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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

这里提出的协议使微型模式能够自动制造,使细胞形状标准化,以研究哺乳动物细胞中的细胞骨结构。这种用户友好型技术可以与市售成像系统建立,不需要标准细胞生物学实验室无法使用的专用设备。

Abstract

微模式是细胞生物学界的一项既定技术,用于研究细胞隔间的形态和功能之间的联系,同时规避自然细胞与细胞变异引起的并发症。为了标准化细胞形状,细胞要么被限制在3D模具中,要么通过粘合岛控制粘合几何形状。然而,基于光刻和深紫外线蚀刻的传统微模式技术在很大程度上依赖于洁净室或专用设备。在这里,我们展示了一种红外激光辅助微模式技术(微光托邦),该技术由道尔等人修改,可通过市售成像系统方便设置。在此协议中,我们使用尼康 A1R MP+ 成像系统,通过红外 (IR) 激光器生成微缩精度的微模式,从而消融聚乙烯醇涂层盖片上的预设区域。我们采用自定义脚本,在未配备硬件自动对焦的系统中实现高效、准确的自动模式制造。我们表明,这种红外激光辅助微模式(微光托位)协议导致定义的模式,细胞只附加和采取所需的形状。此外,由于细胞形状的标准化,大量细胞的数据可以平均化。与此协议生成的模式,结合高分辨率成像和定量分析,可用于相对较高的吞吐量屏幕,以识别干扰形式和函数之间联系的分子玩家。

Introduction

细胞形状是组织形态形成1、细胞迁移2、细胞增殖3和基因表达4等基本生物过程的关键决定因素。细胞形状的变化是由细胞细胞的动态重新排列之间的复杂平衡驱动的,细胞体的动态重新排列使等离子膜变形,外在因素,如施加在细胞上的外力,以及细胞细胞和细胞基质粘附5的几何形状。例如,迁移间质细胞,在前沿聚合一个密集的活性蛋白网络,推动等离子膜向前推进,并创建一个宽的跛脚皮6,而活体肌素收缩性收回细胞的狭窄尾随边缘,以分离细胞从其当前位置7,8。破坏信号事件,导致这种特殊的细胞骨结构扰动形状和极性,并减缓细胞迁移9。此外,上皮板弯曲在胃结石需要基于肌素的阿皮收缩,导致细胞及其邻居成为楔形10。虽然这些研究强调了细胞形状的重要性,但细胞形状固有的异质性阻碍了确定将形态与功能联系起来的机制的努力。

为此,在过去三十年中,已经开发出许多操纵细胞形状的方法。这些方法通过用三维模具约束细胞或通过细胞外基质 (EC....

Protocol

1. 盖滑预处理

  1. 准备吱吱作响的干净盖片,如沃特曼-斯托勒,1998年25年描述。
  2. 准备 1% (3-氨基丙基) 三氧硅烷 (APTMS) 溶液,并在溶液中孵育盖片 10 分钟,轻轻搅拌。确保盖片在解决方案中自由移动。
  3. 用dH2O清洗两次盖片,每次5分钟。
  4. 准备 0.5% 谷氨酸 (GA) 溶液,并在摇床上将溶液中的盖片孵育 30 分钟。对于 25 个盖片,使用 50 mL 的谷?.......

Representative Results

通过微观模式获得的实验数据的质量在很大程度上取决于模式的质量。为了确定使用上述方法生成的图案的质量,我们首先使用反射显微镜来评估盖唇照片消融区域的形状和大小。我们发现,每个图案看起来非常类似于消融面膜,并显示清晰的板和表面,反射光均匀 (图2B).各种形状和尺寸可以打印取决于所需的细胞骨架构,但我们使用的十字弓形状,最适合我们的目的。.......

Discussion

上述结果表明,所述的 IR 激光辅助微模式(微光托管)协议提供了各种形状的可重复粘附模式,能够操作细胞形状和细胞细胞结构。虽然在显微相位法出现之前和之后都开发出许多微模式方法,但这种方法具有若干优点。首先,它不需要专业设备和清洁室,通常只在工程部门内找到。事实上,随着多光子显微镜在生物学部门越来越常见,显微光学扩展了多光子显微镜的应用,并增加了潜在的用户.......

Acknowledgements

这项工作得到了康诺特基金新调查员奖、加拿大创新基金会、NSERC发现赠款计划(授予RGPIN-2015-05114和RGPIN-2020-05881)、曼彻斯特大学和多伦多大学联合研究基金和多伦多大学XSeed项目的支持。C.T. 得到了国家人权委员会USRA研究金的支持。

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilaneAldrich281778
10 cm Cell Culture DishVWR10062-880Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping ObjectiveNikonMRD77225
3.5 cm Cell Culture DishVWR10861-586Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)Thermo622481mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine AlbuminBioShopALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineWisent311-425-CL
EthanolamineSigma-AldrichE9508
FibronectinSigma-AldrichFC0101mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin AntibodyBD610077Mouse
FijiImageJVersion 1.53c
Fluorescent PhalloidinInvitrogenA12380568nm
Glass CoverslipVWR16004-30222 × 22 mm
GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences1622025% aqueous solution
Hydrochloric AcidCaledon6025-1-2937% aqueous solution
IR LaserCoherentChameleon Vision
Minimal Essential Medium αGibco12561-056
Mounting MediumSigmaF4680
Mouse Secondary AntibodyCell Signaling Technology4408SGoat, 488nm
Multi-Photon MicroscopeNikonA1R MP+
Myosin Light Chain AntibodyCell Signaling Technology3672SRabbit
NIS ElementsNikonVersion 5.21.03
Nitric AcidCaledon7525-1-2970% aqueous solution
PhotoshopAdobeVersion 21.2.1
Pluronic F-127SigmaP2443Powder
Poly(vinyl alchohol)Aldrich341584MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary AntibodyCell Signaling Technology4412SGoat, 488nm
ShakerVWR10127-876Alsoknown as analog rocker
Sodium BorohydrideAldrich452882Powder
Sodium HydroxideSigma-AldrichS8045
Sodium Phosphate DibasicSigmaS5136Powder
Sodium Phosphate MonobasicSigmaS5011Powder
SpyderAnaconda4.1.4
TrypsinWisent325-042-CL0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA

References

  1. Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
  2. Keren, K., et al.

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