Análisis cuantitativo de las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos mediante pinzas ópticas y microscopía desenfocada

Resumen

Aquí, se describe un protocolo integrado basado en pinzas ópticas y microscopía desenfocada para medir las propiedades reológicas de las células. Este protocolo tiene una amplia aplicabilidad en el estudio de las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos en condiciones fisiopatológicas variables.

Resumen

Las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos han sido investigadas por una variedad de técnicas. Sin embargo, los datos experimentales reportados varían. Esto no solo se atribuye a la variabilidad normal de las células, sino también a las diferencias en los métodos y modelos de respuesta celular. Aquí, se emplea un protocolo integrado que utiliza pinzas ópticas y microscopía de desenfoque para obtener las características reológicas de los glóbulos rojos en el rango de frecuencia de 1 Hz a 35 Hz. Mientras que las pinzas ópticas se utilizan para medir la constante elástica del complejo eritrocitario, la microscopía de desenfoque es capaz de obtener el perfil de altura de la célula, el volumen y su factor de forma, un parámetro que permite la conversión de la constante elástica compleja en módulo de corte complejo. Además, aplicando un modelo de reología vítrea suave, se puede obtener el exponente de escala para ambos módulos. La metodología desarrollada permite explorar el comportamiento mecánico de los glóbulos rojos, caracterizando sus parámetros viscoelásticos, obtenidos bajo condiciones experimentales bien definidas, para varias condiciones fisiológicas y patológicas.

Introducción

Los glóbulos rojos maduros (RBC), también conocidos como eritrocitos, pueden extenderse más del doble de su tamaño cuando pasan a través de los capilares más estrechos del cuerpo humano¹. Tal capacidad se atribuye a su capacidad única de deformarse cuando se somete a cargas externas.

En los últimos años, diferentes estudios han caracterizado esta característica en superficies de glóbulos rojos ^2,3. El área de la física que describe las respuestas elásticas y viscosas de los materiales debido a las cargas externas se llama reología. En general, cuando se aplic....

Protocolo

Las muestras de sangre humana fueron proporcionadas por hombres y mujeres adultos voluntarios de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad Federal de Río de Janeiro (Protocolo 2.889.952) y registrados en la Plataforma Brasil con el número CAAE 88140418.5.0000.5699. Se emitió una forma escrita de consentimiento y se recogió de todos los voluntarios. Se excluyeron aquellos con hemoglobinopatía y/o que tomaban medicación controlada. Todo el proceso siguió las directrices aprobadas por el comité de ética del instituto.

1. Preparación de los portamuestras

1. Adquiera do....

Resultados

La Figura 1 representa los esquemas del sistema OT utilizado para las mediciones reológicas. La figura 2 muestra los esquemas del experimento de microrreología con ambas esferas y también se muestra un RBC representativo. La Figura 3 muestra una curva típica para las amplitudes de ambas esferas en función del tiempo cuando los movimientos sinusoidales son producidos por la etapa piezoeléctrica. Mientras que la esfera de refere.......

Discusión

En este protocolo, se presenta un método integrado basado en pinzas ópticas y microscopía de desenfoque para mapear cuantitativamente las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos. Se determinan los resultados para los módulos de almacenamiento y pérdida de cizallamiento, junto con el exponente de escala que caracteriza la reología vítrea suave de los glóbulos rojos. Ya se ha llevado a cabo la aplicación de este protocolo para diferentes condiciones experimentales, como en la situación fisiológica

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm culture dishes	Corning	430165
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01
Glass-bottom dishes	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Immersion oil	Nikon	MXA22165
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Microscope camera	Hamamatsu	C11440-10C
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Objective lens	Nikon	PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2
Optical table	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Polystyrene microspheres	Polysciences	17134-15
rubber ring	Forever Seals	NBR O-Ring
Silicone grease	Dow Corning	Z273554
Stage positioning	PI	P-545.3R8S
Pipette	Gilson	P1000