水解PVA，MW 98000）与dH₂O混合，以制作5.6%的解决方案。
2. 在 90 °C 的水浴中溶解混合物，并在加热时立即通过生物安全柜中的 0.2 μm 过滤器进行过滤。如果股票溶液沉淀，则再次过滤。PVA 溶液可在室温下存储 3 个月。
3. 在 15 mL 管中，将一部分 HCl 添加到八个部分 PVA 中。小心地倒置管子几次混合。
4. 将混合溶液的 2 mL 倒入 35 mm Petri 盘中，将干净、预处理的盖片浸入液体中，注意盖片不会粘在底部。在室温下在摇床上孵化5分钟。
5. 小心地从溶液中删除盖片。使用盖片微调器旋转外套40s。同时，清洁钳子。将盖片转移到一个盒子上，并在 +4 °C 的夜间干燥。PVA 涂层盖片可存储在 +4 °C，最长达两周。

3. 配置多光子显微镜

注意:所述协议经过调整，可在直立或倒置的多光子成像系统上创建形状和大小所需的细胞粘合微模式，尤其是未配备硬件自动对焦的微观模式。因此，对于每个视场 （FOV），图案脚本消融了一个小区域，在盖片上创建一个受托标记，使用软件自动对焦将显微镜聚焦在盖片表面，并消融所需的图案。在相邻 FOV 的循环中运行此脚本可有力地创建大量微模式（5 x 5 mm 或更大），从而约束细胞形状并调节细胞内生物过程的活性。上述协议是为尼康 A1R MP+ 成像系统开发的，该系统由 NIS 元素软件控制。如果使用其他供应商的成像系统进行成型，则应根据制造商的说明调整光学配置和图案脚本。

1. 打开显微镜软件。确保"Apo LWD 25X/1.10W DIC N2"目标安装在显微镜上。
   注:此处描述的协议针对 25x/1.1 NA 浸入式目标进行了优化，但其他目标也可用于模式化。读者应该意识到，用高放大目标（例如，40倍和60倍）拍打需要更长的时间，因为它显著减少了每个FOV中消融的模式数量。低放大目标可用于图案，只要它们在整个 FOV 和激光功率上提供均匀的照明，足以消融 PVA 层。
2. 在 A1+MP GUI窗口中，将激光线设置为 750 nm。
3. 设置"图像"光学配置
   注:NIS-Elements 为用户提供了多种工具（图形界面、获取工作流程构建器 JOBS、光学配置和宏）来控制显微镜硬件。在此协议中，大多数硬件控制都是通过各种光学配置以及 ND 获取和 ND 刺激模块实现的。
   1. 在 校准 选项卡中，单击 "新光学配置"。将光学配置命名为"图像"。这是允许通过反射对盖滑进行成像的基线光学配置。将所有其他选项保留为默认选项，并选择适当的目标。
   2. 在 A1plus MP GUI 窗口中，单击 "设置" 按钮以配置此光学配置下的硬件设置。将 刺激激光 设置为 IR 刺激，将 光束分离器 （BS 20/80） 置于光路径中，将 扫描仪单元 设置为 加尔瓦诺 ，并选择合适的去扫描探测器。
   3. 在 A1+Compact GUI 窗口中，选择足以捕获盖单上小功能的扫描大小和停留时间（系统上分别为 1.1 毫秒和 1024 像素）。单击 "正常 "按钮，因此不执行线平均值或线集成。确保检查 使用 IR 激光 框。设置单向扫描以获得简单性。
      注意:如果扫描速度值得关注，则可以使用双向扫描。
   4. 在同一窗口中，调整激光功率和探测器灵敏度，以获得覆盖滑面明亮但不饱和的图像。将激光功率设置为最大功率的 3 - 5%，将探测器灵敏度（"HV"滑块）设置为 15 V 是一个很好的起点。
   5. 在 A1+扫描区域 窗口中，将 变焦 设置为 1 以捕获整个 FOV。
   6. 保存光学配置。
4. 设置"Print_Fudiciary_Marker"光学配置
   1. 复制"图像"光学配置并将其重命名为"Print_Fudiciary_Marker"。
   2. 在 A1+紧凑型 GUI 窗口中，选择最小的扫描大小和停留时间（系统上分别为 64 像素和 80.2 毫秒）。
   3. 由于此步骤不需要成像，将探测器灵敏度设置为 0，并将激光功率提高到 30%。更高的激光功率将热移除所需区域盖滑上的 PVA 层。
   4. 在 A1+扫描区域 窗口中，将 变焦 设置为最大值（系统为 15.87），并将扫描区域放置在 FOV 中间。
   5. 在 ND 采集 窗口中，设置 Z 栈实验。将 Z 位置的移动设置为 相对 ，并选择适当的 Z 设备。将步幅大小设置为 2 μm，将堆栈深度设置为上下 10 μm，以考虑显微镜阶段或相邻 FOV 之间的 PVA 表面的任何不均匀性。
5. 设置"自动对焦"光学配置
   1. 复制"图像"光学配置并将其重命名为"自动对焦"。
   2. 在 A1+扫描区域 窗口中，降低 缩放 因子，使 FOV 略大于受托标记。这可确保盖上的其他小功能不会干扰自动对焦。
   3. 在 设备 菜单中，选择 "自动对焦设置"。将扫描厚度设置为 Z 堆栈实验中的 Z 堆栈厚度（参见步骤 3.5.5）。显微镜将扫描这个范围，并找到最好的焦点平面使用信托标记。将步幅保留为默认值。
6. 设置"Load_ROI"光学配置
   1. 复制"图像"光学配置并将其重命名为"Load_ROI"。
   2. 在 A1+紧凑型 GUI 窗口中，设置扫描大小与投资回报率面膜相同的扫描大小。此光学配置将用于捕获加载 ROI 面膜的图像。我们使用 2048 像素实现了分辨率和速度之间的最佳平衡。
      注:此捕获的图像大小必须与投资回报率面膜相同。
7. 设置"微模式"光学配置
   1. 复制"Print_Fiduciary_Marker"光学配置并将其重命名为"微型模式"。
   2. 将 缩放 因子设置为一个。
   3. 在 A1plus MP GUI 窗口中，增加刺激激光功率以消融 PVA，并在实验中选择适当的扫描速度（分别为 40% 和 32 s/帧）。
   4. 在 ND刺激 窗口中，设置ND刺激实验。在 时间表 中添加几个阶段，并将每个阶段设置为 刺激。确保 刺激区域 和 持续时间 正确。
      注:相数可根据PVA层的厚度和平滑度以及此光学配置中使用的激光功率进行调整。
   5. 在同一窗口中，在每个阶段之前启用StgMoveMainZ（-1.000，1）功能。这再次解释了 Z 方向的任何偏差。
      注:可根据PVA层的厚度和平滑度调整目标移动的距离和方向。
8. 设置"Label_Surface"光学配置
   1. 复制"Print_Fudiciary_Marker"光学配置并将其重命名为"Label_Surface"。
   2. 在 A1+紧凑型 GUI 窗口中，显著增加激光功率并将 缩放 设置为一个。此处使用的高激光功率会对玻璃盖滑点造成物理损坏，并产生肉眼可见的标签。这有助于在进一步实验中定位模式。

4. 生成投资回报率面膜并设置宏

1. 生成投资回报率面膜
   1. 使用 Adobe Photoshop 或其他可用软件生成 2048 × 2048 RGB 图像。图像对应于显微镜下的 FOV（即 532.48 × 532.48 微米，每像素 0.26 微米）。图像应具有黑色 （0，0，0） 背景。
      注:许多商业和免费图像编辑器可用于生成用于激光辅助微模式的投资回报率面罩。虽然我们使用Adobe照片店生成口罩，但GIMMP和图像J/斐济也可以作为替代免费选项。
   2. 在黑色背景上绘制 8 - 12 个白色（255，255，255）图案。模式大小因细胞类型而异（直径约 200 像素）。在图像中心留下 500 × 500 空白区域，用于自动对焦。在相邻模式（>200像素）和 FOV 的寄宿者之间留出足够的空间，以实现最佳的消融和单元格连接。本协议中提出的模式可在 Github（https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）上找到。
2. 设置宏
   1. 单击 宏 菜单并选择 "新宏"。
   2. 将 Github（https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）上的"Pattern_Stimulation"代码导入新宏 窗口。将此代码保存到适当的文件夹。
   3. 打开另一个新宏窗口，导入 Github（http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）上的"Stage_Movement"代码。确保本代码中的"Stage_Movement"工作目录与步骤 4.2.2 中的目录相同。将"Stage_Movement"代码保存到步骤 4.2.2 中的同一文件夹。

5. 使用照片消融生成微模式

1. 打开显微镜及其配件。确保红新月激光在此之前已经充分预热。
2. 将 PVA 涂层盖盖滑移到支架上。对于直立显微镜，请确保 PVA 表面向下消融。
3. 将水添加到角落，以稳定盖片，并将支架安装到显微镜舞台上。
4. 降低目标，将水添加到盖滑上。
   注:此处描述的协议针对 25x/1.1 NA 浸入目标进行了优化。如果使用干燥或油浸入目标，水应替换为适当的浸入介质。当水浸入目标用于生成大型微模式阵列时，蒸发可能会成为一个问题。如果是这样的话，水应该换成GenTeal，一种从药店获得的非处方眼润滑剂。
5. 在显微镜软件中，打开 A1+MP GUI窗口中的 IR 激光快门。单击 自动对齐 按钮，在图案调整之前对齐激光。
   注意:在每个模式会话的开始时执行激光自对齐至关重要，因为激光路径上的小偏差将显著影响模式的质量。
6. 切换到"图像"光学配置。在 A1+紧凑型 GUI 窗口中，单击 扫描 扫描 FOV，同时缓慢地将目标移近盖滑。
7. 仔细监控图像。起初，图像将显得极其暗淡。将目标移近盖滑，直到图像亮度增加。这是面向目标的盖滑表面。继续移动目标，直到亮度降低并再次增加。这是要图案的 PVA 表面。专注于此表面上的任何小功能（覆盖滑动缺陷、灰尘 等），并在 Z 驱动器上设置为零。对焦后始终设置为零。
   注意:虽然盖片的两个表面都涂有 PVA，但玻璃的光学特性不会因 PVA 涂层而显著改变。我们经常用干燥、水和油浸入目标对此类盖片进行成像，并且没有发现非图案的 PVA 表面干扰成像。
8. 切换到"Label_Surface"光学配置。点击 捕获。返回"成像"光学配置并扫描。玻璃表面应损坏，并出现无定形。受损区域肉眼可见，指示图案在进一步实验中的位置。
   注意:要增加可见标签的大小，请在多个相邻的 FOV 中重复步骤 5.8。
9. 再次检查目标大致位于盖滑的中心。确保目标与盖滑之间有足够的水。将舞台移动 1 到 2 个 FOV，以避免玻璃颗粒和扫描以确认。
10. 在 设备 菜单中，打开 Stage_Movement 宏。检查 Pattern_Stimulation 工作目录是否正确:如果没有，刺激不会发生。将变量"模式长"和"模式海特"设置为将要图案的 FOV 所需的数量。保存并运行宏。
11. 图案完成后，切换到"成像"光学配置。再次检查 IR 激光快门是否在 A1+MP GUI 窗口中打开。
12. 移动舞台查看模式。扫描这些模式以检查其质量。
13. 将盖片传输到网格框，并朝上模式。
14. 在使用前一周内，在 +4 °C 下存储图案盖片。

6. 纤维素吸附

1. 使新鲜的1 M纳布₄ 在1 M NaOH解决方案。以 1:100 的比例添加到含有 0.2 M 乙醇胺的 pH 8.0 磷酸盐缓冲器。
2. 将图案盖片转移到 35 毫米组织培养盘上。用上面1mL的溶液孵化每个盖片8分钟，以淬灭自动荧光，然后用PBS冲洗3次。
3. PBS 中的稀释纤维素 （FN） 最终浓度为 10μg/mL。在 FN 中孵化盖唇 1 小时，±37 °C。
   注:如果观察到ECM蛋白与基板的实质性非特异性结合，FN可以在含有0.1%的Pluronic F-127²⁴的PBS中稀释。
4. 用PBS清洗盖子2次。如果不立即使用，请在 PBS 中存储在 +4 °C 过夜。

7. 细胞附件

注:以下协议针对主要人类金银成纤维细胞进行了优化。

1. 培养一个10厘米的细胞盘到70%的汇流。
2. 在 +37 °C 水浴中加热细胞培养介质、PBS 和 0.05% 的肌氨脂。
   注意:对于弱附着在基板上的细胞，与经文（0.48 mM EDTA）或专有无酶缓冲器的非蛋白分离可能会增加细胞对模式的依恋，应予以考虑。
3. 在播种细胞之前，将图案盖片移到含有 1 mL 暖 PBS 的干净 35 mm 组织培养盘上。
4. 从 10 厘米的组织培养盘中吸气细胞培养介质，然后用 PBS 清洗一次。
5. 将 700 μL 的 0.05% trypsin/EDTA 添加到菜中，并在 +37 °C 中孵化细胞，在 1 分钟内加入 5% CO₂ 孵化器。
6. 同时，吸气 PBS 覆盖图案盖滑，并添加 1 mL 的细胞培养介质。
7. 确认细胞已分离。然后用10mL的细胞培养介质恢复尝试型细胞，并在图案盖唇中加入1mL。
8. 培养细胞在孵化器中2-3小时，并检查是否有足够的细胞连接到模式。如果是这样，更改媒体一次，以删除未连接的单元格。这最大限度地减少了多个细胞落在同一模式上的机会。
   注意:附件时间可能因细胞类型而异。
9. 再过3-4小时，或者当足够数量的细胞在模式上扩散时，细胞已经准备好进行进一步实验。不要等待太久以避免细胞分裂。

8. 数据获取

1. 在细胞球菌缓冲器中用 4% PFA 修复细胞^， 在室温下 10 分钟。
2. 遵循为感兴趣的蛋白质建立的免疫荧光协议。PVA 涂层盖片与任何免疫荧光协议配合良好。
3. 使用适当的显微镜获取细胞图像。根据实验目标，每个 FOV 映像一个或多个单元格。

9. 图像分析

注:以下协议允许用户从显微镜图像的 Z 堆中获取感兴趣的蛋白质对大量细胞的平均荧光信号。

1. 打开 NIS 元素中获取的图像并裁剪图像。确保每个图像只包含一个分布良好的单元格。有关图像处理的详细说明，可以在下面的脚本中找到。
2. 安装蟒蛇，并通过阿纳康达导航器发射间谍。
   注:.py脚本可以在任何环境中运行，并具有要求中标识的相应包.txt。我们推荐 Anaconda，因为它包含以下代码所需的大多数包。
3. 从 Github（https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning）下载脚本，并在 Spyder 中打开（"Pattern_Averaging_3Channels.py"或"Pattern_Averaging_4Channels.py"，分别用于具有 3 个频道或 4 个频道的图像）。
4. 根据获得的图像设置参数。有关详细信息，请参阅脚本。
5. 按 F5 运行脚本。可以在控制台面板中跟踪进度。
6. 检索保存在同一文件夹中的输出文件。输出图像是所有样本每个通道的平均值。Excel 表显示了样本单元内每个通道的平均强度，从而能够进行进一步的定量分析。

结果

通过微观模式获得的实验数据的质量在很大程度上取决于模式的质量。为了确定使用上述方法生成的图案的质量，我们首先使用反射显微镜来评估盖唇照片消融区域的形状和大小。我们发现，每个图案看起来非常类似于消融面膜，并显示清晰的板和表面，反射光均匀 （图2B）.各种形状和尺寸可以打印取决于所需的细胞骨架构，但我们使用的十字弓形状，最适合我们的目的。...

讨论

上述结果表明，所述的 IR 激光辅助微模式（微光托管）协议提供了各种形状的可重复粘附模式，能够操作细胞形状和细胞细胞结构。虽然在显微相位法出现之前和之后都开发出许多微模式方法，但这种方法具有若干优点。首先，它不需要专业设备和清洁室，通常只在工程部门内找到。事实上，随着多光子显微镜在生物学部门越来越常见，显微光学扩展了多光子显微镜的应用，并增加了潜在的用户...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA