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Resumo

Apresentamos o processo de isolamento, propagação e caracterização de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos de habitats aquáticos. O protocolo descreve o isolamento bacteriano, a identificação pelo método 16S rRNA e o teste de seu potencial degradador de hidrocarbonetos. Este artigo ajudará os pesquisadores na caracterização da biodiversidade microbiana em amostras ambientais e, especificamente, na triagem de micróbios com potencial de biorremediação.

Resumo

Os hidrocarbonetos poluentes são recalcitrantes à degradação e seu acúmulo no meio ambiente é tóxico para todas as formas de vida. As bactérias codificam numerosas enzimas catalíticas e são naturalmente capazes de metabolizar hidrocarbonetos. Os cientistas aproveitam a biodiversidade nos ecossistemas aquáticos para isolar bactérias com potencial de biodegradação e biorremediação. Tais isolados do ambiente fornecem um rico conjunto de vias metabólicas e enzimas, que podem ser posteriormente utilizadas para escalar o processo de degradação em escala industrial. Neste artigo, descrevemos o processo geral de isolamento, propagação e identificação de espécies bacterianas de habitats aquáticos e selecionamos sua capacidade de utilizar hidrocarbonetos como única fonte de carbono in vitro usando técnicas simples. O presente protocolo descreve o isolamento de várias espécies bacterianas e sua posterior identificação utilizando a análise do 16S rRNA. O protocolo também apresenta etapas para a caracterização do potencial degradador de hidrocarbonetos de isolados bacterianos. Este protocolo será útil para pesquisadores que tentam isolar espécies bacterianas de habitats ambientais para suas aplicações biotecnológicas.

Introdução

Os hidrocarbonetos (HC) são amplamente utilizados tanto como combustíveis quanto em aplicações químicas. Hidrocarbonetos aromáticos como benzeno, tolueno e xileno são amplamente utilizados como solventes1. Alcenos como etileno e propileno servem como precursores na síntese de polímeros de polietileno e polipropileno, respectivamente. Polimerização de outro hidrocarboneto, estireno forma poliestireno. As atividades antrópicas introduzem hidrocarbonetos no meio ambiente durante sua produção e transporte. A contaminação do solo e da água por hidrocarbonetos preocupa seriamente o ambiente e a saúde humana. Os micróbios desempenham um papel importante na manutenção do ecossistema, regulando os ciclos biogeoquímicos e utilizando uma ampla gama de substratos, que incluem poluentes e xenobióticos também, convertendo-os em carbono e fonte de energia. Esse processo de desintoxicação de contaminantes ambientais por microrganismos é conhecido como biorremediação 3,4,5,6,7.

Microrganismos com capacidade de degradar hidrocarbonetos são encontrados em habitats aquáticos e de solo 8,9,10. Muitas bactérias com potencial para degradar alcanos e HCs aromáticos têm sido identificadas, como Pseudomonas, Acinetobacter, Rhodococcus, Marinobacter e Oleibacter11. O desenvolvimento de abordagens tecnologicamente avançadas independentes de cultura tem ajudado a descobrir novas comunidades microbianas degradadoras de HC12. O material genômico isolado diretamente das amostras de origem é amplificado e sequenciado por métodos de alto rendimento, como o Next Generation Sequencing (NGS), seguido de análise, eliminando a necessidade de cultivar microrganismos. Métodos de NGS, como a análise do metagenoma, são caros e sofrem de inconvenientes relacionados ao processo deamplificação13. Técnicas de cultivo como a cultura de enriquecimento seletivo14 que visam o isolamento de micróbios degradadores de hidrocarbonetos ainda são úteis, pois permitem aos pesquisadores sondar e manipular vias metabólicas em isolados bacterianos.

O isolamento do DNA genômico e o subsequente sequenciamento do material genômico revelam informações valiosas sobre qualquer organismo. O sequenciamento do genoma completo auxilia na identificação de genes que codificam resistência a antibióticos, potenciais alvos de drogas, fatores de virulência, transportadores, enzimas metabolizadoras de xenobióticos, etc15,16,17. O sequenciamento do gene codificador do 16SrRNA provou ser uma técnica robusta para identificar a filogenia bacteriana. A conservação da sequência e função do gene ao longo dos anos o torna uma ferramenta confiável para identificar bactérias desconhecidas e comparar um isolado com a espécie mais próxima. Além disso, o comprimento desse gene é ótimo para análise de bioinformática18. Todas essas características, juntamente com a facilidade de amplificação de genes usando primers universais e o aprimoramento na tecnologia de sequenciamento gênico, fazem dele um padrão ouro para a identificação de micróbios.

Neste trabalho, descrevemos um procedimento para recuperação de microrganismos cultiváveis com potencial degradador de HC a partir de amostras ambientais. O método descrito a seguir descreve a coleta e identificação de bactérias degradadoras de HC e é dividido em cinco seções: (1) coleta de bactérias de amostras de água, (2) isolamento de culturas puras, (3) exploração da capacidade degradadora de HC de isolados bacterianos, (4) isolamento de DNA genômico e (5) identificação baseada em sequenciamento do gene 16S rRNA e análise BLAST. Este procedimento pode ser adaptado para isolar bactérias para as mais diversas aplicações biotecnológicas.

Protocolo

1. Coleta, processamento e análise de amostras

NOTA: Aqui, apresentamos um protocolo para isolar bactérias de habitats aquáticos. Alguns dos isolados podem ser patogênicos, portanto, usar luvas e desinfetar a área de trabalho antes e após o uso.

  1. Coletar 500 mL de amostra de água em cinco garrafas de vidro estéreis de diferentes locais do corpo hídrico. Medir o pH e a temperatura de cada amostra usando um medidor de pH e termômetro, respectivamente.
    NOTA: O protocolo não é específico do local e pode ser facilmente adaptado para isolar organismos de corpos d'água contaminados com hidrocarbonetos também.
  2. Filtrar a amostra num lote de 100 ml através de folhas filtrantes de 0,22 μm de poros, em condições assépticas.
    NOTA: O diâmetro do papel de filtro não deve exceder o diâmetro da placa de Petri. Por exemplo, papel de filtro não superior a 85 mm de diâmetro é ideal para uma placa de Petri de 100-120 mm.
  3. Manter os papéis de filtro sobre diferentes placas de meios nutritivos (PYE19, R2A20, M9, LB, NB, TSB, M6321 e M2G22). Os diferentes tipos de meios de crescimento permitem a seleção e o enriquecimento de diferentes microrganismos. As composições dos diversos meios de crescimento estão listadas na Tabela 1. Use um papel para cada placa de mídia e descasque após 2 h usando pinças estéreis.
  4. Diluir em série as amostras de água não filtrada (106 diluição) em água bidestilada estéril, adicionando 100 μL da amostra de água recolhida em 900 μL de água estéril. Isso resulta em uma diluição de 1:10. Desta amostra, retirar 100 μL e adicionar 900 μL de água estéril para obter uma diluição de 1:100. Repita a diluição até que a dobra de diluição seja de 1:1.000.000. Misture por pipetagem. O volume final de cada diluição será de 1 mL.
  5. Espalhe 100 μL da amostra de água diluída individualmente em todas as placas de meios de crescimento mencionadas na etapa 3 em triplicatas.
  6. Incubar as placas a 30 °C durante 24 a 48 horas, dependendo do crescimento das colónias.
    NOTA: A maioria dos isolados ambientais cresce a uma temperatura ótima de 30 °C. Se isolar as amostras de um ambiente com temperaturas extremas, incubar as placas à mesma temperatura do local de coleta.
  7. Em seguida, escolha as colônias usando um palito estéril ou ponta de pipeta e execute a estria do quadrante para obter colônias isoladas.
  8. Incube as placas durante a noite. No dia seguinte, faça uma triagem das colônias com base em suas características morfológicas, como cor, textura, forma, tamanho, margem, elevação, etc. Restreak as colônias para obter culturas puras.
  9. Realizar coloração de grama de cada cultura pura23 e proceder com o preparo do estoque de glicerol.
  10. Para preparar os estoques de glicerol, inocular uma única colônia em 3 mL de meio de cultura apropriado e incubar a 30 °C. A partir da cultura noturna, tomar 700 μL e adicionar 300 μL de glicerol a 100% (esterilizado por autoclavagem) em criofrascos24. Congelar os frascos para injetáveis a -80 °C para armazenamento a longo prazo.

2. Degradação dos hidrocarbonetos

NOTA: O exemplo abaixo é para filtrar os isolados que podem degradar o estireno. Trata-se de uma ligeira modificação do método adaptado em relatório anterior25. Siga os passos em condições assépticas.

  1. De um prato recém-listrado, colher uma colônia e inocular em 5 mL de caldo de soja Tryptic (TSB)/Caldo nutriente (NB). Cultivar a cultura durante a noite a 30 °C com agitação a 200 rpm até que a absorbância atinja ~2.
    NOTA: Com exceção do TSB/NB, qualquer meio de crescimento pode ser escolhido no qual as bactérias atinjam alta densidade celular.
  2. No dia seguinte, pastilha as células a 2862 x g por 5 min a 4 °C e descarte o sobrenadante.
  3. Lavar o pellet duas vezes com 2 mL de solução salina autoclavada (NaCl 0,9%) e girar a 2862 x g por 5 min a 4 °C.
    OBS: O soro fisiológico é isotônico e, portanto, mantém a pressão osmótica no interior das células bacterianas.
  4. Ressuspender o pellet em 2 mL de meio basal líquido livre de carbono (MBCFCL). Medir a absorbância (OD600).
  5. Levar dois frascos Erlenmeyer estéreis com capacidade de 150 mL para controle e grupo experimental. Rotule-os como A e B.
  6. No grupo não inoculado/controle (frasco A), adicionar 40 mL de MBCFC e estireno (5 mM).
  7. No balão B, adicionar 35 mL de LCFBM e estireno (ajustar a concentração final de estireno para 5 mM). Adicionar a suspensão celular com um OD final de600 células ≈ 0,1 e completar o volume restante com LCFBM até 40 mL. Incubar os frascos a 30 °C com agitação a 200 rpm durante 30 dias.
    NOTA: Hidrocarbonetos em excesso podem ser tóxicos para os micróbios, portanto, comece com baixa concentração e aumente-a gradualmente.
  8. Repita o acima para cada cepa adicional que deve ser avaliada quanto à degradação de hidrocarbonetos.
  9. Medir o OD600 de cada frasco a cada 5 dias e traçar uma curva de crescimento. Aumente a incubação até 45 dias se as bactérias puderem utilizar estireno. Um aumento no OD600 indica que a bactéria pode metabolizar estireno.

3. Triagem da degradação de catecol por isolados bacterianos

NOTA: A degradação de hidrocarbonetos aromáticos como estireno, benzeno, xileno, naftaleno, fenóis, etc. produzem catecóis como intermediários de reação. Os catecóis são posteriormente metabolizados por bactérias com a ajuda das enzimas catecol 1,2-dioxigenase e catecol 2,3-dioxigenase através das vias de ortoclivagem e metaclivagem, respectivamente26. Essas enzimas também estão envolvidas na degradação de outros hidrocarbonetos, como o clorobenzeno27. O protocolo citado abaixo utiliza o lisado de células inteiras para o ensaio da enzima catecol 2, 3-dioxigenase28. O mesmo método de lise pode ser usado para rastrear a atividade da catecol 1, 2-dioxigenase. No entanto, a composição da mistura de reação irá variar. Ambas as enzimas são induzíveis na natureza e podem ser induzidas pela adição de fenol aos meios de crescimento.

  1. Com a ajuda de uma alça estéril, inocular a colônia bacteriana de uma placa recém-riscada em meio de sais minerais (MSM) suplementado com fenol 1-4 mM. Incubar a cultura a 30 °C e 200 rpm. Colher a cultura a 4 °C quando OD600 atingir entre 1,4-1,6 (ou seja, em fase exponencial tardia) girando a 4500 x g por 20 min.
  2. Lavar o pellet celular com tampão fosfato (0,5 M, pH 7,5).
  3. Ressuspender as células no tampão fosfato acima mencionado e ajustar o OD600 final ≈ 1.0.
  4. Lisar as células por sonicação pulsada por 1,5 min, sendo a duração de cada pulso de 15 s. Após essa etapa, a suspensão deve estar clara ou menos turva. Caso contrário, aumente o número de pulsos e verifique se a suspensão está limpa. Após cada pulso, mantenha a amostra no gelo para evitar a degradação da proteína.
  5. Remover os restos celulares e as células intactas por centrifugação a 9.000 x g por 30 min, mantendo a temperatura fria (4 °C).
  6. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante transparente. Esta fração tem o extrato bruto para ensaio enzimático.
  7. Determinar a concentração proteica do extrato bruto pelo método de Bradford ou Lowry29,30.
  8. Para determinar a atividade da catecol 2,3-dioxigenase, medir a formação do produto final da reação (2-hidroximucônico semialdeído) por um espectrofotômetro.
  9. Preparar a mistura de reacção adicionando 20 μL de catecol (50 mM), 960 μL de tampão fosfato (50 mM, pH 7,5) e 20 μL do extracto bruto.
  10. Para o controle negativo, substituir o extrato bruto por tampão fosfato e ajustar o volume final para 1 mL.
  11. Incubar a mistura de reação por 30 min. Em intervalos de tempo definidos, medir a absorbância a 375 nm. Um aumento na absorbância indica a formação do produto final da reação, o ácido 2-hidroximucônico semialdeído (2-HMS). Realizar o experimento em triplicatas.
    NOTA: O catecol é sensível à luz e ao oxigênio. Conservar a mistura de reacção no escuro e fechar bem os tubos para evitar a degradação natural do catecol.

4. Isolamento do DNA genômico da cultura pura

NOTA: Este é o protocolo geral para o isolamento de DNA genômico. A coloração de Gram foi realizada durante a etapa de coleta, processamento e análise das amostras. Devido à variação na espessura da parede celular de bactérias gram-positivas e gram-negativas, o método de lise celular é modificado de acordo. Use luvas ao isolar e desinfete a bancada com etanol 70% para evitar que as nucleases degradem o DNA. Alguns dos produtos químicos mencionados abaixo podem causar queimaduras graves na pele e o cuidado adequado deve ser tomado ao manuseá-los.

  1. Isolamento de DNA genômico de bactérias Gram-negativas31.
    1. Escolher uma única colônia e inocular em um meio de crescimento fresco em tubos de ensaio estéreis.
    2. Coloque os tubos num agitador de incubadora a 200 rpm e deixe que as bactérias cresçam durante a noite a 30 °C.
    3. No dia seguinte, pellet 1,5 mL de cultura cultivada durante a noite a 12.400 x g por 3 min.
    4. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 μL de tampão de lise (40 mM Tris-acetato, pH 7,8, 20 mM acetato de sódio, 1 mM EDTA, 1% SDS).
    5. Adicionar 66 μL de solução de NaCl (5 M) e misturar bem.
    6. Pellet da mistura resultante a 12.400 x g durante 10 min (4 °C).
    7. Pipetar o sobrenadante límpido num tubo de microcentrífuga fresco e adicionar um volume igual de clorofórmio.
    8. Inverter a misturar a solução várias vezes até observar uma solução leitosa.
    9. Gire a 12.400 x g durante 3 minutos e transfira o sobrenadante para um frasco para injetáveis limpo.
    10. Adicionar 1 mL de etanol 100% gelado; misturar por inversão até que as fitas brancas de DNA se precipitem.
    11. Centrifugar o ADN precipitado a 2.200 x g durante 10 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
    12. Lavar o pellet de DNA com 1 mL de etanol 70% e deixar o pellet de DNA secar por 5 min à temperatura ambiente.
    13. Depois de seco, ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão 1x Tris-EDTA(TE) e armazene o DNA a -20 °C.
    14. Medir a concentração (A260/280) usando espectrofotômetro e executar o DNA em gel de agarose (1%) para avaliar a qualidade do DNA24.
  2. Isolamento de DNA genômico de cepa gram-positiva32
    1. Escolher uma única colônia e inocular em meio de crescimento fresco em tubos de ensaio estéreis.
    2. Coloque os tubos em um agitador de incubadora a 200 rpm e deixe as bactérias crescerem durante a noite a uma temperatura de crescimento adequada.
    3. No dia seguinte, tomar 1,5 mL da cultura cultivada e centrifugar a 8.600 x g por 5 min.
    4. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células no tampão TE.
    5. Ajustar o OD600 = 1,0 com tampão TE e transferir 740 μL da suspensão celular para um tubo de microfuga limpo.
    6. Adicionar 20 μL de lisozima (caldo de 100 mg/mL) e misturar bem por pipetagem. Incubar a 37 °C durante 30 minutos (em banho seco).
    7. Adicione 40 μL de 10% de SDS e misture bem.
    8. Adicionar 8 μL de Proteinase K (10 mg/mL). Misture bem e incube a 56 °C por 1-3 h (em banho seco). A suspensão deve ficar clara agora com o aumento da viscosidade, marcando a lise celular eficiente.
      NOTA: A suspensão pode ser deixada durante a noite se as células não forem lisadas corretamente.
    9. Pré-aqueça a mistura CTAB/NaCl a 65 °C (em banho seco) e adicione 100 μL desta mistura à suspensão celular. Misture bem.
    10. Incubar a 65 °C durante 10 minutos (em banho seco).
    11. Adicione 500 μL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e misture bem. Gire a 16.900 x g por 10 min a 25 °C.
    12. Transfira a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga fresco evitando a fase orgânica (fase viscosa no fundo).
    13. Adicione cuidadosamente 500 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e misture bem. Gire a 16.900 x g por 10 min a 25 °C.
    14. Tome a fase aquosa em um tubo de microcentrífuga fresco. Adicione 500 μL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e misture bem.
    15. Transferir a fase aquosa e adicionar 0,6 volume de isopropanol (pré-resfriado a -20 °C).
    16. As fitas de ADN precipitadas devem ser visíveis na forma de rosca. Incubar a -20 °C durante 2 h durante a noite.
    17. Centrifugar a 16.900 x g por 15 min a 4 °C para pellet o DNA.
    18. Decantar cuidadosamente o isopropanol e lavar o pellet com 1 mL de etanol 70% frio (pré-resfriado a -20 °C) para remover quaisquer impurezas.
    19. Centrifugar a 16.900 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
    20. Deixe o pellet secar à temperatura ambiente durante 20 min ou mantenha o tubo a 37 °C. Certifique-se de que o pellet não está excessivamente seco.
    21. Ressuspender em 100 μL de tampão 1x TE e armazenar o DNA a -20 °C.
      NOTA: Se o pellet ficar excessivamente seco e for difícil de ressuspender, incube o tubo de microcentrífuga com pellet de DNA e água livre de nuclease a 37 °C por 15-20 min e ressuspenda novamente por pipetagem.
    22. Medir a concentração (A260/280) em espectrofotômetro após diluição de 1:100 em tampão TE 1x e executar o DNA em gel de agarose (1%) para avaliar a qualidade do DNA24.

5. Sequenciamento do 16S rRNA

NOTA: O protocolo descrito abaixo é para amplificação e sequenciamento do 16S rRNA para identificação bacteriana. Informações derivadas da sequência 16S rRNA são usadas para a identificação de um organismo desconhecido e para encontrar a relação entre diferentes organismos.

  1. Para identificar as cepas, amplificar o DNA isolado das culturas bacterianas puras por PCR com primers universais direcionados à sequência 16S rRNA para bactérias: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') e 1492R (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')33.
  2. Preparar a mistura de PCR (reações de 25 μL) em gelo com 18 μL de água autoclavada/livre de nuclease, 2,5 μL de tampão 10x, 0,5 μL de primers forward e reverse (100 μM stock), 2 μL da mistura dNTPs (100 μM stock), 1 μL de DNA template (2-15 ng/μL) e 1 U de Taq Polymerase.
  3. Use as seguintes condições de ciclagem para amplificação do gene 16S rRNA: Desnaturação inicial a 94 °C por 10 min (desnaturação final a 94 °C por 40 s, recozimento do primer a 56 °C por 1 min, extensão a 74 °C por 2 min) x 30 ciclos, extensão final a 74 °C por 10 min.
  4. Após o término do ciclo, misturar 5 μL de amostra e 1 μL de corante de carga de DNA 5x. Executar em gel de agarose a 1% para verificar a amplificação. Conservar os produtos de PCR a 4 °C a curto prazo ou congelá-los a -20 °C até nova utilização.
  5. Para o sequenciamento do gene 16S rRNA, configurar a mesma reação mencionada acima para maior volume (100 μL).
  6. Purificar os amplicons para sequenciamento de Sanger24,34 usando o kit de purificação do produto PCR ou misturar toda a amostra com corante de carga de DNA e carregar em um gel de agarose para executar o método de extração em gel.
  7. Feito o sequenciamento, converta o arquivo de resultados no formato FASTA e verifique a similaridade da sequência com a ferramenta básica de busca de alinhamento local (BLAST) no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35.

Resultados

O esquema delineando todo o procedimento de isolamento e triagem de bactérias de habitats aquáticos e sua posterior identificação pela análise do 16S rRNA está representado na Figura 1. Amostras de água de uma área úmida em Dadri, Índia, foram coletadas em garrafas de vidro estéreis e imediatamente levadas ao laboratório para processamento. As amostras foram passadas através de folhas filtrantes com poros de 0,22 μm, e os papéis de filtro foram mantidos em con...

Discussão

Está bem estabelecido que apenas aproximadamente 1% das bactérias na Terra pode ser facilmente cultivada em laboratório6. Mesmo entre as bactérias cultiváveis, muitas permanecem descaracterizadas. Melhorias nos métodos moleculares deram uma nova dimensão à análise e avaliação das comunidades bacterianas. No entanto, tais técnicas apresentam limitações, mas não tornam redundantes as análises de cultura. Técnicas de cultivo puro para isolar espécies bacterianas individuais permanec...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Karthik Krishnan e aos membros do laboratório RP por seus comentários e sugestões úteis. O DS é apoiado pela SNU-Doctoral fellowship e Earthwatch Institute India Fellowship. O laboratório RP é apoiado por uma bolsa CSIR-EMR e fundos de start-up da Universidade Shiv Nadar.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA4718Gel electrophoresis
Ammonium chloride (NH4Cl)Sigma-AldrichA9434Growth medium component
Ammonium sulphateSigma-AldrichA4418Growth medium component
Bacto-AgarMillipore1016141000Solid media preparation
Calcium chloride (CaCl2)MERCKC4901-500GGrowth medium component
CatecholSigma-Aldrich135011Hydrocarbon degradation assay
Cetyltrimethylammonium bromide, CTABSigma-AldrichH6269Genomic DNA Isolation
ChloroformHIMEDIAMB109Genomic DNA isolation
Disodium phosphate (Na2HPO4)Sigma-AldrichS5136Growth medium component
EDTASigma-AldrichE9884gDNA buffer component
Ferrous sulphate, heptahydrate (FeSO4.7H20)Sigma-Aldrich215422Growth medium component
GlucoseSigma-AldrichG7021Growth medium component
GlycerolSigma-AldrichG5516Growth medium component; Glycerol stocks
IsopropanolHIMEDIAMB063Genomic DNA isolation
LB AgarDifco244520Growth medium
Luria-Bertani (LB)Difco244620Growth medium
Magnesium sulphate (MgSO4)MERCKM2643Growth medium component
Manganese (II) sulfate monohydrate (MnSO4.H20)Sigma-Aldrich221287Growth medium component
Nutrient Broth (NB)Merck (Millipore)03856-500GGrowth medium
PeptoneMerck91249-500GGrowth medium component
PhenolSigma-AldrichP1037Genomic DNA isolation
Potassium phosphate, dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786Growth medium component
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Growth medium component
Proteinase KThermoFisher ScientificAM2546Genomic DNA isolation
QIAquick Gel Extraction kitQIAGEN160016235DNA purification
QIAquick PCR Purification kitQIAGEN163038783DNA purification
R2A AgarMillipore1004160500Growth medium
SmartSpec Plus SpectrophotometerBIO-RAD4006221Absorbance measurement
Sodium acetateSigma-AldrichS2889Genomic DNA isolation
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888Growth medium component
Sodium dodecyl sulphate (SDS)Sigma-AldrichL3771Genomic DNA isolation
StyreneSigma-AldrichS4972Styrene biodegradation
Taq DNA PolymeraseNEBM0273X16s rRNA PCR
Tris-EDTA (TE)Sigma-Aldrich93283Resuspension of genomic DNA
Tryptic Soy Broth (TSB)Merck22092-500GGrowth medium
Yeast extractSigma-AldrichY1625-1KGGrowth medium component
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4.7H20)Sigma-Aldrich221376Growth medium component

Referências

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