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* Estos autores han contribuido por igual
Aquí, se describe un protocolo integrado basado en pinzas ópticas y microscopía desenfocada para medir las propiedades reológicas de las células. Este protocolo tiene una amplia aplicabilidad en el estudio de las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos en condiciones fisiopatológicas variables.
Las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos han sido investigadas por una variedad de técnicas. Sin embargo, los datos experimentales reportados varían. Esto no solo se atribuye a la variabilidad normal de las células, sino también a las diferencias en los métodos y modelos de respuesta celular. Aquí, se emplea un protocolo integrado que utiliza pinzas ópticas y microscopía de desenfoque para obtener las características reológicas de los glóbulos rojos en el rango de frecuencia de 1 Hz a 35 Hz. Mientras que las pinzas ópticas se utilizan para medir la constante elástica del complejo eritrocitario, la microscopía de desenfoque es capaz de obtener el perfil de altura de la célula, el volumen y su factor de forma, un parámetro que permite la conversión de la constante elástica compleja en módulo de corte complejo. Además, aplicando un modelo de reología vítrea suave, se puede obtener el exponente de escala para ambos módulos. La metodología desarrollada permite explorar el comportamiento mecánico de los glóbulos rojos, caracterizando sus parámetros viscoelásticos, obtenidos bajo condiciones experimentales bien definidas, para varias condiciones fisiológicas y patológicas.
Los glóbulos rojos maduros (RBC), también conocidos como eritrocitos, pueden extenderse más del doble de su tamaño cuando pasan a través de los capilares más estrechos del cuerpo humano1. Tal capacidad se atribuye a su capacidad única de deformarse cuando se somete a cargas externas.
En los últimos años, diferentes estudios han caracterizado esta característica en superficies de glóbulos rojos 2,3. El área de la física que describe las respuestas elásticas y viscosas de los materiales debido a las cargas externas se llama reología. En general, cuando se aplica una fuerza externa, la deformación resultante depende de las propiedades del material y se puede dividir en deformaciones elásticas, que almacenan energía, o deformaciones viscosas, que disipan la energía4. Todas las células, incluidos los glóbulos rojos, exhiben un comportamiento viscoelástico; En otras palabras, la energía se almacena y se disipa. La respuesta viscoelástica de una célula puede caracterizarse por su módulo de cizallamiento complejo G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω), donde G' (ω) es el módulo de almacenamiento, relacionado con el comportamiento elástico, y G" (ω) es el módulo de pérdida, relacionado con su viscosidad4. Además, se han utilizado modelos fenomenológicos para describir las respuestas celulares, uno de los más utilizados se denomina modelo5 de reología vítrea blanda, caracterizado por una dependencia de la ley de potencia del módulo de cizallamiento complejo con la frecuencia de carga.
Se han empleado métodos basados en una sola célula para caracterizar las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos, aplicando fuerza y midiendo el desplazamiento en función de la carga impuesta 2,3. Sin embargo, para el módulo de cizallamiento complejo, se pueden encontrar pocos resultados en la literatura. Utilizando la dispersión dinámica de la luz, se informaron valores para el almacenamiento de RBC y los módulos de pérdida que variaron de 0.01-1 Pa, en el rango de frecuencia de 1-100 Hz6. Mediante el uso de citometría óptica de torsión magnética, se obtuvo un módulo elástico complejo aparente7, y para fines de comparación, se afirmó un factor multiplicativo para posiblemente aclarar las discrepancias.
Más recientemente, se estableció una nueva metodología basada en pinzas ópticas (OT) junto con microscopía desenfocada (DM), como herramienta integrada para mapear cuantitativamente el almacenamiento y la pérdida de módulos de cizallamiento de eritrocitos humanos sobre cargas dependientes del tiempo 8,9. Además, se utilizó un modelo de reología vítrea suave para ajustar los resultados y obtener un coeficiente de ley de potencia que caracteriza a los glóbulos rojos 8,9.
En general, la metodología desarrollada8,9, cuyo protocolo se describe en detalle a continuación, aclara las discrepancias anteriores utilizando los valores medidos para el factor de forma, Ff, que relaciona las fuerzas y deformaciones con tensiones y deformaciones en la superficie de los glóbulos rojos y puede utilizarse como un nuevo método de diagnóstico capaz de determinar cuantitativamente los parámetros viscoelásticos y las características vítreas blandas de los glóbulos rojos obtenidos de individuos con sangre diferente. Patologías. Dicha caracterización, utilizando el protocolo que se describe a continuación, puede abrir nuevas posibilidades para comprender el comportamiento de los glóbulos rojos desde una perspectiva mecanobiológica.
Las muestras de sangre humana fueron proporcionadas por hombres y mujeres adultos voluntarios de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad Federal de Río de Janeiro (Protocolo 2.889.952) y registrados en la Plataforma Brasil con el número CAAE 88140418.5.0000.5699. Se emitió una forma escrita de consentimiento y se recogió de todos los voluntarios. Se excluyeron aquellos con hemoglobinopatía y/o que tomaban medicación controlada. Todo el proceso siguió las directrices aprobadas por el comité de ética del instituto.
1. Preparación de los portamuestras
2. Cultivo celular
NOTA: Los pasos a continuación describen cómo obtener glóbulos rojos sanos de la sangre humana. Es importante que las muestras estén recién preparadas antes de cada experimento.
3. Configuración del microscopio de pinzas ópticas
NOTA: OT son herramientas que utilizan un rayo láser altamente enfocado para atrapar objetos microscópicos y para medir fuerzas en el rango de piconewton y desplazamientos en la escala nanométrica. El láser OT utilizado (longitud de onda de 1064 nm) debe estar correctamente alineado, como se describió anteriormente10.
4. Configuración de DM
NOTA: La DM es una técnica de microscopía óptica basada en campo claro que permite que los objetos transparentes se vuelvan visibles si el microscopio está ligeramente desenfocado11,12. Tal técnica ha sido aplicada para obtener la forma RBC13. El mismo microscopio empleado para el sistema OT se puede utilizar para DM, para obtener un perfil de altura a través de reconstrucciones 3D.
5. Experimento y análisis de reología basado en OT
NOTA: El experimento de reología consiste en observar las respuestas de la célula a pequeñas oscilaciones de frecuencias variables.
6. Experimento y análisis de DM para obtener el factor de forma celular global
7. Modelo de reología vítrea blanda y análisis experimental
La Figura 1 representa los esquemas del sistema OT utilizado para las mediciones reológicas. La figura 2 muestra los esquemas del experimento de microrreología con ambas esferas y también se muestra un RBC representativo. La Figura 3 muestra una curva típica para las amplitudes de ambas esferas en función del tiempo cuando los movimientos sinusoidales son producidos por la etapa piezoeléctrica. Mientras que la esfera de refere...
En este protocolo, se presenta un método integrado basado en pinzas ópticas y microscopía de desenfoque para mapear cuantitativamente las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos. Se determinan los resultados para los módulos de almacenamiento y pérdida de cizallamiento, junto con el exponente de escala que caracteriza la reología vítrea suave de los glóbulos rojos. Ya se ha llevado a cabo la aplicación de este protocolo para diferentes condiciones experimentales, como en la situación fisiológica
Los autores no tienen intereses financieros en los productos descritos en este manuscrito y no tienen nada más que revelar.
Los autores desean agradecer a todos los miembros de la instalación de microscopía avanzada CENABIO por su importante ayuda. Este trabajo fue apoyado por las agencias brasileñas Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Código Financiero 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) junto con Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. fue apoyado por una subvención JCNE de FAPERJ.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
Pipette | Gilson | P1000 |
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