Kontroll av cellgeometri genom infraröd laserassisterad mikropappersbehandling

Summary

Protokollet som presenteras här möjliggör automatiserad tillverkning av mikromönster som standardiserar cellform för att studera cytoskeletala strukturer inom däggdjursceller. Denna användarvänliga teknik kan ställas in med kommersiellt tillgängliga bildsystem och kräver inte specialiserad utrustning som är otillgänglig för vanliga cellbiologiska laboratorier.

Abstract

Micropatterning är en etablerad teknik i cellbiologigemenskapen som används för att studera samband mellan morfologi och funktion av cellulära fack samtidigt som komplikationer som härrör från naturliga cell-till-cell variationer kringgås. För att standardisera cellformen är cellerna antingen begränsade i 3D-formar eller kontrollerade för självhäftande geometri genom självhäftande öar. Traditionella mikropapperstekniker baserade på fotolitografi och djup UV-etsning beror dock starkt på rena rum eller specialiserad utrustning. Här presenterar vi en infraröd laserassisterad mikropappersteknik (microphotopatterning) modifierad från Doyle et al. som bekvämt kan ställas in med kommersiellt tillgängliga bildsystem. I detta protokoll använder vi ett Nikon A1R MP + bildsystem för att generera mikromönster med mikronprecision genom en infraröd (IR) laser som brinner förinställda regioner på poly-vinyl alkoholbelagda täcken. Vi använder ett anpassat skript för att möjliggöra automatiserad mönstertillverkning med hög effektivitet och noggrannhet i system som inte är utrustade med en automatisk fokusering av hårdvara. Vi visar att detta IR-laserassisterade mikropappersprotokoll (microphotopatterning) resulterar i definierade mönster som celler fäster uteslutande och tar önskad form. Dessutom kan data från ett stort antal celler medelvärdesförst på grund av standardiseringen av cellformen. Mönster som genereras med detta protokoll, kombinerat med högupplöst bildbehandling och kvantitativ analys, kan användas för relativt höga data flödes skärmar för att identifiera molekylära spelare som förmedlar länken mellan form och funktion.

Introduction

Cellform är en viktig determinant för grundläggande biologiska processer som vävnadsmorfogenes¹, cellmigration², cellproliferation³, och genuttryck⁴. Förändringar i cellformen drivs av en invecklad balans mellan dynamiska omorganiseringar av cytoskelettet som deformerar plasmamembranet och extrinsiska faktorer som yttre krafter som utövas på cellen och geometrin hos cellcells- och cellmatrisandhesioner⁵. Migrerande mesenkymala celler, till exempel, polymeriserar ett tätt aktinnätverk i framkant som driver plasmamembranet framåt och skapar en bred lam....

Protocol

1. Förbearbetning av coverlip

1. Förbered squeaky-clean coverlips enligt beskrivningen i Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Förbered 1% (3-aminopropyl)trimetoxisilanlösning (APTMS) och inkubera täckglasen i lösningen i 10 minuter med mild agitation. Se till att täckglasen rör sig fritt i lösningen.
3. Tvätta täcken två gånger med dH₂O i 5 min vardera.
4. Förbered 0,5% glutaraldehydlösning (GA) och inkubera täckglasen i lösningen i 30 minuter på en .......

Discussion

Resultaten ovan visar att det beskrivna IR-laserassisterade mikropatterning (microphotopatterning) protokollet ger reproducerbara vidhäftande mönster av olika former som möjliggör manipulering av cellform och cytoskeletal arkitektur. Även om många mikropappersmetoder har utvecklats både före och efter debuten av mikrofotopatterning, har denna metod flera fördelar. För det första kräver det inte specialiserad utrustning och renrum som vanligtvis bara finns inom tekniska avdelningar. Faktum är att eftersom mul.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA