* これらの著者は同等に貢献しました
本研究では、マイクロアレイ技術によって得られたDNAメチル化データを管理するワークフローについて説明する。このプロトコルは、サンプル調製からデータ分析までの手順を示しています。すべての手順が詳細に説明されており、ビデオは重要な手順を示しています。
肥満は生活習慣に直接関連しており、脂肪生成および脂質貯蔵プロセスの変化を引き起こす可能性のあるDNAメチル化変化と関連しており、疾患の発症に寄与する。我々は、肥満の有無にかかわらず、患者の選択からエピジェネティックなデータ分析までの完全なプロトコルを実証する。プロトコルのすべてのステップは、パイロットスタディでテストおよび検証されました。32人の女性がこの研究に参加し、15人がボディマス指数(BMI)(45.1 ± 5.4kg/m2)に従って肥満に分類された。17人がBMIに従って肥満なしに分類された(22.6±1.8kg/m2)。肥満の群では、脂肪量に関連する564のCpGサイトが線形回帰分析によって同定された。CpGサイトはプロモーター領域にあった。鑑別解析では、肥満患者において470のCpGs低メチル化部位と94の高メチル化部位が見つかった。最も低メチル化された濃縮経路は、 RUNX、 WNT シグナル伝達、および低酸素症に対する応答であった。高メチル化経路は、インスリン分泌、グルカゴンシグナル伝達、およびCa2+に関連していた。我々は、このプロトコルがDNAメチル化パターンおよび形質関連DNAメチル化を効果的に同定したと結論付ける。これらのパターンは、脂肪生成および脂質貯蔵に影響を及ぼす遺伝子発現の変化と関連している可能性がある。その結果、肥満のライフスタイルがヒトDNAのエピジェネティックな変化を促進する可能性があることが確認されました。
大規模なオミックス技術は、慢性疾患の研究においてますます使用されている。これらの方法の興味深い特徴は、生成された大量のデータが科学コミュニティに利用可能であることです。したがって、研究間の技術的比較を可能にするためにプロトコルを標準化する要求が生じている。本研究は、DNAメチル化データを取得および分析するためのプロトコルの標準化を、適用された例としてパイロット研究を用いて示唆している。
負のエネルギー消費は現代人のライフスタイルにおいて優勢であり、脂肪組織の過剰な蓄積をもたらし、その結果、肥満の発症につながる¹。座りがちな食事、高カロリーの食事、ストレスの多いルーチンなど、多くの要因が肥満率を高めています。世界保健機関(WHO)は、2016年に19億人の成人が肥満であったと推定しており、これは世界人口の20%以上が30kg/m2以上のBMI2を有することを意味します。2018年の最新の更新では、米国(USA)における肥満の有病率が42%よりも高いことが明らかになりました3。
エピジェネティクスとは、染色体領域の構造的適応であり、変化した活性状態を登録、シグナル伝達、または永続化させるものです4。DNAメチル化は、シトシン-グアノシンジヌクレオチド部位(CpGサイト)における可逆的な化学変化であり、5-メチルシトシン-pG(5mCpG)を形成する。 DNA5,6,7,8への転写機構へのアクセスを調節することによって遺伝子発現を調節することができる。この文脈では、どのCpGサイトが肥満関連形質と関連しているかを理解することが不可欠です9。多くの因子が部位特異的DNAメチル化を支持または防止することができる。このプロセスに必要な酵素、例えばDNAメチルトランスフェラーゼ10(DNTM)やテン-イレブン転座(TET)は、環境暴露下でDNAメチル化または脱メチル化を促進することができます11。
ここ数年のDNAメチル化研究への関心の高まりを考えると、各質問に正確に答えるために最も適切な分析戦略を選択することは、研究者の本質的な関心事でした12,13,14。450K DNAメチル化アレイは最も一般的な方法であり、DNAメチル化プロファイルを決定するために360以上の出版物14で使用されています。既知の遺伝子の99%に位置する最大485,000 CpGのメチル化を決定することができます15。ただし、このアレイは廃止され、850,000のCpGサイトをカバーするEPICに置き換えられました。本プロトコルは、450KおよびEPIC16,17,18の両方に適用することができる。
このプロトコルは、 図1 に段階的に示されており、集団選択、サンプリング、実験準備、DNAメチル化パイプライン、およびバイオインフォマティクス分析のステップで構成されています。私たちの研究室で行われたパイロット研究は、提案されたプロトコルのステップを説明するためにここで実証されています。
図 1: 提示されたプロトコルの概略。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
サンパウロ大学リベイラオン・プレト医科大学病院(HCRP-USP)の倫理委員会は、この研究を承認した(CAAE:14275319.7.0000.5440)。参加者は同意書に署名し、すべての手続きはヘルシンキ宣言に従って行われました。
1. 母集団とサンプリング
2. 人体測定と体組成
表1:人口特性 すべての変数はパラメトリック(p > 0.05、Shapiro Wilk)であり、p< 0.05が有意であると考えられる独立t検定を使用して差を評価しました。*p < 0.0001 です。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
3. 生物材料の収集
4. DNA抽出
5. メチル化分析前の準備
6. DNAメチル化パイプライン
注:DNAメチル化実験は4日間に分かれています(図1)。製造元の推奨事項と仕様に従って、正確な結果を得てください。
7. バイオインフォマティクス解析
注:マイクロアレイの種類のいくつかの属性を変更する必要があります(例えば、アレイタイプ= "450k"はアレイタイプ= "EPIC"に置き換える必要があります)。ChAMPパイプラインの著者は、パッケージのバイオコンダクターページでアレイを分析するために変更する必要があるすべてのフィールドを詳細に説明しています30。
ChAMPパイプラインを使用した後、すべてのフィルタ(非修飾CpG、非CGプローブ、SNP付近のCpG、マルチヒットサイト、およびXYに関連するCpG)の後に、409,887個のプローブが分析で考慮されました。スキームを 図2に表す。
図 2: バイオインフォマティクス解析のパイプライン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
さらに、密度プロットは、すべてのサンプルが品質管理ステップに関連するベータ分布の密度が類似していることを明らかにした。この分析では、ベータ値の分布を評価し、除外する必要があるサンプルがあるかどうかを指摘します。このバッチでは、この分析に基づいてサンプルは除外されませんでした。
図 3: ChAMP パッケージで得られたベータ値密度プロット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
特異値分解(SVD)分析を使用して、DNAメチル化データの変動性に大きく影響する主成分を検証しました。このデータから、BMI、WC(p<1e10-5)、およびFM(p<0.05)がデータの変動性に有意な影響を与えることが明らかになりました(図4)。
図 4: 特異値分解解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
細胞型推定により、ナチュラルキラー細胞(NK)とB細胞の両方が肥満女性で高いことが明らかになった(図5)。
図5:ハウスマンの方法で推定された細胞画分。顆粒:顆粒球。 CD4T:ヘルパーT細胞、リンパ球。CD8T:細胞傷害性T細胞、リンパ球。モノ:単球。B細胞:Bリンパ球。NK:ナチュラルキラー細胞、リンパ球。*p < 0.05 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
肥満女性と非肥満女性との間のDNAメチル化レベルは、細胞型矯正の前後で異なっていた。細胞型に対するDNAメチル化データ補正の前に、43,463の差次メチル化位置(DMP)が観察され、3,329個のCpGsがその後も有意なままであった。445のCpGサイトが遺伝子間領域(IGR)にあり、2,884が遺伝子領域にあり、ほとんどがプロモーター領域にあった(n = 1,438)。すべての領域に沿った分布は、TSS1500(n = 612)、TSS200(n = 826)、5'UTR(n = 390)、第1エクソン(n = 273)、本体(n = 724)、および3'UTR(n = 59)であった。Δβ値<-0.05および>0.05を考慮すると、非肥満者と比較して、肥満では162個のCpGsが低メチル化され、576個が高メチル化されていた(図6)。データは、GEOデータベースでレジスタコードGSE166611で入手できます。
図 6: メチル化された位置の違い。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
グループ間の異なるメチル化を評価し、メチル化研究において特定の形質に関連するCpGサイトを見出すことが可能である。脂肪量研究のために、13,222のCpGサイトが見出された。プロモーター領域の6,159個のCpGsは脂肪量に関係しており、470個の高メチル化および94個の低メチル化があり(図7)、それぞれの遺伝子が富化していた(表2)。
図7:脂肪量と独立して関連する低メチル化遺伝子と高メチル化遺伝子のプロモーター領域。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表2:差次メチル化CpGサイトからの遺伝子の機能的富化。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
DNAメチル化アレイは、その費用対効果比のためにDNAメチル化にアクセスするために最も使用される方法です14。本研究は、ブラジルのコホートで実施されたパイロット研究においてDNAメチル化を評価するために市販のマイクロアレイプラットフォームを用いた詳細なプロトコールを記載した。パイロット研究から得られた結果は、プロトコルの有効性を確認した。 図3 は、サンプル比較可能性および完全な亜硫酸水素塩変換32を示す。
品質管理ステップとして、ChAMP アルゴリズムはフィルタリング プロセス中に CpGs サイトを除外することを推奨しました。プローブを除外する目的は、データ分析を改善し、バイアスを排除することです。低品質のCpGs(p値は0.05未満)は、データセット内の実験ノイズを除去するために削除されました。ターゲットは密度プロット分析で渡されたままでした。Zhou33は 、ミスマッチ、多型シトシンのメチル化の誤解、およびI型プローブ設計のスイッチカラーを引き起こすことを避けるために、SNPsの近くのCpGsをフィルタリングすることの重要性を説明しました34。また、XY染色体はインプリンティングによって差次的に影響を受けるため、HeissとJust35 は、女性ではハイブリダイゼーションの問題が交絡因子である可能性があるため、これらのプローブをフィルタリングすることの重要性を強化しました35。
DMAPsの有効期限、ホルムアミドの開封日、無水エタノールの分析品質、および総白血球数は、プロトコルにおける重要なステップとみなされます。
さらに、我々の観察によると、バイオインフォマティクス解析を行う上では、細胞型推定が不可欠です。ハウスマン法は、Tianの研究30に記載されているように細胞型推定を行う。この方法は、顆粒球、単球、B細胞、T細胞などの最も重要な細胞型の割合を予測できる473の特定のCpGサイトに基づいています36。ChAMP パッケージから推奨されている関数 "myRefbase" を使用しました。推定後、ChAMP アルゴリズムはベータ値を調整し、データセットからこのバイアスを除去します。このステップは、この集団が慢性炎症状態のために白血球にかなりの違いを有するため、肥満に焦点を当てた研究において重要である。
メソッドの変更とトラブルシューティングに関して、一般的なPCRシールの元のキャップマップのみを変更しました。各遠心分離プロセスの後、シールを新しいものに交換した。標準のヒートシールは使えず、板の周りのアルミホイルで対応しました。
市販のアッセイはエピジェネティック研究のゴールドスタンダードと考えられてきましたが、プロトコルの限界の1つは、独自のブランドの試薬および機器の特異性である可能性があります37,38,39,40。別の制限は、実験41の正しい進行の同定を可能にする指標の欠如である。
本プロトコールの標準化は、エピジェネティック研究の優れた指針であり、プロセス中のヒューマンエラーを減らし、異なる研究間のデータ分析と比較可能性を成功に導きます。
我々の結果によると、DNAメチル化実験は肥満の有無を比較する研究に適しています43。また、提案されたバイオインフォマティクス解析は、質の高いデータを提供し、大規模な研究で検討することができます。
SVD分析を用いて、肥満関連形質(BMI、WC、FM)がDNAメチル化データの変動性に影響することを同定した。有意な結果として、細胞型推定は、ナチュラルキラー細胞(NK)およびB細胞の両方が肥満の女性において肥満のない女性よりも高かったことを示している(図5)。これらの細胞の数が多いことは、これらの個体の低悪性度の炎症状態によって説明できる44。我々は、肥満患者が脂肪量に関連する遺伝子のプロモーター領域に低メチル化および高メチル化CpGを有することを観察した。ほとんどの部位は低メチル化されており、これはこれらの個体における活性酸素種(ROS)レベルの自然な増加に関連している可能性がある。この酸化ストレス状態は、ジヌクレオチド部位におけるグアニン摂動を促進し、8−ヒドロキシ−2'−デオキシグアノシン(8−OHdG)を形成し、5mCp−8−OHdGジヌクレオチド部位を生じさせ、TET酵素の動員を引き起こす可能性がある。これらすべての事象は、異なる作用機序によるDNAの低メチル化および高メチル化の促進に関与している可能性がある45。
さらに、脂肪形成の割合は肥満の個体で増加するようであり、新しい細胞の約10%が古い細胞に46,47。肥満環境を強調するエピジェネティックな貢献は、細胞の増殖および分化速度を変化させ、脂肪塊の発達を促進する可能性がある48。エピジェネティックな変化はまた、脂肪生成プログラムに影響を与え、その発達を促進または制限し得る。一次転写因子(PPARγまたはC/EBPα)または多タンパク質複合体の集合体は、エピジェネティック修飾酵素を含むかまたは除外することによって操作される下流プロモーター領域に位置し、超メチル化または低メチル化を介して遺伝子発現を調節する45。PPARγ経路は、この研究で富化された遺伝子を有するWNT経路を変化させることが以前に記載されていた。脂肪形成中にWNTシグナル伝達がどのように起こるかはまだ不明であるが、最近の研究では、特に肥満条件下で脂肪細胞代謝に不可欠な役割を果たす可能性があることが報告されている49。
この記事の著者は、利益相反がなく、宣言する財務上の開示もありません。
Yuan Tian博士(tian.yuan@ucl.ac.uk)がChAMPパッケージに関するすべての疑問に答えてくれたことに感謝します。我々はまた、この論文の技術的および科学的問題の両方に対するギリェルメ・テレス氏への貢献に感謝する。彼はエピジェネティクスとビデオのキャプチャとフォーマット技術(guilherme.telles@usp.br)に関して重要な検討をしました。消耗品の資金調達:サンパウロ研究財団(FAPESP)(#2018/24069-3)および国家科学技術開発評議会(CNPq:#408292/2018-0)。個人的な資金:(FAPESP:#2014/16740-6)および高等教育スタッフ開発のための調整からのアカデミックエクセレンスプログラム(CAPES:88882.180020/2018-01)。データは、制限なく公開され、自由に利用できるようになります。NYN(電子メール:nataliayumi@usp.br)またはCBN(電子メール:carla@fmrp.usp.br)へのアドレス対応。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Absolute ethanol | J.T. Baker | B5924-03 | |
Agarose gel | Kasvi | K9-9100 | |
Electric bioimpedance | Quantum BIA 450 Q - RJL System | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-000-CI | |
EZ DNA Methylation-Gold kit | ZymoResearch, Irvine, CA, USA | D5001 | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
FMS—Fragmentation solution | Illumina | 11203428 | Supplied Reagents |
HumanMethylation450 BeadChip | Illumina | ||
Maxwell Instrument | Promega, Brazil | AS4500 | |
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix | Illumina | 11202880 | Supplied Reagents |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 201703982 | |
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix | Illumina | 11203410 | Supplied Reagents |
NaOH | F. MAIA | 114700 | |
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization | Illumina | 11291245 | Supplied Reagents |
PB2—Humidifying buffer used during hybridization | Illumina | 11191130 | Supplied Reagents |
2-propanol | Emsure | 10,96,34,01,000 | |
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution | Illumina | 11292441 | Supplied Reagents |
RPM—Random Primer Mix | Illumina | 15010230 | Supplied Reagents |
STM—Superior Two-Color Master Mix | Illumina | 11288046 | Supplied Reagents |
TEM—Two-Color Extension Master Mix | Illumina | 11208309 | Supplied Reagents |
Ultrapure EDTA | Invitrogen | 155576-028 | |
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | ByoSystems | 4346906 | |
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL) | Thermo Fisher Scientific | AB-0859 | |
XC1—XStain BeadChip solution 1 | Illumina | 11208288 | Supplied Reagents |
XC2—XStain BeadChip solution 2 | Illumina | 11208296 | Supplied Reagents |
XC3—XStain BeadChip solution 3 | Illumina | 11208392 | Supplied Reagents |
XC4—XStain BeadChip solution 4 | Illumina | 11208430 | Supplied Reagents |
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