סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות DNA ליניאריות

Summary

מוצג כאן פרוטוקול להכנה וכיול חיץ של תמציות תאים מזני נוקאאוט אקסונוקלאז V של Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD ו- ΔrecB). זוהי גישה מהירה, קלה וישירה לביטוי במערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים באמצעות תבניות דנ"א ליניאריות.

Abstract

סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) הפכה לאחרונה לפופולרית מאוד בתחום הביולוגיה הסינתטית בשל יתרונותיה הרבים. שימוש בתבניות דנ"א ליניאריות עבור CFPS יאפשר עוד יותר לטכנולוגיה למצות את מלוא הפוטנציאל שלה, ויקצר את זמן הניסוי על ידי ביטול שלבי השיבוט, הטרנספורמציה ומיצוי הפלסמיד. ניתן להגביר את הדנ"א הליניארי במהירות ובקלות על ידי PCR כדי להשיג ריכוזים גבוהים של התבנית, תוך הימנעות מרעילות פוטנציאלית של ביטוי in vivo . עם זאת, תבניות דנ"א ליניאריות מתפרקות במהירות על-ידי אקסונוקלאזות שנמצאות באופן טבעי בתמציות התאים. ישנן מספר אסטרטגיות שהוצעו כדי להתמודד עם בעיה זו, כגון הוספת מעכבי נוקלאז או שינוי כימי של קצוות DNA ליניאריים להגנה. כל האסטרטגיות הללו עולות זמן ומשאבים נוספים ועדיין אינן משיגות רמות כמעט פלסמידים של ביטוי חלבונים. פרוטוקול מפורט לאסטרטגיה חלופית מוצג כאן לשימוש בתבניות DNA ליניאריות עבור CFPS. על-ידי שימוש בתמציות תאים מתאי נוקאאוט עם מחסור באקסונוקלאז, תבניות דנ"א ליניאריות נשארות שלמות ללא צורך בשינויי קצה כלשהם. אנו מציגים את שלבי ההכנה של ליזאט תאים מזן Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD על ידי תזה סוניקטיבית וכיול חיץ עבור Mg-גלוטמט (Mg-glu) ו- K-גלוטמט (K-glu) במיוחד עבור DNA ליניארי. שיטה זו מסוגלת להשיג רמות ביטוי חלבון דומות לאלה של דנ"א פלסמיד ב- E. coli CFPS.

Introduction

מערכות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) משמשות יותר ויותר כשיטה מהירה, פשוטה ויעילה להנדסת ביו-סנסורים, ייצור מבוזר ויצירת אב-טיפוס של מעגלים גנטיים¹. בשל הפוטנציאל הגדול שלהם, מערכות CFPS משמשים באופן קבוע בתחום הביולוגיה הסינתטית. עם זאת, עד כה מערכות CFPS מסתמכות על פלסמידים מעגליים שיכולים להגביל את הטכנולוגיה מלהגיע למלוא הפוטנציאל שלה. הכנת דנ"א פלסמיד תלויה בשלבים רבים שגוזלים זמן רב במהלך השיבוט ובכמויות גדולות של בידוד דנ"א. מצד שני, ניתן להשתמש בהגברת PCR מפלסמיד, או מתבנית DNA מסונתזת, כדי פשוט להכין תבניות CFPS תוך מספר שעות ^2,3. לכן, יישום של DNA ליניארי מציע פתרון מבטיח עבור CFPS. עם זאת, דנ"א ליניארי מתפרק במהירות על-ידי אקסונוקלאזות הנמצאות באופן טבעי בתמציות תאים⁴. ישנם פתרונות המטפלים בבעיה זו, כגון שימוש בחלבון λ-phage GamS⁵ או DNA המכיל אתרי צ'י⁶ כסוכני הגנה, או הגנה ישירה על הדנ"א הליניארי על ידי שינוי כימי של קצותיו 2,7,8,9. כל השיטות הללו דורשות תוספי מזון לתמצית התא, שהם יקרים וגוזלים זמן רב. זה ידוע כבר זמן רב כי קומפלקס אקסונוקלאז V (RecBCD) משפיל דנ"א ליניארי בתאים^{ליזטים 4}. לאחרונה, הראינו שדנ"א ליניארי יכול להיות מוגן הרבה יותר טוב בליזאטים מתאים שהוצאו עבור גנים של אקסונוקלאז (recBCD)¹⁰.

בפרוטוקול זה, צעדים להכנת ליזטים ללא תאים מזן E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD על ידי סוניקציה ליזיס מתוארים בפירוט. סוניקציה ליזה היא טכניקה נפוצה ובמחיר סביר בשימוש על ידי מספר מעבדות^11,12. התמציות המופקות מזן זה אינן זקוקות לתוספת של כל רכיב נוסף או שינוי בתבנית דנ"א כדי לתמוך בביטוי מתבניות דנ"א ליניאריות. השיטה מסתמכת על השלב החיוני של אופטימיזציה של חיץ עבור תמציות תאים במיוחד לביטוי DNA ליניארי ממקדמי E. coli מקומיים. הוכח כי אופטימיזציה ספציפית זו של חיץ לביטוי DNA ליניארי היא המפתח עבור מקדמי σ70 מקומיים להניב ייצור חלבון גבוה ללא חלבון GamS או תוספת DNA צ'י, אפילו הימנעות טיהור של מוצרי PCR¹⁰. הריכוז האופטימלי של Mg-glu לביטוי DNA ליניארי נמצא דומה לזה של דנ"א פלסמיד. עם זאת, הריכוז האופטימלי של K-glu הראה הבדל משמעותי בין דנ"א ליניארי לפלסמיד, ככל הנראה בשל מנגנון הקשור^{לתעתוק 10}. הפונקציונליות של חלבונים המתבטאים בשיטה זו הוכחה עבור מספר יישומים, כגון סריקה מהירה של מתגי toehold והערכת פעילות של גרסאות אנזים¹⁰.

פרוטוקול זה מספק פתרון פשוט, יעיל וחסכוני לשימוש בתבניות דנ"א ליניאריות במערכות ללא תאי E. coli פשוט על ידי שימוש בתמציות תאים מוטנטיות ΔrecBCD וכיול ספציפי לדנ"א ליניארי כתבנית.

Protocol

1. הכנת מדיה ומאגר

1. הכנת 2xYT+P בינוני (מוצק ונוזלי)
   1. הכן מדיה נוזלית ומוצקה כמתואר בטבלה 1, ולאחר מכן עקר על-ידי autoclaving.
      הערה: פרוטוקול זה דורש צלחת אגר אחת של 2xYT+P המכילה כלוראמפניקול (10 מיקרוגרם/מ"ל). נפח המדיה הנוזלית פרופורציונלי לנפח הליזאט הנדרש. כאן, נפח התחלתי של 5 ליטר של מדיה נוזלית 2xYT+P משמש. עם זאת, ניתן לכוונן את הנפח לפי הצורך, בידיעה ש-1 ליטר מתרבית התאים גורם ל-2 עד 3 מ"ל של ליזאט התא הסופי.
2. הכנת כלוראמפניקול (34 מ"ג/מ"ל)
   1. שוקלים 0.34 גרם של כלוראמפניקול, מוסיפים אתנול ל-10 מ"ל וממיסים על ידי ערבוב. Aliquot 1 מ"ל כל אחד למספר צינורות, ולאחסן ב -20 °C לשימוש מאוחר יותר.
3. הכנת חיץ S30A
   1. הכינו חיץ S30A לפי טבלה 2, תוך שאיפה ל-2 ליטר של חיץ זה.
      הערה: שוב, עוצמת הקול של מאגר זה פרופורציונלית לנפח הליזאט הנדרש.
   2. לפני האוטוקלאב, התאימו את ה-pH של החיץ ל-7.7 באמצעות חומצה אצטית קרחונית.
   3. אוטוקלאב את המאגר.
   4. יש לשמור על חיץ זה בטמפרטורה של 4°C לאחר ההרכבה האוטומטית.
   5. לפני השימוש, יש להוסיף DTT (מסונן על-ידי מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר) למאגר S30A כדי להגיע לריכוז סופי של 2 mM (2 מ"ל של מלאי 1 M DTT עד 1 L של מאגר S30A).
      הערה: שוב, עוצמת הקול של מאגר זה פרופורציונלית לנפח הליזאט הנדרש.
4. הכנת תמיסת אנרגיה
   הערה: תמיסת אנרגיה זו מבוססת על נייר¹³ של Sun et al. (ריכוז מלאי של פי 14). טבלה 3 משחזרת את הרכיבים הדרושים להכנת מלאי תמיסות האנרגיה, עם מספרים קטלוגיים עבור כל הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה.
   1. הכינו את פתרונות המלאי לפי טבלה 3 ושמרו אותם על קרח.
   2. כייל את ה-pH כמבוקש עבור הרכיבים שצוינו, באמצעות חיץ Tris 2 M (60.57 גרם של בסיס Tris בנפח של 250 מ"ל של מים סטריליים) או KOH 15% (15 גרם של KOH בנפח של 100 מ"ל של מים סטריליים) כפי שמצוין בטבלה 3.
   3. בצינור של 15 מ"ל, הוסף את הנפח של כל רכיב בסדר המצוין בטבלה 3.
   4. Aliquot תמיסת האנרגיה, 150 μL לכל צינור.
   5. יש להקפיא את האליקוטים על קרח יבש ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
5. הכנת תמיסת חומצות אמינו (AA)
   הערה: תמיסת חומצות האמינו מוכנה על-ידי ערכת דוגם חומצות האמינו RTS. כל אחת מ-20 חומצות האמינו מסופקת בערכה זו כנפח של 1.5 מ"ל ב-168 מ"ל, למעט לאוצין שהוא ב-140 מ"ל. כאן, פתרון המלאי המוכן הוא מרוכז פי 4, ולא פתרון העבודה הנדרש. הריכוז הסופי של תמיסת חומצות האמינו הוא 6 mM עבור כל חומצות האמינו, למעט לאוצין שהוא 5 mM.
   1. מפשירים את 20 צינורות חומצות האמינו על ידי מערבולות ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם מומסים לחלוטין.
      הערה: ייתכן ש-Cys לא יתמוסס במלואו.
   2. בצינור של 50 מ"ל, הוסף 12 מ"ל מים סטריליים ו-1.5 מ"ל כל אחת מחומצות האמינו בסדר המצוין בטבלה 4.
   3. מערבולת עד שהפתרון ברור למדי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במידת הצורך.
      הערה: ייתכן ש-Cys לא יתמוסס במלואו.
   4. Aliquot 500 μL של תמיסת חומצת האמינו לכל צינור על קרח.
   5. הקפיא את האליקוטים על קרח יבש ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
6. הכנת פתרונות לכיול חיץ
   1. הכן את תמיסת המלאי עבור Mg-glu (100 mM) ו- K-glu (3 M) כפי שמצוין בטבלה 5. בצע דילול סדרתי (בנפח של 1 מ"ל) ממלאי זה עבור Mg-glu (0 עד 20 mM) ו- K-glu (20 עד 300 mM) כפי שמצוין בקובץ משלים 1 עבור שלבי כיול.
      הערה: ריכוזי מלאי אלה מיועדים לשלב הכיול וייתכן שיהיה צורך לשנותם בעת הגדרת הניסוי הסופי. הריכוזים הגבוהים ביותר של המלאי שנבדקו עבור פרוטוקול זה הם 1 M ו-4.5 M עבור Mg-glu ו-K-glu, בהתאמה.
7. הכנת מלאי פתרונות PEG8000
   1. הכן 50 מ"ל של 40% PEG8000 פתרון (20 גרם של PEG8000 בנפח 50 מ"ל של מים סטריליים).

2. תרבית תאים והכנת ליזאט (ניסוי של 4 ימים)

1. יום 1
   1. זן פסים BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (טבלה 6) מ-80°C גליצרול על צלחת אגר 2xYT+P המכילה 10 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול. לחלופין, ניתן להשתמש גם ב-BL21 Rosetta2 ΔrecB (טבלה 6)¹⁰.
   2. דגירה לילה ב 37 °C (86 °F).
2. יום 2
   1. לחסן מושבה אחת מצלחת האגר הנ"ל ל-10 מ"ל של 2xYT+P בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול.
   2. יש לדגור במשך הלילה בטמפרטורה של 37°C עם רעידות של 200 סל"ד.
3. יום 3
   1. צור תת-תרבות על-ידי דילול תרבית הלילה 100 פעמים ל-4 ליטר של מדיה טרייה 2xYT+P המכילה 10 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול.
      הערה: לדוגמה, 40 מ"ל של תרבות הלילה מתווספים ל-3960 מ"ל של מדיה טרייה. לאחר דילול, המדיה של 4 L מחולקת ל-4 צלוחיות (נפח 5 L) כך שכל בקבוקון מכיל 1 L.
   2. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך כ-3 עד 4 שעות של צמיחה כדי להגיע_{ל-OD 600} של 1.5-2.0. לדלל את התרבית פי 4 אם מודדים OD₆₀₀ > 0.8.
      הערה: זמן הדגירה המדויק עשוי להשתנות בהתאם לזן, לאינוקולום הראשוני, לכלי המעבדה ולמכשירים שבהם נעשה שימוש. לזני הנוקאאוט ΔrecB/ΔrecBCD יש שיעורי גדילה דומים לאלה של הורי BL21 Rosetta2 (איור משלים 1).
   3. שים את התרבות על הקרח.
   4. סובבו את התאים בטמפרטורה של 5,000 x g למשך 12 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השליכו את הסופר-נטנט על ידי פירוק.
   5. השהה את כדורי התא ב-800 מ"ל של S30A+DTT מקוררים.
      הערה: הנפח של S30A+DTT קטן פי 5 מנפח תרבית התאים המקורי. לדוגמה, עבור נפח התחלתי של 1 ליטר של תרבית התא, יש להשעות את כדוריות התא ב-200 מ"ל של S30A+DTT. מומלץ גם לבצע צעד זה בחדר קר ב 4 מעלות צלזיוס, כמו גם שמירה על כל החומרים על קרח.
   6. סובבו את התאים בטמפרטורה של 5,000 x g למשך 12 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השליכו את הסופר-נטנט על ידי פירוק.
   7. חזור על שלבים 2.3.5 ו- 2.3.6.
   8. יש להדביר את כדוריות התאים ב-160 מ"ל של S30A+DTT צונן.
      הערה: הפעם הנפח של S30A+DTT קטן פי 25 מנפח תרבית התאים המקורי. לדוגמה, עבור נפח התחלתי של 1 ליטר של תרבית התא, יש להשעות את כדוריות התא ב-40 מ"ל של S30A+DTT. שוב, מומלץ לבצע את הצעד הזה בחדר קר ב 4 מעלות צלזיוס, כמו גם כדי לשמור את החומרים על קרח.
   9. העבירו את התאים לצינורות 50 מ"ל מקוררים ושקלים מראש.
   10. סובבו את התאים ב-2,000 x g למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השליכו את הסופר-נטנט על ידי פירוק.
   11. סובבו את התאים בטמפרטורה של 2,000 x g למשך 4 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הסופר-נאטנט הנותר על ידי שימוש בפיפטה.
   12. מדוד מחדש את משקל הצינור כדי לחשב את משקל כדור התא.
   13. שמור את כדורי התא ב -80 מעלות צלזיוס.
4. יום 4
   1. קח את כדורי התא מ -80 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותם על קרח במשך 1-2 שעות.
   2. השהה את כדורי התא ב-0.9 מ"ל של חיץ S30A+DTT לגרם ממשקל הכדורים. פיפטה לאט כדי להשעות את התאים, הימנעות קצף העליון ככל האפשר, אם בכלל.
   3. מניחים 1 מ"ל aliquots של התאים המחיים לתוך 1.5 מ"ל microtubes, ולשמור אותם על קרח או בלוק קר מקורר מראש ב 4 מעלות צלזיוס (עדיף להשתמש בלוקים מתכת).
      הערה: אם האליקוט האחרון הוא הרבה פחות מ-1 מ"ל, עדיף להשליך אותו מאשר לנפח תת-אופטימלי. הנפח האופטימלי (1 מ"ל) עבור סוניקציה נקבע עבור מערך זה (צינור, סוניקטור וגשושית), ועשוי להשתנות עבור מערך אחר.
   4. סוניקטור כל צינור בסוניקטור (בדיקה 3 מ"מ, תדר 20 קילוהרץ), עם מערך של 20% משרעת לשלושה מחזורים (סוניקציה של 30 שניות, הפסקה של דקה אחת).
      הערה: האנרגיה הכוללת שהועברה בשלושת המחזורים הייתה ~266 ג'אול (~80-110 ג'אול למחזור). במהלך שלב זה, שמור את הצינורות על בלוק קר כי הוא מוקף קרח. החליפו בין שני בלוקים קרים כדי למנוע התחממות יתר של הגשושית (בלוק הקור ההמתנה נשמר גם קר על קרח). שני הבלוקים הקרים היו מקוררים מראש במקרר יום לפני הסוניקציה.
   5. סובבו את הליזאט ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   6. לאסוף את supernatant (ליזאט התא) עם פיפטה ולהעביר צינור 50 מ"ל.
   7. לדגור את התא lysate ב 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד תסיסה במשך 80 דקות.
   8. סובבו את הליזאט ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   9. אסוף את הסופר-נאטנט והאליקוט 30 μL כל אחד במיקרו-צינוריות מקוררות מראש של 1.5 מ"ל, תוך שמירה על כל הצינורות על קרח.
   10. מקפיאים בהבזק את האליקוטים של ליזאט על קרח יבש ומאחסנים בטמפרטורה של -80°C.

3. כיול מאגר ללא תאים עבור DNA ליניארי

הערה: מאגר ללא תאים כויל לריכוזים אופטימליים של Mg-glu ו-K-glu כמתואר ב-Sun et ^al.13. יש צורך בקובץ משלים 1 לשלבי הכיול. התגובות נקבעו לנפח סופי של 10.5 μL כל אחת. התמציות כוילו באמצעות 1 ננומטר של דנ"א ליניארי (ראה סעיף 4 להלן) או דנ"א פלסמיד. ניתן לבצע את הניסויים באותו יום שבו המאגרים מוכנים, או להקפיא את המאגרים המוכנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי לבצע את הניסוי ביום אחר. עבור כל שלבי הכיול, כל רכיב הופשר על קרח לפני ערבוב וצינור לתוך צלחת 384 באר.

1. הכן תערובת מאסטר, על פי הכרטיסייה 'הכנת מאגר' בקובץ Excel קובץ משלים 1, המכיל: (א) תמצית תאים (33% מנפח התגובה הכולל), (ב) דנ"א מדווח (כדנ"א ליניארי ו/או פלסמיד) לריכוז סופי של 1 ננומטר, (ג) מאגר ללא תאים (PEG8000, תמיסת AA ותמיסת אנרגיה), ו-(ד) K-glu לריכוז סופי של 80 mM.
2. עבור נפח תגובה של 10.5 μL, קח 1.05 μL (10% תגובה כוללת) של ריכוזים שונים של מלאי מרוכז Mg-glu 10x (טווחי ריכוז סופיים: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ו- 20 mM) והוסף 9.45 μL (90% תגובה כוללת) של תערובת המאסטר. מערבבים בעדינות.
   הערה: השתמש בצינורות PCR בעלי שמונה רצועות כדי להכין את הדילולים ולערבב עם פיפטה רב-ערוצית. במידת הצורך, ניתן להשתמש בטווח שונה של ריכוזי Mg-glu.
3. Pipette 10 μL של התגובות הנ"ל לתוך microplate 384 תחתית מרובעת היטב, לכסות אותו באמצעות חותם צלחת דבק, ולמדוד ביטוי גנים כמו פלט פלואורסצנטי. הקלט נתוני פלואורסצנטיות באמצעות קורא צלחות (לדוגמה: 485 ננומטר; Em: 528 ננומטר) במרווחים קבועים (למשל, 5 דקות) במשך 8 שעות של דגירה ב-30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות רצופות ב-307 עותקים לדקה.
   הערה: במידת הצורך, סובב את המיקרו-פלטה בגודל 384 בארות (<2,500 x גרם, דקה אחת, טמפרטורת החדר) לפני תחילת איסוף הנתונים. מדידות נקודת קצה שימשו להשוואת ביטוי GFP בהרכבי המאגרים השונים. ניתן להמיר את ערכי הפלואורסצנציה ליחידות סטנדרטיות לצורך התווייה (ראה להלן).
4. זהה את ריכוז Mg-glu שמביא לערך הפלואורסצנטי הגבוה ביותר בנקודת הקצה.
   הערה: אם אינכם בטוחים לגבי ריכוז ה-Mg-glu האופטימלי שהושג, חזרו על שלב 3.2 עם טווחי ריכוז מגוונים יותר.
5. עם ריכוז Mg-glu הממוטב, המשך לכיול K-glu עבור מגוון ריכוזים (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 ו- 240 mM), תוך שימוש באותם נפחים המצוינים בשלב 3.2. הפעל את הניסוי וזהה את הערך הפלואורסצנטי הגבוה ביותר מבין ריכוזי K-glu שנבדקו. זה מציין את הרכב החיץ האופטימלי עבור Mg-glu ו- K-glu עבור ליזאט זה.
   הערה: אם אינכם בטוחים לגבי ריכוז K-glu האופטימלי שהושג, חזרו על השלב עם טווחי ריכוז מגוונים יותר.
6. לאחר קביעת ערכי Mg-glu ו- K-glu, הכן צינורות מלאי של הרכב החיץ האופטימלי בהתאם לנפח האצווה המתקבל. השתמש בכרטיסייה 'הכנת חיץ' בקובץ משלים 1 כדי לחשב את מספר צינורות החיץ הדרושים, aliquot 38 μL לכל צינור, ולאחסן ב -80 °C.

4. הכנת DNA ליניארי

הערה: לכיול ליזאט, נעשה שימוש בפלסמיד P70a-deGFP. פלסמיד זה נשמר ב- E. coli KL740 cl857+ (טבלה 6) עבור miniprep באמצעות ערכת Miniprep פלסמיד, או maxiprep באמצעות ערכת Maxiprep פלסמיד. מקטעי דנ"א ליניאריים ששימשו כתבניות ביטוי בתגובות נטולות התאים הוגברו באמצעות הפריימרים והתבניות המפורטים בטבלה 7 ובטבלה 8.

1. הגברת PCR מפלסמיד P70a-deGFP באמצעות DNA פולימראז עם פריימרים אוליגו המפורטים בטבלה 7. הגדר את תגובות ה- PCR בנפח של 50 μL, על פי פרוטוקול היצרן, באמצעות תוכנית thermocycler: [98 °C למשך 2 דקות; 40 מחזורי x (98 °C למשך 30 שניות → 66 °C למשך 30 שניות → 72 °C למשך 60 שניות); 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 4 מעלות צלזיוס למשך ∞].
2. עכל את הדנ"א של התבנית בתגובות ה-PCR על-ידי הוספת 1 μL של אנזים הגבלת DpnI לכל תגובת PCR של 50 μL ודגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לטהר את תגובת ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR ו-DNA ולהצטייד במים נטולי נוקלאזה.
3. יש לאמת את מוצרי ה-PCR על ג'ל אגרוז 1% (1x TAE) לפני השימוש.
4. כמת את מוצרי ה-PCR המטוהרים (או את מכיני הפלסמיד) באמצעות Nanodrop (ND-1,000).
   הערה: אם משתמשים בפולימראז/חיץ דנ"א התואם ישירות לתגובה נטולת התאים במורד הזרם, ניתן לדלג לחלוטין על שלב הטיהור (שלב 2) ועל ריכוז הדנ"א הלא מטוהר נמדד על ידי בדיקה פלואורומטרית עם צבע קושר דנ"א במקום זאת (ראו Batista et ^al.10).

5. ביצוע ניסיוני

הערה: בנוסף לשימוש בקובץ משלים 1 כדי לכייל את מלאי המאגר עבור כל אצווה של ליזאט שהוכנה (לעיל), מומלץ להשתמש בכרטיסייה 'הכנת תגובה' בקובץ כדי להגדיר את התגובות הבאות ללא תאים. כמו בעבר, נפח התגובות נקבע על 10.5 μL לכל תגובה, מתוכם רק 10 μL הוא סוף סוף pipetted לתוך צלחת 384 באר לאיסוף נתונים. כאן, 5 ננומטר מכל תבנית משמשים לביטוי ללא תאים. חשוב להיות עקביים בעת התגובות - להשתמש באותה פיפטה ובסוג הטיפים. יש לטפטף בזהירות כדי למנוע בועות בבאר או כל נוזל שנדבק לקירות הבאר. במידת הצורך, סובבו את הצלחת (<2,500 x גרם, דקה אחת, בטמפרטורת החדר).

1. חשב את אמצעי האחסון לפיפטה על-ידי הזנת תיאורי הדגימה והשכפולים הדרושים לכל דגימה בכרטיסייה 'הכנת תגובה' בקובץ משלים 1.
   הערה: אם נדרש אמצעי אחסון תגובה שאינו 10.5 μL, ניתן להזין אותו גם לקובץ משלים 1. הקובץ יחשב את מספר הצינורות של מאגרי חיץ שעברו אופטימיזציה בעבר ואת צינורות תמצית התאים שיש להפשיר על קרח.
2. תייג מיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל להכנת תערובת מאסטר אופטימלית (בנפרד עבור דנ"א ליניארי ופלסמיד), הוסף את הנפחים הנכונים של ה-Buffer וה-Lysate וערבב בעדינות.
   הערה: בשל הבדלים בריכוזי K-glu אופטימליים במאגרים שלהם, יש ליצור עותקים של הכרטיסייה 'הכנת תגובה' לשימוש בנפרד עבור דנ"א ליניארי ופלסמיד.
3. פיפטה של דגימות הדנ"א תחילה, לאחר מכן מים נטולי נוקלאזה, ולבסוף תערובת האב האופטימלית (MM) משלב 5.2. ערבבו את התגובה נטולת התאים בעדינות עם הפיפטה רגע לפני שתוסיפו אותה לקורא הצלחות והימנעו מבועות.
   הערה: השתמש בצינור PCR בעל שמונה רצועות כדי לערבב את נפח התגובה לקבלת שכפול נוסף. לדוגמה, אם מיועדים לשלשות טכניות, הכינו תערובת לארבע תגובות והשאירו נפח מת בצינור על מנת להפחית את שגיאות הפיפטינג תוך הוספת הדגימות לצלחת.
4. הגדר את התגובות בקורא הלוחות (Ex 485 nm; Em 528 ננומטר). ריצות קינטיות תיעדו נתוני פלואורסצנטיות במרווחי זמן קבועים (למשל, 5 דקות) במשך 8 שעות של דגירה ב-30 מעלות צלזיוס, עם רעידות מסלוליות רצופות ב-307 סל"ד.
   הערה: מדידות נקודת הקצה דווחו כנקודת הזמן של 8 שעות. ערכי הפלואורסצנציה שנאספו הם ביחידות שרירותיות (a.u.), אך ניתן להמיר אותם ליחידות סטנדרטיות לצורך התוויה (ראה להלן).

6. כימות יחסי של FITC ו-GFP

הערה: ביטוי GFP מיוצא על-ידי קורא הלוחות ביחידות פלואורסצנטיות שרירותיות (a.u.). עם זאת, מומלץ להשתמש ביחידות מידה סטנדרטיות על מנת להשוות ערכי פלואורסצנציה בין הגדרות שונות (קבוצות, ציוד, משתמשים ומעבדות). מוצגים כאן שלבים מפורטים להמרת ערכי הפלואורסצנציה (a.u.) לערכים שווי ערך ל- FITC ולערכים eGFP (μM), תוך שימוש בעקומות סטנדרטיות של NIST-FITC ו- eGFP רקומביננטי. אחסן את פתרון המלאי של NIST-FITC ב-4°C ואחסן eGFP רקומביננטי ב-20°C-. ודא שתמיסת המלאי והדילולים הסדרתיים מוגנים מפני אור. עם המסירה, מומלץ לדחוס את ה-eGFP הרקומביננטי לנפחים קטנים יותר כדי למנוע מחזורי הפשרה מרובים בהקפאה.

1. הכינו תמיסה של 100 mM נתרן בוראט, pH 9.5, ולאחסן בטמפרטורת החדר או ב 4 מעלות צלזיוס.
2. הכן 12 דילולים (70 μL כל אחד) עבור העקומה הסטנדרטית, 2x לכל צעד (50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.390, 0.195, 0.097, 0.048 ו- 0 μM) של תקן FITC הניתן למעקב NIST ממלאי 50 μM באמצעות תמיסת נתרן בוראט. הכינו את סדרת הדילול במשולש.
3. בדומה לשלב 6.2, הכינו דילולים סדרתיים (70 μL כל אחד) מה-eGFP הרקומביננטי באמצעות תמיסת הנתרן בוראט (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.,0003, 0.,00007 ו-0 μM). לצורך חישוב טוחנות, שקול את הגודל המלא של החלבון (28 kDa) ואת הריכוז של eGFP מטוהר (1 גרם / ליטר). הכינו את סדרת הדילול במשולש.
4. הוסף 20 μL מכל דילול (תשע בארות כל אחת = שלוש סדרות דילולים x שלושה שכפולים טכניים) למיקרו-פלטה בעלת תחתית מרובעת של 384 בארות, המכוסה על ידי חותם צלחת דבק, ודגירה בקורא צלחות למדידה.
   הערה: כאן, ההגדרות ששימשו היו עירור: 485/20, פליטה: 528/20, עם רווח 50. עם זאת, ניתן להשתמש בשילובי אורכי גל/רווח נוספים גם כדי לכייל מולקולות פלואורסצנטיות אחרות ו/או הגדרות רווח. כדי לחשב את מקדם ההמרה, נדרשות הגדרות אורך גל ורווח זהה כדי לרכוש את נתוני הפלואורסצנציה של GFP מהניסויים נטולי התאים ומנתוני העקומה הסטנדרטיים.
5. השתמש בטווח האותות הליניארי (כאן, לדוגמה, [FITC] ≤ 0.781 μM) כדי להתאים את השיפוע [y = ax ו- R²] עבור כל תנאי.
   הערה: הטווח עשוי להיות שונה עבור מכונות שונות ופתרונות סטנדרטיים בשימוש.
6. שמור את הנתונים עבור כיול FITC ו- eGFP כדי לחשב מדידות יחסיות עבור המעבדה על-ידי ביצוע הדוגמה בטבלה 9. חלק את הערכים המתקבלים ביחידות שרירותיות פלואורסצנטיות (a.u.) על ידי ערך שיפוע העקומה "a" (y = ax) כדי להעריך את ייצור GFP במונחים של FITC או eGFP.

תוצאות

תוצאות מייצגות מוצגות כאן לאחר כיול הליזאט לרמות אופטימליות של Mg-גלוטמט ו-K-גלוטמט בנפרד עבור דנ"א ליניארי ופלסמיד (איור 1). הריכוז האופטימלי של Mg-גלוטמט דומה בתמציות Δ recB ו-ΔrecBCD ב-8 mM (איור 1B). עם זאת, ריכוז K-גלוטמט אופטימלי עבור דנ"א פלסמיד הוא 140 mM, בע?...

Discussion

כאן אנו מראים כי ליזאט תאים שהוכן מ- E. coli BL21 Rosetta2 עם נוקאאוט גנומי עבור אופרון recB או recBCD תומך בביטוי חלבון גבוה מתבניות DNA ליניאריות. פרוטוקול זה מפרט הליך כיול ליזאט שלב אחר שלב הספציפי לתבניות דנ"א ליניאריות (איור 2), שהוא שלב קריטי שמוביל לביטוי גבוה של מקדמי ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-YT Broth	Invitrogen	22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes	Eppendorf	30120086	1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate	Thermo Scientific Nunc	142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)	Sigma-Aldrich	P8877
adhesive plate seal	Thermo Scientific Nunc	232701
Agar	Invitrogen	30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate)	Sigma-Aldrich	A8937
BL21 Rosetta2	Merck Millipore	71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB	Addgene	176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD	Addgene	176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate)	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
CoA (Coenzyme A hydrate)	Sigma-Aldrich	C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430790	15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile	Corning	430828	50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate)	Alfa Aesar	J62238
DpnI	NEB	R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol)	Sigma-Aldrich	D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt)	Sigma-Aldrich	F7878
GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate,  Disodium Salt)	Sigma-Aldrich	371701
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4)	Carl Roth	231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P)	Sigma-Aldrich	P5655
K-glutamate	Alfa Aesar	A17232
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone	Merck Millipore	SLGP033RB	membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit	NEB	T1030S	PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)	Sigma-Aldrich	N6522
NIST-traceable FITC standard	Invitrogen	F36915	NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit	Macherey-Nagel	740414.1	Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000	Sigma-Aldrich	89510
plate reader	Biotek	Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein	Chromotek	egfp-250	recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	M0492S	DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0492L	DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermo	Q32850	fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler	biotechrabbit	BR1401801
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Sterile water			Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base	Life Science products Cytiva	17-1321-01
tRNA	Roche	10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505	SONICS	VC505	sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate)	Acros Organics	226310010
Water, nuclease-free	Thermo	R0581	nuclease-free water