DNAメチル化のバイオインフォマティクス分析へのサンプル調製:肥満および関連形質研究の関連戦略

要約

本研究では、マイクロアレイ技術によって得られたDNAメチル化データを管理するワークフローについて説明する。このプロトコルは、サンプル調製からデータ分析までの手順を示しています。すべての手順が詳細に説明されており、ビデオは重要な手順を示しています。

要約

肥満は生活習慣に直接関連しており、脂肪生成および脂質貯蔵プロセスの変化を引き起こす可能性のあるDNAメチル化変化と関連しており、疾患の発症に寄与する。我々は、肥満の有無にかかわらず、患者の選択からエピジェネティックなデータ分析までの完全なプロトコルを実証する。プロトコルのすべてのステップは、パイロットスタディでテストおよび検証されました。32人の女性がこの研究に参加し、15人がボディマス指数(BMI)(45.1 ± 5.4kg/^m2)に従って肥満に分類された。17人がBMIに従って肥満なしに分類された(22.6±1.8kg/^m2)。肥満の群では、脂肪量に関連する564のCpGサイトが線形回帰分析によって同定された。CpGサイトはプロモーター領域にあった。鑑別解析では、肥満患者において470のCpGs低メチル化部位と94の高メチル化部位が見つかった。最も低メチル化された濃縮経路は、 RUNX、 WNT シグナル伝達、および低酸素症に対する応答であった。高メチル化経路は、インスリン分泌、グルカゴンシグナル伝達、および^Ca2+に関連していた。我々は、このプロトコルがDNAメチル化パターンおよび形質関連DNAメチル化を効果的に同定したと結論付ける。これらのパターンは、脂肪生成および脂質貯蔵に影響を及ぼす遺伝子発現の変化と関連している可能性がある。その結果、肥満のライフスタイルがヒトDNAのエピジェネティックな変化を促進する可能性があることが確認されました。

概要

大規模なオミックス技術は、慢性疾患の研究においてますます使用されている。これらの方法の興味深い特徴は、生成された大量のデータが科学コミュニティに利用可能であることです。したがって、研究間の技術的比較を可能にするためにプロトコルを標準化する要求が生じている。本研究は、DNAメチル化データを取得および分析するためのプロトコルの標準化を、適用された例としてパイロット研究を用いて示唆している。

負のエネルギー消費は現代人のライフスタイルにおいて優勢であり、脂肪組織の過剰な蓄積をもたらし、その結果、肥満の発症につながる¹。座りがちな食事、高カロリーの食事、ストレスの多いルーチンなど、多くの要因が肥満率を高めています。世界保健機関(WHO)は、2016年に19億人の成人が肥満であったと推定しており、これは世界人口の20%以上が30kg/^{m2以上のBMI2}を有することを意味します。2018年の最新の更新では、米国(USA)における肥満の有病率が42%よりも高いことが明らかになりました³。

エピジェネティクスとは、染色体領域の構造的適応であり、変化した活性状態を登録、シグナル伝達、または永続化させる^{ものです4}。DNAメチル化は、シトシン-グアノシンジヌクレオチド部位(CpGサイト)における可逆的な化学変化であり、5-メチルシトシン-pG(5mCpG)を形成する。 DNA5,6,7,8への転写機構へのアクセスを調節することによって遺伝子発現を調節することができる。この文脈では、どのCpGサイトが肥満関連形質と関連しているかを理解することが不可欠です⁹。多くの因子が部位特異的DNAメチル化を支持または防止することができる。このプロセスに必要な酵素、例えばDNAメチルトランスフェラーゼ¹⁰(DNTM)やテン-イレブン転座(TET)は、環境暴露下でDNAメチル化または脱メチル化を促進することができます¹¹。

ここ数年のDNAメチル化研究への関心の高まりを考えると、各質問に正確に答えるために最も適切な分析戦略を選択することは、研究者の本質的な関心事でした^12,13,14。450K DNAメチル化アレイは最も一般的な方法であり、DNAメチル化プロファイルを決定するために360以上の出版物¹⁴で使用されています。既知の遺伝子の99%に位置する最大485,000 CpGのメチル化を決定することができます¹⁵。ただし、このアレイは廃止され、850,000のCpGサイトをカバーするEPICに置き換えられました。本プロトコルは、450Kおよび^EPIC16,17,18の両方に適用することができる。

このプロトコルは、 図1 に段階的に示されており、集団選択、サンプリング、実験準備、DNAメチル化パイプライン、およびバイオインフォマティクス分析のステップで構成されています。私たちの研究室で行われたパイロット研究は、提案されたプロトコルのステップを説明するためにここで実証されています。

図 1: 提示されたプロトコルの概略。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

サンパウロ大学リベイラオン・プレト医科大学病院(HCRP-USP)の倫理委員会は、この研究を承認した(CAAE:14275319.7.0000.5440)。参加者は同意書に署名し、すべての手続きはヘルシンキ宣言に従って行われました。

1. 母集団とサンプリング

1. BMI>30kg/^m2の参加者を本試験のために募集する。本研究のために、混合集団¹⁹から¹⁸〜60歳の32人の女性が募集された。
   注:HCRP-USPでは、主に女性で肥満率の上昇が観察されました²⁰。肥満の参加者は、BMI ≥30kg/^m2(n = 15)で、HCRP-USPの代謝性疾患外来診療所から募集された。肥満のない参加者は、BMIが18.5kg/m2〜24.9kg/^m2(n = 17)で、他の診療所から募集され、重篤な疾患を有さなかった。臨床データを表1に示す。
2. 妊娠中の女性、授乳中の母親、喫煙者、アルコールを消費する女性を除外する。

2. 人体測定と体組成

1. 200kgのデジタル人体測定スケールを使用して参加者の体重を測定します。靴や余分な衣服を必ず脱いでください。
2. 0.5cmの目盛りが付いたスタディオメーターを使用して身長を評価します。参加者は,裸足で立ち,両足を合わせ,両脇に腕を組むように指示されました²¹。
3. 電気生体インピーダンスを使用して脂肪量(FM)情報を収集します。12時間の絶食後、空の膀胱で評価する。参加者を仰臥位に置き、脚を離し、腕を体に触れずに平行にします。すべての金属製の付属品を取り外すよう参加者に指示^する22。
4. 0.1mmの目盛りが付いた伸縮性のない測定テープを使用して、腰囲(WC)を取得します。テープは、腰の骨のすぐ上、中腰の周りに水平に置かれました。測定は息を吐いた直後に行われました。疾病管理予防センター(CDC)によると、女性のトイレカットオフは^88cm23です。

表1:人口特性 すべての変数はパラメトリック(p > 0.05、Shapiro Wilk)であり、p< 0.05が有意であると考えられる独立t検定を使用して差を評価しました。*p < 0.0001 です。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

3. 生物材料の収集

1. 前述のように、12時間の絶食後に末梢血を採取する²⁴。
2. 抗凝固剤(EDTAなど)を含む採取チューブに全血サンプル4mLを採取し、輸送のために氷上に保管する。

4. DNA抽出

1. 血液を入れた各チューブを2,000 x g で10分間遠心分離する。約300μLのバフィーコート(白色中間相)を集める。
2. 市販の器具( 材料表を参照)を用いて末梢血からDNAを抽出し、前述のように²⁵。480 μLの超高純度_H2O中のDNAを溶出する。
3. 蛍光光度計を使用してDNA濃度と品質を評価します。完全性を、1%アガロースゲル分析^{を用いて評価した25}。-80°Cの冷凍庫に保管してください。

5. メチル化分析前の準備

1. サンプルの最小 DNA 濃度 (開始に理想的な初期入力は 500 ng) であることを確認しますが、このステップでは希釈率がサンプル間で異なる場合があります。
2. マイクロアレイキット²⁶に含まれていない試薬もあるため、別途購入してください²⁷。
3. キットに手順中に使用されたすべての試薬が含まれているかどうかを確認します。彼らはかけがえのないものです。すべての試薬の有効期限を確認してください。キットに付属していない他の試薬および溶液も入手可能であることを確認してください(95%ホルムアミド/ 1mM EDTA、0.1N NaOH、無水エタノール、2-プロパノール)。
   警告: ホルムアミドは揮発性試薬です。製品が新鮮であれば、結果の品質を向上させることができます。ホルムアミドおよび無水エタノールの完全性と品質は、製造業者によって提案された染色プロセスに影響を与える可能性があるため、重要であると考えられています。選択されたアルコールは、分子生物学分析に特有の超高純度製品でなければならない。
4. マイクロアレイキットを入手したら、チップデコードマップ(DMAP)をダウンロードします。これらのファイルは、キットの出荷後24~48時間で製造元のWebサイトで入手でき、有効期限²⁸日に除外されます。上記のファイルをダウンロードするには、次の手順に従います。
   1. インターネットにアクセスできるコンピュータが利用可能であることを確認します。ソフトウェアデコードファイルクライアントを使用してダウンロードを実行します。
   2. プログラムをインストールする前に、コンピュータにインスティテューションによって許可されたアウトバウンドおよびインバウンドアクセスがあることを確認してください。デコードファイルクライアントにはセキュリティ制限がありません。
   3. BeadChip によるアクセスオプションを使用して、デコードファイルクライアントソフトウェアにログインします。このログインは、MyIlluminaユーザーIDとパスワードを使用して実行されます。このページの登録が必要です²⁸。
   4. デコードファイルクライアントにログインした後、ソフトウェアのホームページ²⁸:バーコードのリストのそれぞれのフィールドに以下の情報を入力します。ボックスIDのリスト。発注書番号 (PO);と販売注文番号 (数字に続く文字を含めないでください)。
   5. 購入ボックスのバーコード番号に従ってダウンロードする DMAP を選択し、ダイアログボックスで保存先を指定して DMAP を保存します。
   6. ボタンをクリックしてダウンロードを開始します。
      注:ダウンロードの最後に、ダウンロードしたフォルダが空でないことを確認し、実験を強度データファイル(IDATファイル)に変換する最後のステップで必要になるため、ファイルを安全に保存してください。有効期限が過ぎると、イルミナはDMAPデータをオンラインデータベースから削除することがあります。

6. DNAメチル化パイプライン

注:DNAメチル化実験は4日間に分かれています(図1)。製造元の推奨事項と仕様に従って、正確な結果を得てください。

1. 1日目:亜硫酸水素塩処理
   1. まず、500ngのゲノムDNAを変性させ、次いで変換試薬を加える。この手順を実行するには、バイサルファイトおよびマイクロアレイキット²⁹の推奨事項に従ってください。
   2. 変性DNAを130μLのバイサルファイト変換試薬で製造元から提供された標準濃度で処理する。
   3. チューブをサーモサイクラーで16サイクル、95°Cで30秒間、50°Cで1時間インキュベートします。サーモサイクラーを4°Cまで10分間ランプダウンします。
   4. 洗浄バッファーを100 μL加え、全速力で30秒間遠心分離して洗浄工程を行います。濃度はユーザーガイドには記載されておらず、メーカーは容量を標準化しています。
      注:この試薬はキットに付属しており、希釈または調製する必要はありません。
2. 2日目:増幅 - メチル化アッセイ、手動プロトコル
   1. ハイブリダイゼーションオーブンを37°Cに予熱し、温度を平衡化させる。
   2. バーコードラベルを0.8 mLマイクロプレートに貼り付けます。
   3. 増幅試薬(マルチサンプル増幅ミックス1、ランダムプライマーミックス、およびマルチサンプルアンプマスターミックス)を室温で解凍します(これらの試薬はキットに付属しており、希釈または調製する必要はありません)。次に、チューブの内容物全体が混合されるまで、少なくとも10倍の穏やかな反転を行います。
   4. マルチサンプル増幅ミックス1(MA1)20 μLをプレートのウェルに分注します。
   5. 4 μL の DNA サンプルをバイサルファイト変換プレートから 0.8 mL プレート上の対応するウェルに移します。この時点で、プレートウェルに対応するラボ追跡フォームに元のDNAサンプルのIDを記録します。
   6. マルチサンプル増幅ミックス1(MA1)およびDNAサンプルを含むプレートの各ウェルに4 μLの0.1 N NaOHを分注する。
   7. プレートをプラスチックシールでシールします。
   8. プレートを渦巻き、試薬とサンプルを1,600rpmで1分間混合する。室温で10分間インキュベートし、シールを慎重に取り外します。
   9. 68 μLのランダムプライマーミックス(RPM)をプレートの各ウェルにピペットします。75 μLのマルチサンプルアンプマスターミックス(MSM)をプレートの各ウェルにピペット(前の溶液を除去せずに)。プレートを覆うために新しいシールを使用してください。
      注:ウェルとプレートを結合し、正しく向きを変えるように注意してください。
   10. 密閉板を1,600rpmで1分間渦巻きます。ハイブリダイゼーションオーブン中で、37°Cで20〜24時間インキュベートする。
3. 3日目:ハイブリダイゼーション - メチル化アッセイ、手動プロトコル
   1. ブロックを37°Cに予熱する。
   2. チューブの内容物を室温で解凍する。フラグメンテーション溶液(FMS)チューブを少なくとも10倍に慎重に静かに反転させて、内容物を完全に混合します。
   3. プレートをハイブリダイゼーションオーブンから慎重に取り出します。プレートを280 x gでパルス遠心分離します。
   4. 次に、プレートからシールを外します。サンプルを含むプレートの各ウェルに、50 μLのフラグメンテーション溶液(FMS)を加え、プレートを再び密封します。プレートを 1,600 rpm で 1 分間渦巻きます。
   5. プレートを280 x g で数秒間遠心分離します(パルス遠心分離を行います)。次いで、密閉板を加熱ブロック上に置き、37°Cで1時間反応させた。
   6. 実験を一時停止してプレートを凍結することに決めた場合は、室温で解凍し、280 x gで遠心分離 します。フリーズしていない場合は、この手順をスキップして手順 6.3.7 に進みます。
   7. 加熱ブロックを放置して37°Cに予熱する。
   8. 洗浄バッファーを放置して室温で解凍します。解凍したら、少なくとも10倍に反転させて内容物を混ぜます。
   9. プレートからシールを外します。
   10. サンプルを含むプレートの各ウェルに100 μLの沈殿溶液(PM1)を加える。
   11. プレートをシールで再度シールします。
   12. プレートを 1,600 rpm で 1 分間渦巻きます。
   13. 37°Cで5分間インキュベートする。
   14. 次いで、パルス遠心分離機に280 x g で1分間置く。
       メモ:次のステップのために遠心分離機を4°Cに設定してください。
   15. プレートからシールを慎重に取り外して廃棄してください。
   16. サンプルを含む各ウェルに300μLの2-プロパノール(100%)を加える。
   17. 新しいシールを使用して、細心の注意を払ってプレートをシールします。お皿を振らないように注意してください。
   18. プレートを少なくとも10倍に反転させ、内容物全体を混合する。
   19. 4°Cで30分間インキュベートする。
   20. 3,000 x g で4°Cで20分間遠心分離する。
       メモ: ステップ 6.3.20 の最後に、遠心分離機プレートを直ちに取り外します。
   21. プレートからシールを外して廃棄します。
   22. プレートをすばやく反転させ、パッド上の液体を排出して上清を捨てます。次に、ペーパータオルの乾燥した部分にプレートを叩いて、液体を排出します。
   23. 1分間、またはすべてのウェルに液体がなくなるまで、数回しっかりとタップします。
   24. プレートを反転させ、室温で1時間覆い隠します。
       注:井戸の底に青いペレットが見えると予想されます。
   25. ハイブリダイゼーションオーブンを48°Cに予熱する。
   26. ヒートブロックをオンにして予熱します。このプロセスには 20 分かかります。
   27. 再懸濁液を解凍し、ハイブリダイゼーションし、溶液を室温で洗浄する。少なくとも10倍に反転します。溶液中に塩が沈殿していないことを確認します。
   28. 46 μL の再懸濁液、ハイブリダイゼーション、および洗浄溶液 (RA1) をプレートの各ウェルに加えます。
       注:残りの試薬は、染色およびハイブリダイゼーションステップのために予約する必要があります。
   29. プレートにシールを貼ります。プレートを覆うためにアルミニウムシールを使用してください。しっかりと保持して、シーリングを均等に実行します。
   30. 蒸発を避けるために、すべての井戸が安全に閉じられているかどうかを確認します。
   31. 新しく密封したプレートをハイブリダイゼーションオーブンに慎重に置き、48°Cで1時間インキュベートする。
   32. プレートを 1,800 rpm で 1 分間渦巻きます。
   33. 280 x gのパルス遠心分離機。
   34. プレートを95°Cで1時間ヒートブロックに移す。
   35. ハイブリダイゼーション(Hyb)チャンバーを一緒に配置して準備します。400 μL の加湿バッファー (PB2) を Hyb チャンバーのリザーバーに分注します。すぐに蓋をしてください。
   36. 各サンプルをプレートからマイクロアレイのサンプルエントリ開口部にロードします。
   37. マイクロアレイを含むHybチャンバーインサートをHybチャンバーにロードします。ハイブチャンバーを横方向に閉じて、ハイブチャンバーがずれないようにします。
       注:Hybチャンバーは、48°Cで少なくとも16時間、24時間以内でインキュベートする必要があります。
4. 4日目:染色 - メチル化アッセイ、手動プロトコル
   1. 染色溶液4を330mLの100%EtOHで再懸濁し、350mLの最終容量を得る。染色液4ボトルを激しく振って、完全に再懸濁することを確認します。室温で保管してください。
      注:染色溶液4は、2°C〜8°Cの温度で最大2週間保存することができます。
   2. ハイブリダイゼーションオーブンからチャンバーを取り出し、ベンチで30分間冷却してから開く。
   3. Hyb チャンバーが冷却されている間、2 つの洗浄容器に洗浄バッファー (洗浄容器あたり 200 mL) を充填します。各容器に「洗浄バッファー」(PB1およびPB2)のラベルを付けることを忘れないでください。
   4. マイクロアレイアライメントアクセサリーに150 mLのウォッシュバッファーを充填します。
   5. プラスチック製のスペーサーを分離し、必要に応じてガラスを清掃します。
   6. マイクロアレイスライドを洗浄するには、ワイヤループをグリッドに取り付け、滴下装置を200mLの洗浄バッファーで容器に浸漬し、合計10倍にします。
   7. ハイブリダイゼーションチャンバーからすべてのインサートを取り外し、各アレイをインサートから取り外します。シールを外します。
      メモ: 取り外し中は、露出したマトリックスに触れないでください。
   8. マイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションチャンバーから取り外す際は、何もこぼさないように注意してください。
   9. マイクロアレイを洗浄バッファー(PB1)溶液でゆっくりと軽く洗浄し、上下に10倍に動かします。新鮮なPB1溶液に移動し、溶液中でマイクロアレイを10xずつゆっくりと上下に動かして洗浄を行う。
   10. マイクロアレイを容器から取り出し、残留物がないことを確認します。
   11. 各マイクロアレイの上部にある透明なスペーサーを使用し、スペーサーを対応する位置に導きます。
       メモ: 透明なスペーサーのみを使用し、白いスペーサーは使用しないでください。
   12. 位置合わせバーを位置合わせアクセサリの上に置きます。
   13. 透明なスペーサーの上部にガラスのバックプレートを置きます。マイクロアレイ全体を覆うように注意してください。次に、フローチャンバに金属クランプを取り付けます。必要に応じて、はさみを使用してフローチャンバースペーサーの端をトリミングします。
   14. 直ちに_ddH2Oを使用してハイブリダイゼーションチャンバーリザーバを洗浄し、小さな洗浄ブラシでスクラブします。加湿バッファーを貯水池に残さないでください。
   15. マイクロアレイの拡張と染色を担当する次のステップに進みます。
       メモ:すべてのフローチャンバを実験室ベンチに水平に取り付けたままにしておきます。染色ステップ全体の準備ができたら、それらを再処理してください。再懸濁液、ハイブリダイゼーション、および洗浄溶液を20°C〜25°Cの温度に加熱する。 溶液中に結晶が見えなくなるまで穏やかに混合する。
   16. 試薬をラックに順番に置きます。凍結している場合は、室温で放置してから、少なくとも10倍に反転させて溶液を混合します。
   17. 水循環器を適切なレベルまで満たします。
   18. ポンプの電源を入れ、温度を44°Cに設定します。
   19. チャンバー・ラックに取り付けられている気泡をすべて取り除きます。
   20. 温度プローブを使用してチャンバーラックでテストを実行します。すべての試験場所は、44 °C ~ 0.5 °C の間±必要があります。
       メモ: 次の手順は、中断することなく実行する必要があります。
   21. ラックの温度が 44 °C に達したら、各アセンブリーをフロー・チャンバーに素早く配置します。
       注:次の手順では、すべての試薬を背面ガラスプレートにピペットでピペットします。
   22. ピペット150 μLの再懸濁、ハイブリダイゼーション、および洗浄溶液(RA1)。その後、30分間インキュベートする。この手順を合計 5 回繰り返します。
   23. 染色液1(XC1)450 μLをピペットに入れ、10分間インキュベートした。
   24. 450 μLの染色液2(XC2)をピペットに入れ、10分間インキュベートした。
   25. 200 μLの2色エクステンションマスターミックス(TEM)をピペットに入れ、15分間インキュベートします。
   26. 95%ホルムアミド/1 mM EDTAのピペット450 μLを1分間インキュベートします。
   27. 5分間インキュベートする。
   28. チャンバーラックの温度を32°C(スーペリア2色マスターミックスに表示)まで下げます。
   29. 450 μLの染色液3(XC3)をピペットに入れ、1分間インキュベートします。
   30. チャンバー内のラックが正しい温度に達するまで待ちます。
       メモ:カラーリング処理の直後にマイクロアレイ画像を読み取るには、この段階でスキャナの電源を入れてください。
   31. 次に、250 μL のスーペリア 2 色マスター ミックス (STM) を分注し、その後 10 分間インキュベーションします。
   32. 次いで、450μLの染色液3(XC3)を分注し、続いて1分間インキュベートした。1xを繰り返します。
   33. 5分間待ってから、250μLのアンチステイン2カラーマスターミックス(ATM)を加え、10分間インキュベートします。
   34. 次に、250 μL のスーペリア 2 色マスター ミックス (STM) を分注し、その後 10 分間インキュベーションします。
   35. 次いで、450μLの染色液3(XC3)を分注し、続いて1分間インキュベートした。1xを繰り返します。
   36. 5分間待ちます。
   37. 250 μL のアンチステイン 2 カラーマスターミックス (ATM) を加え、10 分間インキュベートします。
   38. 450 μLのステインマイクロアレイ溶液3(XC3)を加え、1分間インキュベートした後、再度繰り返します。
   39. 5分間待ちます。
       メモ: 次の繰り返し方式を実行します: ステップ 6.4.34、ステップ 6.4.35。ステップ6.4.36.;ステップ 6.4.37、6.4.38、およびステップ 6.4.39.;ステップ 6.4.34、ステップ 6.4.35、およびステップ 6.4.36。
   40. 次に、フローチャンバをラックから直ちに取り外し、実験室ベンチに水平に慎重に置きます。温度が周囲であることを確認します。
   41. 6.4.41.各マイクロアレイの洗浄液(PB1)310mLを洗浄容器に入れる。
   42. 金属製のクランプとガラス、最後にマイクロアレイを取り外します。
   43. マイクロアレイを染色ラックの上に置き、10x PB1溶液を入れた洗浄容器に入れます。バーコードが誰からも遠ざかり、すべてのマイクロアレイが水没していることを確認します。
   44. 上下の動きを10倍にしてゆっくりと軽く動かします。マイクロアレイは、再び水没する前に溶液から完全に除去されるべきである。その後、5分間水没したままにします。
   45. 染色液4(XC4)試薬を激しく振とうし、完全な再懸濁を確実にする。310mLのXC4を洗浄容器に入れる。
       注:溶液を洗浄容器に10分以上入れないでください。
   46. 染色スタンドをXC4で他の容器に軽く動かします。
   47. 上下の動きを10倍にしてゆっくりと軽く動かします。マイクロアレイが再び水没する前に、溶液から完全に取り外されていることを確認してください。
   48. その後、マイクロアレイを5分間沈めたままにします。
   49. 染色された目玉を溶液から取り出し、バーコードを上に向けてチューブホルダーに入れます。
   50. ロック鉗子を使用してマイクロアレイを慎重に取り外し、棚に置いて乾燥させます。
   51. 真空デシケーターを使用して、675 mm Hg(0.9 bar)で50〜55分間乾燥させます。
   52. EtOHを使用して各マイクロアレイの背面をクリーニングします。
       警告: ストライプには触れないでください。また、EtOH がストライプに滴り落ちないようにしてください。
   53. マイクロアレイのイメージ化に進みます。
   54. マイクロアレイを室温で保管ボックスに慎重に保管してください。
       メモ: マイクロアレイ画像は 72 時間以内に撮影する必要があります。

7. バイオインフォマティクス解析

注:マイクロアレイの種類のいくつかの属性を変更する必要があります(例えば、アレイタイプ= "450k"はアレイタイプ= "EPIC"に置き換える必要があります)。ChAMPパイプラインの著者は、パッケージのバイオコンダクターページでアレイを分析するために変更する必要があるすべてのフィールドを詳細に説明しています³⁰。

1. サンプルシート
   1. IDATファイルをコンピュータに転送して、バイオインフォマティクス解析を続行^します31。データ解析³¹を実行するためのサンプルシートを作成する。
      メモ: このスプレッドシートファイルには 3 つの列が不可欠です。1つ目はSample_nameです。この列には、サンプルを識別するために使用される名前またはコードを含める必要があります。2つ目はSentrix_positionです。この列はサンプルの対応するR01C01を配置し、R01はチップ行を担当し、列はC01と呼ばれます。3番目の必須列はSentrix_IDであり、マイクロアレイを識別する番号を受け取る役割を担います。必ず正しい数字を入れてください。サンプルシートに他の情報を変数値として追加することができます。なお、本実験には、金属分析からのデータが含まれていた。
2. チャンプパイプライン
   1. RStudio (V.4.0.2) をコンピューターにインストールして、分析を実行します³⁰。
      メモ: コンピュータに 8 G 以上の RAM が搭載されていることを確認します。データ分析は、より少ない量のRAMで苦労したりクラッシュしたりします。
   2. インストール後、RStudioを開き、それぞれのコマンドラインを使用してChAMPバイオコンダクターパッケージ³⁰ をインストールします( 補足資料1を参照)。
      メモ: インストールの最後にエラーが発生した場合は、必要な ChAMP ライブラリを 1 つずつ手動でインストール^します26。
   3. 次に、生データをインポートし、分析を実行します。 補足資料1を参照してください。
      champ.load() は生データをインポートし、検出率の低い pval を持つプローブ、マルチヒットサイト、非 CG プローブ、SNP に近い CpG サイト、および性染色体に位置する CpG を除くフィルタリング処理を行います。
      champ.impute() はデフォルトとして KNN 代入を実行します。
      チャンプ。QC は、データ品質グラフ(例えば、密度プロットグラフ)を取得する。
      チャンプ。SVD は、サンプル シートに用意されたメタデータに基づいてバッチ効果を評価します。
      champ.refbase() は、セル・タイプの推定と訂正を実行します。
      チャンプ。DMP( ) は、 補足資料1に示すように、差次メチル化された位置と脂肪量などの形質関連を取得して、グループ間のDNAメチル化を確認し、パラメータを変更します。
3. エンリッチメント (文字列 DB)
   注:機能的富化は、一連の遺伝子の生物学的機能を推測するために使用される。
   1. 文字列内のデータを強化するには、情報付加して入力として使用するターゲットのリストを選択します。https://string-db.org/cgi/input?sessionId=bywt5Gl8Bawy&input_page_active_form
      =multiple_identifiers
   2. 生物の場合は、ホモサピエンスを選択し、検索ボタンを押します。
   3. エンリッチメント内を移動するには、[分析] ボタンをクリックします。
4. GEOの提出
   1. NCBIのGEOのようなパブリックリポジトリにデータをデポジットします。このためには、提出者アカウントに登録してください。
      注: 実験全体と個々のサンプルの説明情報とプロトコルを含むメタデータ シートをダウンロードして、GEO の提出 (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/) を完了します。GEOアーカイブの提出は、任意のスプレッドシートソフトウェアで作成できます。次に、すべてのライブラリのセルレンジャーカウントスクリプトから生成された生データファイルをディレクトリに追加します。IDAT および関連ファイルまたはマトリックス ワークシートには、正規化されていないデータが含まれています。3 番目のフォルダーは、処理されたデータ ファイルです。マトリックステーブルは、行およびサンプル間で比較可能な最終的な正規化された値を含むスプレッドシートであり、好ましくは、付随する原稿に記述されているように処理される。
   2. すべてのライブラリーのセル・レンジャー・カウント・スクリプトから生成された処理済みデータ・ファイルをディレクトリーに入れます。GEO 送信者の FTP サーバー資格情報を使用して、3 つのコンポーネントすべてを含むディレクトリを転送します。

結果

ChAMPパイプラインを使用した後、すべてのフィルタ(非修飾CpG、非CGプローブ、SNP付近のCpG、マルチヒットサイト、およびXYに関連するCpG)の後に、409,887個のプローブが分析で考慮されました。スキームを 図2に表す。

図 2: バイオインフォマティクス解析のパイプライン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

さらに、密度プロットは、すべてのサンプルが品質管理ステップに関連するベータ分布の密度が類似していることを明らかにした。この分析では、ベータ値の分布を評価し、除外する必要があるサンプルがあるかどうかを指摘します。このバッチでは、この分析に基づいてサンプルは除外されませんでした。

図 3: ChAMP パッケージで得られたベータ値密度プロット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

特異値分解(SVD)分析を使用して、DNAメチル化データの変動性に大きく影響する主成分を検証しました。このデータから、BMI、WC(p<1e10-5)、およびFM(p<0.05)がデータの変動性に有意な影響を与えることが明らかになりました(図4)。

図 4: 特異値分解解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞型推定により、ナチュラルキラー細胞(NK)とB細胞の両方が肥満女性で高いことが明らかになった(図5)。

図5:ハウスマンの方法で推定された細胞画分。顆粒:顆粒球。 CD4T:ヘルパーT細胞、リンパ球。CD8T:細胞傷害性T細胞、リンパ球。モノ:単球。B細胞:Bリンパ球。NK:ナチュラルキラー細胞、リンパ球。*p < 0.05 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

肥満女性と非肥満女性との間のDNAメチル化レベルは、細胞型矯正の前後で異なっていた。細胞型に対するDNAメチル化データ補正の前に、43,463の差次メチル化位置(DMP)が観察され、3,329個のCpGsがその後も有意なままであった。445のCpGサイトが遺伝子間領域(IGR)にあり、2,884が遺伝子領域にあり、ほとんどがプロモーター領域にあった(n = 1,438)。すべての領域に沿った分布は、TSS1500(n = 612)、TSS200(n = 826)、5'UTR(n = 390)、第1エクソン(n = 273)、本体(n = 724)、および3'UTR(n = 59)であった。Δβ値<-0.05および>0.05を考慮すると、非肥満者と比較して、肥満では162個のCpGsが低メチル化され、576個が高メチル化されていた(図6)。データは、GEOデータベースでレジスタコードGSE166611で入手できます。

図 6: メチル化された位置の違い。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

グループ間の異なるメチル化を評価し、メチル化研究において特定の形質に関連するCpGサイトを見出すことが可能である。脂肪量研究のために、13,222のCpGサイトが見出された。プロモーター領域の6,159個のCpGsは脂肪量に関係しており、470個の高メチル化および94個の低メチル化があり(図7)、それぞれの遺伝子が富化していた(表2)。

図7:脂肪量と独立して関連する低メチル化遺伝子と高メチル化遺伝子のプロモーター領域。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表2:差次メチル化CpGサイトからの遺伝子の機能的富化。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足資料1:このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

DNAメチル化アレイは、その費用対効果比のためにDNAメチル化にアクセスするために最も使用される方法です¹⁴。本研究は、ブラジルのコホートで実施されたパイロット研究においてDNAメチル化を評価するために市販のマイクロアレイプラットフォームを用いた詳細なプロトコールを記載した。パイロット研究から得られた結果は、プロトコルの有効性を確認した。 図3 は、サンプル比較可能性および完全な亜硫酸水素塩変換³²を示す。

品質管理ステップとして、ChAMP アルゴリズムはフィルタリング プロセス中に CpGs サイトを除外することを推奨しました。プローブを除外する目的は、データ分析を改善し、バイアスを排除することです。低品質のCpGs(p値は0.05未満)は、データセット内の実験ノイズを除去するために削除されました。ターゲットは密度プロット分析で渡されたままでした。^Zhou33は 、ミスマッチ、多型シトシンのメチル化の誤解、およびI型プローブ設計のスイッチカラーを引き起こすことを避けるために、SNPsの近くのCpGsをフィルタリングすることの重要性を説明しました³⁴。また、XY染色体はインプリンティングによって差次的に影響を受けるため、Heissと^Just35 は、女性ではハイブリダイゼーションの問題が交絡因子である可能性があるため、これらのプローブをフィルタリングすることの重要性を強化しました³⁵。

DMAPsの有効期限、ホルムアミドの開封日、無水エタノールの分析品質、および総白血球数は、プロトコルにおける重要なステップとみなされます。

さらに、我々の観察によると、バイオインフォマティクス解析を行う上では、細胞型推定が不可欠です。ハウスマン法は、Tianの研究³⁰に記載されているように細胞型推定を行う。この方法は、顆粒球、単球、B細胞、T細胞などの最も重要な細胞型の割合を予測できる473の特定のCpGサイトに基づいています³⁶。ChAMP パッケージから推奨されている関数 "myRefbase" を使用しました。推定後、ChAMP アルゴリズムはベータ値を調整し、データセットからこのバイアスを除去します。このステップは、この集団が慢性炎症状態のために白血球にかなりの違いを有するため、肥満に焦点を当てた研究において重要である。

メソッドの変更とトラブルシューティングに関して、一般的なPCRシールの元のキャップマップのみを変更しました。各遠心分離プロセスの後、シールを新しいものに交換した。標準のヒートシールは使えず、板の周りのアルミホイルで対応しました。

市販のアッセイはエピジェネティック研究のゴールドスタンダードと考えられてきましたが、プロトコルの限界の1つは、独自のブランドの試薬および機器の特異性である可能性があります^37,38,39,40。別の制限は、実験⁴¹の正しい進行の同定を可能にする指標の欠如である。

本プロトコールの標準化は、エピジェネティック研究の優れた指針であり、プロセス中のヒューマンエラーを減らし、異なる研究間のデータ分析と比較可能性を成功に導きます。

我々の結果によると、DNAメチル化実験は肥満の有無を比較する研究に適しています⁴³。また、提案されたバイオインフォマティクス解析は、質の高いデータを提供し、大規模な研究で検討することができます。

SVD分析を用いて、肥満関連形質(BMI、WC、FM)がDNAメチル化データの変動性に影響することを同定した。有意な結果として、細胞型推定は、ナチュラルキラー細胞(NK)およびB細胞の両方が肥満の女性において肥満のない女性よりも高かったことを示している(図5)。これらの細胞の数が多いことは、これらの個体の低悪性度の炎症状態によって説明できる⁴⁴。我々は、肥満患者が脂肪量に関連する遺伝子のプロモーター領域に低メチル化および高メチル化CpGを有することを観察した。ほとんどの部位は低メチル化されており、これはこれらの個体における活性酸素種(ROS)レベルの自然な増加に関連している可能性がある。この酸化ストレス状態は、ジヌクレオチド部位におけるグアニン摂動を促進し、8−ヒドロキシ−2'−デオキシグアノシン(8−OHdG)を形成し、5mCp−8−OHdGジヌクレオチド部位を生じさせ、TET酵素の動員を引き起こす可能性がある。これらすべての事象は、異なる作用機序によるDNAの低メチル化および高メチル化の促進に関与している可能性がある⁴⁵。

さらに、脂肪形成の割合は肥満の個体で増加するようであり、新しい細胞の約10%が古い細胞に^46,47。肥満環境を強調するエピジェネティックな貢献は、細胞の増殖および分化速度を変化させ、脂肪塊の発達を促進する可能性がある⁴⁸。エピジェネティックな変化はまた、脂肪生成プログラムに影響を与え、その発達を促進または制限し得る。一次転写因子(PPARγまたはC/EBPα)または多タンパク質複合体の集合体は、エピジェネティック修飾酵素を含むかまたは除外することによって操作される下流プロモーター領域に位置し、超メチル化または低メチル化を介して遺伝子発現を調節する⁴⁵。PPARγ経路は、この研究で富化された遺伝子を有するWNT経路を変化させることが以前に記載されていた。脂肪形成中にWNTシグナル伝達がどのように起こるかはまだ不明であるが、最近の研究では、特に肥満条件下で脂肪細胞代謝に不可欠な役割を果たす可能性があることが報告されている⁴⁹。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	J.T. Baker	B5924-03
Agarose gel	Kasvi	K9-9100
Electric bioimpedance	Quantum BIA 450 Q - RJL System
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Corning	46-000-CI
EZ DNA Methylation-Gold kit	ZymoResearch, Irvine, CA, USA	D5001
Formamide	Sigma	F9037
FMS—Fragmentation solution	Illumina	11203428	Supplied Reagents
HumanMethylation450 BeadChip	Illumina
Maxwell Instrument	Promega, Brazil	AS4500
MA1—Multi-Sample Amplification 1 Mix	Illumina	11202880	Supplied Reagents
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	201703982
MSM—Multi-Sample Amplification Master Mix	Illumina	11203410	Supplied Reagents
NaOH	F. MAIA	114700
PB1—Reagent used to prepare BeadChips for hybridization	Illumina	11291245	Supplied Reagents
PB2—Humidifying buffer used during hybridization	Illumina	11191130	Supplied Reagents
2-propanol	Emsure	10,96,34,01,000
RA1—Resuspension, hybridization, and wash solution	Illumina	11292441	Supplied Reagents
RPM—Random Primer Mix	Illumina	15010230	Supplied Reagents
STM—Superior Two-Color Master Mix	Illumina	11288046	Supplied Reagents
TEM—Two-Color Extension Master Mix	Illumina	11208309	Supplied Reagents
Ultrapure EDTA	Invitrogen	155576-028
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1mL)	ByoSystems	4346906
96-Well Reaction Plate with Barcode (0.8mL)	Thermo Fisher Scientific	AB-0859
XC1—XStain BeadChip solution 1	Illumina	11208288	Supplied Reagents
XC2—XStain BeadChip solution 2	Illumina	11208296	Supplied Reagents
XC3—XStain BeadChip solution 3	Illumina	11208392	Supplied Reagents
XC4—XStain BeadChip solution 4	Illumina	11208430	Supplied Reagents