Demostración de la inervación de la piel peluda y glabra en un patrón 3D utilizando múltiples enfoques de tinción fluorescente y limpieza de tejidos

Resumen

El grosor de las secciones de tejido limitó el estudio morfológico de la inervación de la piel. El presente protocolo describe una técnica única de limpieza de tejidos para visualizar las fibras nerviosas cutáneas en secciones de tejido gruesas de 300 μm bajo microscopía confocal.

Resumen

La inervación de la piel es una parte importante del sistema nervioso periférico. Aunque el estudio de las fibras nerviosas cutáneas ha progresado rápidamente, la mayor parte de la comprensión de sus características distributivas y químicas proviene de la tinción histoquímica e inmunohistoquímica convencional en secciones delgadas de tejido. Con el desarrollo de la técnica de limpieza de tejidos, ha sido posible ver las fibras nerviosas cutáneas en secciones de tejido más gruesas. El presente protocolo describe múltiples tinciones fluorescentes en secciones de tejido a un grosor de 300 μm de la piel plantar y dorsal de la pata trasera de rata, los dos sitios típicos de piel peluda y glabra. Aquí, el péptido relacionado con el gen de la calcitonina etiqueta las fibras nerviosas sensoriales, mientras que la faloidina y el receptor 1 de hialuronano endotelial de los vasos linfáticos etiquetan los vasos sanguíneos y linfáticos, respectivamente. Bajo un microscopio confocal, las fibras nerviosas sensoriales marcadas se siguieron completamente a una distancia más larga, corriendo en haces en la capa cutánea profunda y freestyle en la capa superficial. Estas fibras nerviosas corrían en paralelo o rodeaban los vasos sanguíneos, y los vasos linfáticos formaban una red tridimensional (3D) en la piel peluda y glabra. El protocolo actual proporciona un enfoque más efectivo para estudiar la inervación de la piel que los métodos convencionales existentes desde la perspectiva de la metodología.

Introducción

La piel, el órgano más grande del cuerpo, que sirve como una interfaz clave para el medio ambiente, está densamente inervada por muchas fibras nerviosas ^1,2,3. Aunque la inervación de la piel ha sido ampliamente estudiada previamente con varios métodos histológicos, como la tinción en las secciones ^4,5,6 de la piel y el tejido de montaje completo, la demostración efectiva detallada de las fibras nerviosas cutáneas sigue siendo un desafío ^7,8. Dado esto, el presente protocolo desarrolló una técnica única para exhibir las fibras nerviosas cutáneas más claramente en la sección de tejido grueso.

Debido al límite por el grosor de las secciones, la observación de las fibras nerviosas inervadas de la piel no es lo suficientemente precisa como para representar con precisión la relación entre las fibras nerviosas del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y los tejidos y órganos locales a partir de la información de la imagen adquirida. La aparición de la tecnología de limpieza de tejidos en 3D proporciona un método factible para resolver este problema ^9,10. El rápido desarrollo de enfoques de limpieza de tejidos ha ofrecido muchas herramientas para estudiar estructuras tisulares, órganos enteros, proyecciones neuronales y animales enteros en los últimos tiempos¹¹. El tejido transparente de la piel podría ser fotografiado en una sección mucho más gruesa por microscopía confocal para obtener los datos para visualizar las fibras nerviosas cutáneas.

En el estudio actual, la piel plantar y dorsal de un pie trasero de rata se seleccionó como los dos sitios objetivo de la piel peluda y glabra ^3,4,7. Para rastrear las fibras nerviosas cutáneas a una distancia más larga, el tejido de la piel se cortó en rodajas con un grosor de 300 μm para la tinción inmunohistoquímica e histoquímica, seguida de un tratamiento de limpieza de tejidos. CGRP se utilizó para etiquetar las fibras nerviosas sensoriales^12,13. Además, para resaltar las fibras nerviosas cutáneas en el fondo tisular, la faloidina y el receptor 1 de hialuronano endotelial de vasos linfáticos (LYVE1) se utilizaron para etiquetar los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos, respectivamente^14,15.

Estos enfoques proporcionaron un método sencillo que se puede aplicar para demostrar una vista de alta resolución de las fibras nerviosas cutáneas y también para visualizar la correlación espacial entre las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la piel, lo que puede proporcionar mucha más información para comprender la homeostasis de la piel normal y la alteración cutánea en las condiciones patológicas.

Protocolo

El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Acupuntura y Moxibustión, Academia China de Ciencias Médicas Chinas (número de referencia D2018-04-13-1). Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). En este estudio se utilizaron tres ratas macho adultas (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Todos los animales fueron alojados en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h con temperatura y humedad controladas y se les permitió el libre acceso a alimentos y agua.

1. Perfusión y preparación de muestras

1. Inyectar 250 mg/kg de solución de tribromoetanol (ver Tabla de Materiales) por vía intraperitoneal en la rata para inducir la eutanasia.
2. Una vez que se detiene la respiración, use tijeras quirúrgicas de acero inoxidable para abrir la cavidad torácica de la rata. Utilice agujas de 20 G para perfundir a través del ventrículo cardíaco izquierdo¹³ a una velocidad de 3 ml/min con 100 ml de solución salina normal al 0,9% seguida de 250-300 ml de paraformaldehído al 4% en tampón de fosfato al 0,1 M (PB, pH 7,4) (Figura 1A, B).
3. Después de la perfusión, use un bisturí para eliminar la piel del dorso y la suela de la pata trasera.
   1. Para las muestras que requieren sección congelada, posfijar los tejidos en paraformaldehído al 4% en 0,1 M PB durante 2 h; luego crioproteger los tejidos en sacarosa al 25% en PB 0,1 M durante más de 24 h a 4 °C
   2. Para las muestras con la sección gruesa que requiere limpieza de tejido, posfije los tejidos en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) durante 2 h; luego crioproteger los tejidos en 1x PBS a 4 °C (Figura 1C–E).

2. Tinción fluorescente triple con CGRP, faloidina y LYVE1 seguida de un tratamiento de limpieza de tejidos

NOTA: Se aplicó tinción fluorescente triple con CGRP, faloidina y LYVE1 para revelar las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la piel peluda y glabra en secciones de tejido con un grosor de 300 μm después del tratamiento de limpieza de tejidos.

1. Prepare la agarosa al 2% en 1x PBS calentando en un micro-horno durante 2 min hasta que la agarosa se disuelva (ver Tabla de Materiales).
2. Después del lavado, incruste los tejidos de la piel en agarosa al 2% a 37 ° C y colóquelos dentro de la nevera para enfriarlos (Figura 1F, G).
3. Fije el tejido montado en el microtomo vibratorio con el agua helada y córtelos a un grosor de 500 μm en la dirección transversal. Utilice los siguientes parámetros para ajustar la cortadora de vibración y terminar el corte: velocidad, 0,50 mm/s, y amplitud, 1,5 mm (Figura 1H-K).
4. Después de cortar, retire la agarosa de las secciones y guárdelas en una placa de seis pocillos con 1x PBS (pH 7.4) (Figura 1L).
5. Incubar las secciones de tejido en una solución de Tritón X-100 al 2% en 1x PBS (TriX-PB) durante la noche a 4 °C. Consulte la Figura 2 para el siguiente procedimiento.
6. Coloque las secciones de tejido en el tampón de bloqueo y gire a 72 rpm en el agitador durante la noche a 4 °C.
   NOTA: La composición del tampón de bloqueo es 10% de suero de burro normal, 1% de Triton-X 100 y 0.2% de azida de sodio en 1x PBS (ver Tabla de Materiales).
7. Transfiera las secciones de tejido a la solución que contiene los anticuerpos primarios del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CGRP (1:500) y el anticuerpo anti-LYVE1 policlonal de oveja (1:500) en tampón de dilución en el tubo de la microcentrífuga (ver Tabla de materiales), y gire sobre el agitador durante 2 días a 4 °C.
   NOTA: La composición tampón de dilución es 1% de suero de burro normal, 0.2% tritón-X 100 y 0.2% de azida de sodio en 1x PBS.
8. Lave las secciones de pañuelos dos veces con tampón de lavado a temperatura ambiente, luego manténgalas en el agitador durante la noche a 4 ° C en el tampón de lavado.
   NOTA: La composición del tampón de lavado es de 0.2% Triton-X 100 en 0.1 M PB (pH 7.4).
9. Al día siguiente, transfiera las secciones de tejido a la solución mixta que contiene los anticuerpos secundarios de Burro anti-ratón IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) y burro anti-oveja IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), así como Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) (ver Tabla de Materiales) en un tubo de microcentrífuga y gire a 72 rpm en el agitador durante 5 h a 4 °C.
10. Lave las secciones de tejido en una placa de seis pocillos con tampón de lavado durante 1 h, dos veces, a temperatura ambiente. Mantenga las secciones de tejido en el tampón de lavado en el agitador durante la noche a 4 °C.
11. Transfiera las secciones de tejido al reactivo de limpieza de tejidos (consulte la Tabla de materiales, su volumen fue cinco veces mayor que el volumen de la muestra) y gire a 60 rpm en el agitador suavemente durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Después de este tratamiento, las secciones de tejido se vuelven claras (Figura 2B).
12. Monte los tejidos despejados en el portaobjetos, rodee los tejidos con un espaciador y pegue el espacio con un reactivo de limpieza de tejido fresco y un recubierto.

3. Triple tinción fluorescente con CGRP, faloidina y LYVE1 siguiendo el enfoque convencional

NOTA: A modo de comparación, se realizó la misma tinción en secciones de tejido con un espesor de 30 μm siguiendo técnicas convencionales.

1. Cortar las secciones de tejido a 30 μm en un microtomo en la dirección transversal y montarlas en la diapositiva.
2. Añadir solución bloqueadora con suero de burro normal al 3% y Tritón X-100 al 0,3% en PB de 0,1 M e incubar las secciones durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Retire la solución bloqueadora e incube las secciones con la solución que contiene los anticuerpos primarios del anti-CGRP monoclonal de ratón (1:500) y el anticuerpo anti-LYVE1 policlonal de oveja (1:500) en tampón de dilución durante la noche a 4 °C.
4. Al día siguiente, lavar las secciones de tejido con 0,1 M PB (pH 7,4) tres veces, añadir la solución mixta que contiene los anticuerpos secundarios de burro anti-ratón IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) y burro anti-oveja IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), así como Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) en las secciones e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
5. Antes de la observación microscópica, lave las secciones en 0.1 M PB (pH 7.4) tres veces, luego cúbralas con fundas en glicerina al 50%.

4. Imágenes y análisis

1. Observe las muestras teñidas bajo un microscopio fluorescente y luego tome las imágenes con un microscopio confocal.
2. Capture 30 imágenes (pilas Z), cada una en fotogramas de 10 μm, de cada sección de 300 μm de espesor e integre una sola imagen enfocada utilizando un procesador de imágenes del sistema de microscopía confocal (consulte la Tabla de materiales).
   1. Realice los siguientes pasos en el software de procesamiento de imágenes de la configuración confocal para el análisis tridimensional (3D): Establecer plano focal de inicio | Establecer | de plano focal final Establecer el tamaño de los pasos | Elija el | Patrón de profundidad captura de imágenes | Serie Z.
      NOTA: Las longitudes de onda de excitación y emisión de las señales de fluorescencia azul fueron de 401 nm y 421 nm, respectivamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión de las señales de fluorescencia verde fueron de 499 nm y 519 nm, respectivamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión de las señales de fluorescencia roja fueron de 591 nm y 618 nm, respectivamente. 152 μm es el diámetro del agujero de alfiler confocal (lente de objetivo 10x, NA: 0,4). La resolución de captura de imagen fue de 1024 × 1024 píxeles.
3. Para las muestras convencionales (paso 3), capture 30 imágenes (pilas Z) en fotogramas de 1 μm de cada sección de 30 μm de espesor y trate estas imágenes como se mencionó anteriormente (pasos 4.1-4.2).
4. Demuestre las imágenes en el patrón de reconstrucción 3D con el sistema de procesamiento de imágenes.
5. Realice reconstrucciones 3D importando imágenes confocales de pila Z en Imaris 9.0 (software de imágenes de celdas, consulte Tabla de materiales) y cree representaciones de superficies basadas en intensidades de mancha: Agregue nuevas superficies | Elija el canal de origen | Determinar los parámetros en la opción suavizado de Detalle de superficies | Determine los parámetros en la opción de umbral de Intensidad absoluta | Clasificar superficies | Terminar.
6. Adquiera datos en el área de superficie de las fibras nerviosas positivas con el software de imágenes celulares. Seleccione la imagen renderizada | estadísticas | | detallado Valores específicos | Volumen.

Resultados

Después de la triple tinción fluorescente, las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos se etiquetaron claramente con CGRP, faloidina y LYVE1, respectivamente, en la piel peluda y glabra (Figura 3,4). Con el tratamiento de limpieza, las fibras nerviosas positivas para CGRP, los vasos sanguíneos positivos para faloidina y los vasos linfáticos positivos para LYVE1 se pueden obtener imágenes a mayor profundidad para adquirir la información estructur...

Discusión

El presente estudio proporciona una demostración detallada de las fibras nerviosas cutáneas en la piel peluda y glabra mediante el uso de inmunofluorescencia en secciones de tejido más gruesas con tratamiento de limpieza y una vista 3D para comprender mejor la inervación de la piel. El tiempo de incubación de anticuerpos de hasta 1-2 días y un proceso de limpieza nocturno son importantes. Estos dos pasos clave afectan directamente el efecto de tinción de inmunofluorescencia de secciones gruesas. Otro problema surg...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Life Science	T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy	Olympus Corporation	Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488	Abcam plc.	ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405	Abcam plc.	ab175676
EP tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.	615001	1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system	Leica Biosystems	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS standard scissor	WPI (World Precision Instruments Inc.)	503242
iSpacer	SunJin Lab co.	IS005
Micro forceps-Str	RWD	F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
Neutral buffered Formalin	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
Peristaltic pump	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 solution	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
Regular agarose	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str	RWD	F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody	R&D Systems, Inc.	AF7939
Six-well plate	Corning Incorporated	3335
Sodium azide	Sigma Life Science	S2002	25 g
Sucrose	Sigma Life Science	V900116	500 g
Super Glue	Henkel AG & Co.	Pattex 502
Surgical Handles	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 mL
Urethane	Sigma Life Science	U2500	500 g
VANNAS spring scissors	RWD	S1014-12
Vibratory microtome	Leica Biosystems	VT1200S