Identificazione di frammenti di RNA risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF

L'RNA è un biopolimero presente in tutti i domini della vita e le sue interazioni con altre molecole e / o specie reattive, ad esempio DNA, proteine, ioni, farmaci e radicali liberi, sono onnipresenti. Di conseguenza, l'RNA subisce varie reazioni che includono la sua scissione, degradazione o modifica, portando a specie biologicamente rilevanti con funzioni e implicazioni distinte. Un esempio è l'ossidazione della guanina a 7,8-diidro-8-ossoguanina (8-oxoG), che può verificarsi in presenza di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Nel complesso, le procedure che caratterizzano tali prodotti e trasformazioni sono in gran parte preziose per la comunità scientifica. A tal fine, la spettrometria di massa a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice (MALDI-TOF) è un metodo ampiamente utilizzato. Il presente protocollo descrive come caratterizzare i frammenti di RNA formatisi dopo il trattamento enzimatico. Il modello scelto utilizza una reazione tra l'RNA e l'esoribonucleasi Xrn-1, in cui la digestione enzimatica viene interrotta in siti ossidati. Due sequenze di RNA lungo 20 nucleotidi [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] sono state ottenute tramite sintesi in fase solida, quantificate mediante spettroscopia UV-vis e caratterizzate tramite MALDI-TOF. I fili ottenuti sono stati poi (1) fosforilati 5' e caratterizzati tramite MALDI-TOF; (2) trattati con Xrn-1; (3) filtrati e dissalati; (4) analizzato tramite MALDI-TOF. Questa configurazione sperimentale ha portato all'identificazione inequivocabile dei frammenti associati allo stallo di Xrn-1: [5'-H₂PO₄-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H₂PO₄-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5'-H₂PO₄-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Gli esperimenti descritti sono stati condotti con 200 picomoli di RNA (20 pmol utilizzati per le analisi MALDI); tuttavia, quantità inferiori possono comportare picchi rilevabili con spettrometri che utilizzano sorgenti laser con più potenza di quella utilizzata in questo lavoro. È importante sottolineare che la metodologia descritta può essere generalizzata e potenzialmente estesa all'identificazione del prodotto per altri processi che coinvolgono RNA e DNA e può aiutare nella caratterizzazione / delucidazione di altri percorsi biochimici.