穿梭盒测定作为使用成人斑马鱼进行学习和记忆研究认知评估的关联学习工具

摘要

学习和记忆是研究发育、疾病依赖或环境诱发的认知障碍的有力指标。大多数认知评估都需要专门的设备和广泛的时间承诺。然而，穿梭箱检测是一种关联学习工具，利用传统的凝胶盒快速可靠的评估成人斑马鱼认知。

摘要

认知缺陷，包括学习和记忆受损，是各种发育和年龄相关的神经退行性疾病和创伤性脑损伤（TBI）的主要症状。斑马鱼是一个重要的神经科学模型，由于它们在发育过程中的透明度和神经创伤后强大的再生能力。虽然斑马鱼存在各种认知测试，但大多数认知评估都是快速检查非关联性学习的。同时，关联学习分析通常需要多日或数周。在这里，我们描述了一个快速的关联学习测试，它利用了不利的刺激（电击），并且需要最少的准备时间。这里介绍的穿梭箱检测简单，非常适合新手调查员，并且需要最少的设备。我们证明，在TBI之后，这个穿梭盒测试可以重复评估认知缺陷和从年轻到老斑马鱼的恢复。此外，检测适应性强，可检查即时或延迟内存。我们证明，单个 TBI 和重复的 TBI 事件都会对学习和即时记忆产生负面影响，但不会延迟记忆。因此，我们的结论是，穿梭盒检测可重复跟踪认知障碍的进展和恢复。

引言

学习和记忆经常被用作认知障碍的指标，这些障碍是由于衰老、神经退行性疾病或损伤造成的。创伤性脑损伤 （TBIs） 是导致认知缺陷的最常见损伤。TBI越来越受到关注，因为它们与几个神经退行性疾病有关，如前脑痴呆症和帕金森病^1，2。此外，在一些TBI患者中观察到的β-淀粉样蛋白聚合增加表明，它可能也与阿尔茨海默病^3，4的发展有关。TBI通常是钝力创伤的结果，跨越一系列的^分离5，轻度脑损伤（miTBI）是最常见的。然而，miTBI往往没有报告和误诊，因为它们只导致轻微的认知障碍很短的时间，受伤的人通常完全恢复^6。相比之下，反复发生的miTBI事件越来越受到关注，因为它在年轻人和中年人中非常普遍，可以随着时间的推移积累^7，会损害认知发展，并加剧神经退行性疾病1，2，3，4，5，类似于经历中度或重度TBI⁸的人。

斑马鱼（Danio rerio）是探索神经科学中各种主题的有用模型，包括在整个中枢神经系统^{9、10、11、12、13}中重建丢失或受损神经元的能力。神经再生也表现在脑脊膜中，它包含在正交内区域的原型。这个神经解剖区域类似于海马，可能是在鱼类和人类^14，15，16的短时间记忆的认知所必需的。此外，斑马鱼的行为已被广泛的特点和编目^17。学习已经通过各种技术，包括习惯到惊人的反应^18，它可以代表一种快速形式的非关联学习时，执行短块和注意快速衰变时间^19。更复杂的关联学习测试，如T盒，加迷宫，和视觉歧视^20，21使用^，但往往很费时，需要几天或几周的准备，并依靠浅滩或积极的强化。在这里，我们描述了一个快速的范式来评估关联学习以及即时或延迟记忆。这种穿梭盒检测使用逆向刺激和负强化调理来评估钝力TBI之后的认知缺陷和恢复。我们证明，未受损的控制成年斑马鱼（8-24个月）可重复学习避免在航天飞机箱中的20个试验（<20分钟的评估）内闯红灯，观察者之间高度一致。此外，使用穿梭盒，我们证明成人（8-24 个月大）的学习和记忆能力是一致的，并且对于在不同的 TBI 分离或重复 TBI 之间具有显著障碍的怀疑认知是有用的。此外，这种方法可以迅速用作衡量标准，以跟踪影响成人斑马鱼认知维持或恢复的药物干预措施的各种疾病进展或疗效。

在这里，我们提供了快速认知评估的教学概述，可以检查复杂的关联学习（第1节）和记忆在即时和延迟记忆方面。此范式提供了对学习的关联认知任务的短期和长期记忆的评估（第 2 节）。

研究方案

斑马鱼是在弗雷曼生命科学中心的圣母院斑马鱼设施中饲养和饲养的。本手稿中描述的方法已得到圣母院大学动物护理和使用委员会（动物福利保障编号A3093-01）的批准。

1. 穿梭箱学习范式 （图1A）

注:学习范式提供了对关联学习认知的快速评估。

1. 通过修改一个 30.5 x 19 x 7.5 厘米的凝胶盒，在两侧以 45° 角添加 5 x 19 厘米的水族级有机玻璃，为穿梭盒做好准备。划一条线，标记鱼缸的中间点，以评估鱼何时越过鱼缸中间（图1B）。
2. 在航天飞机箱中加入 800 mL 的系统水。通过在 1 L 的去离子 RO 水中溶解 60 毫克的瞬时海洋来制造此水。将水灌注到水箱中间，深度为 5 厘米。
   注:以每小时28°C或测试3条鱼后的淡水代替。
3. 将 2-3 条鱼放入装有系统水的储罐中，该储罐位于一个黑暗的房间内，在那里将进行穿梭箱检测。
   1. 在黑暗的房间里，将1条鱼放在穿梭箱的中心，固定盖子，并将电极连接到电源上。
      注意:在适应和测试期间，房间应尽可能保持黑暗。
4. 将鱼在穿梭箱中适应15分钟。
   注:调查员应在适应期间留在房间，或在测试前有充足的时间安静地返回测试室，以便鱼类适应调查员的存在。当鱼自由探索鱼缸时，可以考虑成功的适应。
   1. 如果鱼不能探索，继续适应15分钟。如果鱼仍然不能适应穿梭箱，将鱼取出。不要用这种鱼来测试。
5. 在适应后，手动照射 800 卢门红色镜头手电筒 +2 厘米，从鱼占据的侧面的凝胶盒壁上。
   注:如果鱼在铂金线旁边靠在航天飞机箱深端附近的墙上，请不要开始试用。
6. 将光线刺激直接照射到鱼身上，并手动跟随鱼的任何横向运动，确保刺激的连续可视化（图1C）。继续提供光刺激，直到满足以下任一条件。
   1. 如果鱼在 15s 的光照射下穿过水箱的中间点，则考虑路径是否成功。一旦鱼越过中间点，立即停止光刺激（图1D）。
   2. 如果鱼在 15s 内没有穿过盒子的中间点， 则将小径视为失败。在这种情况下，使用电泳电源应用负冲击刺激（20 mV:1 A）交替 2 s On， 2 s 关闭 15s 期间 （最大 4 冲击）， 或直到鱼通过框的中间点， 此时终止光和负刺激.
7. 让鱼休息30s，重复步骤1.5-1.6.2。详细记录成功试验（1.6.1）和失败试验（1.6.2）的顺序。
   注:在这里，我们定义学习是完成连续5次成功的试验。一旦学习得到证明，鱼应该从穿梭箱中取出，并人道地安乐死。

2. 记忆范式 （图1A）

注:此范式提供了对学习的关联认知任务的短期和长期记忆的评估。

1. 培训期
   1. 在航天飞机箱中加入 800 mL 的系统水。通过在 1 L 的去离子 RO 水中溶解 60 毫克的瞬时海洋来制造此水。将水灌注到水箱中间，深度为 5 厘米。
      注:水应更换为淡水系统水在28°C每小时或测试3条鱼后。
   2. 将 2-3 条鱼放入包含系统水的储罐中，该储罐位于一个黑暗的房间内，在那里将进行穿梭箱检测。
   3. 在黑暗的房间里，将1条鱼放在穿梭箱的中心，固定盖子，并将电极连接到电源上。
      注意:在适应和测试期间，房间应尽可能保持黑暗。
   4. 在航天飞机箱中适应鱼15分钟。
      注:调查员应在适应期间留在房间，或在测试前有充足的时间安静地返回测试室，以便鱼适应调查员的存在。当鱼自由探索鱼缸时，确定成功的适应。
   5. 如果鱼不能探索，继续适应15分钟。如果鱼仍然不能适应穿梭箱，请取出鱼，不要将其用于测试。
   6. 成功适应后，手动照射一个800卢门的红色镜头手电筒+2厘米的凝胶盒侧壁，在被鱼占据的穿梭盒的一侧。
   7. 将光线刺激直接照射到鱼身上，并跟随鱼的任何横向运动，确保鱼的刺激持续可视化。
   8. 当光线照耀在鱼身上时，同时应用不利的冲击刺激（20 mV:1 A）交替2 s On，2 s 关闭15s（最大4次冲击），或直到鱼通过盒子的中间点。一旦实现这一点，终止光和不利的刺激。
      注:让鱼休息30s，然后重复步骤2.1.6-2.1.8为25次迭代（图1A）。
2. 初始测试
   1. 训练期结束后，让鱼休息15分钟。不要从航天飞机箱中取出它们。在此休息期之后，通过将每个试用记录为严格通过/失败来测试初始内存保留。
   2. 仅应用 15s 的光刺激，并记录以下响应。
      1. 如果鱼在启动光刺激后在 15s 内穿过穿梭箱的中间点，则考虑试验是否成功。当鱼穿过中间点时，立即停止光线刺激。
      2. 如果鱼在启动光刺激后没有穿过穿梭箱 15s 的中间点，则将试验视为失败。15 岁以后停止光刺激。
         注:在初始测试期间，尝试失败后不应用不利刺激。
   3. 重复步骤 2.2.2，在试验之间有 30 的休息时间，并在 25 次试验中记录成功的试验 （2.2.2.1） 和失败试验 （2.2.2.2）。此值将作为每条鱼的单独参考。
3. 即时内存
   1. 通过首选损伤范式（例如，使用改良的 Marmarou 重量下降的钝力创伤）在初始测试期后立即诱导损伤） 。房子鱼单独为一个简单的识别。记录其初始测试值，并将鱼送回动物设施。
      注:鱼被钝力TBI打伤，如前所述^22。
   2. 在动物设施进行初始测试和/或受伤后 4 小时（或在相关实验时间范围内）收集 2-3 条未损坏或 TBI 鱼 4 小时。将所有鱼放在暗室中，放入含有系统水的单独水箱中。
   3. 将鱼放在穿梭箱的中心（用系统水（如1.1中所述）准备），一次放一条鱼，并固定盖子。连接电源，让鱼适应15分钟。
   4. 适应后，仅应用 15s 的光刺激来评估即时记忆（严格通过/失败），并记录以下响应。
      1. 如果鱼在 15s 测试期内越过盒子的中间点，则考虑试验是否成功。在越过中间点时终止光刺激。
      2. 如果鱼在启动光刺激后 15s 内没有穿过盒子的中间点，则将试验视为失败。15s 期结束后终止光刺激。
         注:在此次受伤后测试中，在尝试失败后不应用不利的冲击刺激。
   5. 重复步骤 2.3.4，在试验之间有 30 的休息时间，并记录 25 次试验中成功的试验次数（2.3.4.1）和未通过的试验（2.3.4.2）。
   6. 使用方程计算受伤后与初始测试期的成功试验的百分比差异:
      
4. 延迟内存
   1. 将鱼送回动物设施，单独安置，以便于识别和记录其初始测试值，并在初始测试期后立即返回动物设施。
   2. 在初始测试和损伤和/或延迟记忆测试之间允许鱼 4 天（或相关实验时间框架）。
   3. 诱导损伤的首选伤害范式（如修改后的马尔马鲁体重下降，以诱导钝力创伤）。家养鱼单独为方便识别初始测试值，并返回鱼到动物设施。
      注:鱼被钝力TBI打伤，如前所述^22。
   4. 在动物设施进行初始测试和/或受伤后 4 小时（或在相关实验时间范围内）收集 2-3 条未损坏或 TBI 鱼 4 小时。
   5. 将所有鱼放在装有系统水的单独水箱的暗室中，并一次放置一个在穿梭箱的中心（用系统水（如 1.1 中所述）准备），固定盖子，连接电源，让鱼 15 分钟适应。
   6. 适应后，仅应用 15s 的光刺激来评估即时记忆（严格通过/失败），并记录以下响应:
      1. 如果鱼在 15s 测试期内穿过盒子的中间点，请考虑路径是否成功。在越过中间点时终止光刺激。
      2. 如果鱼在启动光刺激后 15 s 内没有穿过盒子的中间点，则将路径视为失败，终止光刺激。
         注:在此次受伤后测试中，在尝试失败后不应用不利的冲击刺激。
   7. 重复步骤 2.4.6，在试验之间有 30 的休息时间，并记录 25 次试验中成功的试验次数（2.4.6.1）和失败试验（2.4.6.2）。
   8. 用方程计算受伤后试验成功与初始测试期的百分比差异:
      

结果

协议和示意图（图1）中概述的学习范式，对关联学习的认识进行了快速评估。此外，这种模式具有高度的严格性，将学习定义为连续 5 次积极试验的重复和一致显示。此范式也适用于各种年龄和伤害。8个月（年轻成人）、18个月（中年成人）和24个月（成年）未损坏鱼类需要类似数量的试验，以了解避免红灯的行为（未损坏8米:15.28±4.92试验， 18 米: 17.66 ± 5.5 试验， 24 米: 16...

讨论

认知障碍会对生活质量产生显著和负面影响。由于整个人群的能见度和脑震荡和创伤性脑损伤的发生增加，了解它们如何导致认知障碍以及如何将损害降到最低或逆转非常重要。由于这些原因，可以测试认知衰退的模型生物在这些研究中起着至关重要的作用。长期以来，啮齿动物一直是研究神经行为和认知的主要模型，然而，斑马鱼已成为一个有用的模型，具有许多不同的行为，以调查一系列发?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flashlight	Ultrafire	9145
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Large DNA Gel Box	Fisher Scientific	FB-SB-1316	Shuttle Box
Power Supply	Fisher Scientific	FB-105