安全性薬理学の予測性を高めるための微小電極アレイ上の心筋細胞のレーザー誘起活動電位様測定

Summary

レーザーポレーションと微小電極アレイ(MEA)の組み合わせにより、培養された初代および幹細胞由来の心筋細胞の活動電位のような記録が可能になります。波形形状は、標準的な記録よりもテスト化合物の作用モードに関する優れた洞察を提供します。パッチクランプとMEA読み出しをリンクして、将来の心臓安全性研究をさらに最適化します。

Abstract

生命を脅かす薬物誘発性心不整脈は、しばしば長期の心臓活動電位(AP)が先行し、一般に小さな不整脈膜電位の変動を伴う。APの再分極画分の形状および経時変化は、不整脈の有無にとって極めて重要であり得る。

微小電極アレイ(MEA)は、細胞外電界電位(FP) を介して 心毒性化合物の影響に容易にアクセスできるようにします。FP波形は、研究および心臓安全性薬理学において強力で確立されたツールですが、細胞外記録原理と結果として生じる固有の交流(AC)フィルタリングにより、元のAP形状を推測することはできません。

ここで説明する新しいデバイスは、高度に集束されたナノ秒レーザービームを使用して、複数の培養時点でMEA電極上で培養された心筋細胞の膜を繰り返し開くことができます。レーザーポレーションは、電気生理学的シグナルをFPから細胞内様AP(レーザー誘起AP、liAP)に変換し、経細胞電圧偏向の記録を可能にします。この細胞内アクセスにより、AP形状をよりよく記述し、通常のMEA記録よりも整脈電位をより良く、より感度の高い分類することができます。このシステムは、既存の電気生理学的方法の革新的な拡張であり、MEAベースの記録のすべての利点(簡単、急性、慢性実験、シグナル伝播分析など)を備えた心毒性効果の正確な評価を可能にします。

Introduction

心拍の電気的寄与は、多くの心臓チャネルとトランスポーターの複雑で正確なタイミングの相互作用、および心筋を通る電気信号の正確に調整された伝播に起因し^ます1。これらの密接に調整されたメカニズムの変更(薬物の使用など)は、心臓の機能に深刻な結果をもたらす可能性があります(すなわち、生命を脅かす不整脈)^2,3。不整脈は、心臓の正常なリズムを変える不整脈として定義され、生命を脅かす結果をもたらす可能性があります。それらは、心臓興奮の波の開始障害または心臓興奮の異常な伝播4のいずれかによって引き起こされる可能性があり、^{その結果、心臓}のポンプ機構の機能不全が生じます。

多くの非常に強力な薬剤候補は、その(プロ)不整脈の可能性のために、医薬品開発の初期段階でさらなる調査から除外されなければなりません^2,3。それらは、正常な心臓活動電位の形成と終結、およびその後のシグナル伝播に関与する主要な心臓チャネル(例えば、ヒトエーテルゴーゴー関連遺伝子チャネル[hERG])を調節します⁵。

製薬会社は、パッチクランプ測定または微小電極アレイ(MEA)を日常的に使用して、薬剤候補によって誘発される潜在的な心毒性のオフターゲット効果を調査しています。パッチクランプ記録により、心臓イオンチャネルに対する物質の影響を解読し、高い時空間分解能で経細胞的心臓活動電位を分析することができます^6,7。しかしながら、この技術の欠点には、手動パッチクランプによる低スループットおよびこの方法の懸濁細胞への依存性による自動化の適用性の制限が含まれる。さらに、この方法の侵襲性のために慢性的な影響を調査することはできません。最後に、通常、心臓合胞体全体ではなく、単一の細胞のみが同時に研究されるため、シグナル伝播に関する情報に対処することは不可能です。

電位感受性色素は、心臓活動電位および薬物誘発性不整脈を非侵襲的に調査するのに有用です⁸。それらは、単一細胞活性とシンシチウム活性の両方の調査を可能にします。この方法の欠点は、照明中の色素自体または反応生成物のいずれかの細胞毒性効果である。それらは急性実験に使用され、長期研究にはほとんど適用できません9,10,11。代替としての電位感受性タンパク質は、使いやすさと感度の点で過去数年間で大きな進歩を遂げましたが、目的の細胞の遺伝子改変が必要であり、電気生理学的手法と比較して高い時間分解能が不足しています¹²。

最新のCiPAイニシアチブ¹³からの情報によると、MEAは、心機能と安全性薬理学を調査するための強力で確立されたツールであるため、代替の電気生理学的アプローチとして心臓安全性スクリーニングで広く使用されています。心筋細胞はチップ上に直接シンシチウムとして培養され、細胞外電界電位(FP)は基板集積微小電極を介して非侵襲的に記録されます。この記録原理により、数日間にわたってスループットスクリーニングを実施できるため、慢性疾患に関する医薬品研究に適しています。得られたFP波形は、細胞内^AP14の導関数である。ビートレート、FPの最初の部分の振幅、FP持続時間などのパラメータに簡単にアクセスできます¹⁵。FP(不整脈の重要な^{マーカー16,17})の延長と三角測量の区別などの他の重要な基準は、技術のACフィルタリング効果のためにアクセスできません。さらに、早期および遅延後脱分極(それぞれEADおよびDAD)などの他の小さな不整脈イベントの検出は、振幅が小さいため見落とされがちです。

ここでは、心筋細胞の膜を開口して細胞内膜電位にアクセスする方法について説明する。IntraCellデバイス(以下、細胞内記録デバイス)は、特定の物理現象(表面プラズモン共鳴) を介して 、高度に集束されたナノ秒レーザービームを使用して、MEA電極上で培養した心筋細胞の膜開口部を繰り返し行うことができます¹⁸。その結果、記録は通常のFPから細胞内様AP(レーザー誘導AP、liAP)に移行します。このプロトコルは、FPの解析では容易に捉えられない波形の運動的側面へのアクセスを可能にする方法を示しています。この方法は、従来の細胞内パッチクランプとMEA記録の間の架け橋を表しています。したがって、この技術は、現在の心臓安全性評価方法の強力な拡張です。

Protocol

1. 人工多能性幹細胞由来心筋細胞製剤

注:iCell心筋細胞² (人工多能性幹細胞[iPSC]由来心筋細胞と呼ばれる)は、サプライヤーが提供するプロトコルに従って調製されました。プロトコルについては、次のセクションで簡単に要約します。

1. 使用前にメッキおよびメンテナンス媒体を4°Cで24時間解凍します。
2. 滅菌フィブロネクチンを滅菌水に1 mg/mLの濃度で溶解することにより、フィブロネクチンコーティングを調製します。このストックをアリコートで凍結保存します(例:アリコートあたり25 μL)。分注したストック溶液を滅菌ダルベッコ平衡塩溶液(dPBS)で1:20に希釈します。
3. 以前にオートクレーブ滅菌したMEAの電極フィールドを層流フードの下で、10 μLピペットを使用してフィブロネクチンで無菌条件下で液滴状にコーティングします。このために、5μLのフィブロネクチンコーティング溶液を電極フィールドに滴下し、電極領域の上に液滴が形成されるのを観察します。敏感な電極に触れないように注意してください。
   注意: 無菌状態を維持するには、MEAチップを層流フードから取り外す前に、MEAチップを滅菌ペトリ皿に移します。
4. コーティングされたMEAsをインキュベーター内で37°Cで1時間インキュベートすることが好ましい。
5. 心筋細胞を含むクライオバイアルを約37°Cの水浴中で2分間、氷の結晶が少し残るまで解凍します。細胞溶液を50 mLチューブに穏やかに移します。
6. 空のクライオバイアルに1mLのメッキ培地を加えます。溶液を90秒かけて50 mLチューブに滴下し、浸透圧ショックを軽減します。さらに8mLのメッキ媒体をチューブにそっと加えます。
7. 10 mLピペットを使用して細胞懸濁液を注意深く混合します。自動蛍光サイトメトリーを使用して生細胞の総数を計算します。番号は、製造元が提供するデータシートの番号に近い必要があります。
8. 細胞溶液を室温で200 x g で3分間スピンダウンします。ポンプシステムに取り付けられたガラスピペットを使用して吸引により上清を除去します。細胞数を6,000〜15,000の生細胞/ μLの間で調整します。
   注意: セルの数は通常上記の範囲ですが、それぞれのサプライヤーによって異なる場合があります。
9. ステップ1.3で塗布したコーティング溶液を、細胞播種直前に10 μLピペットを使用してMEA電極領域から除去します。コーティングの乾燥を避けるために、除去直後に細胞に播種します。このために、コーティングと同じ方法で、6ウェルMEAと1ウェルMEAの両方について4 μLでセルを電極フィールドに滴下します。
10. 細胞を37°C、5%_CO2 のインキュベーター内で1時間接着させてから、約37°Cに加熱した滅菌めっき培地を層流フードの下で6ウェルMEAの場合は200 μL、単一ウェルMEAの場合は1 mLでウェルに充填します。
11. 層流フードの下でめっき後48時間で完全な媒体交換を実行します。このために、ポンプシステムに取り付けられたガラスピペットを使用して吸引によってめっき媒体を除去します。次に、37°Cに加熱した滅菌維持培地200 μLをウェルに加えます。
12. 一日おきに完全な培地交換を実行します。
13. 解凍後5〜8日で細胞の測定を開始します。実験を開始する2時間前に完全な培地交換を実行します。

2. 中東・アフリカ録音

注:FP信号をliAPに変換するために使用されるデバイスは、正立顕微鏡と1064nmレーザーで構成されています。

1. MEAチップホルダーを対物レンズの穴の中央に配置して、MEAシステムをデバイスの上に置きます。対物レンズがMEAシステムの穴の真下になるようにMEAセットアップを配置して、レーザーが電極に焦点を合わせられるようにします。
2. 培養細胞を含むMEAチップをインキュベーターから記録の15分前にMEAセットアップに移し、細胞が機械的障害から回復できるようにします。
3. ノイズレベルを下げるために、イソプロパノールと綿棒を使用してコンタクトパッドとピンを慎重に清掃します。MEA を MEA セットアップに慎重に配置します。左上の下部にロゴが付いたMEAチップ(6ウェルMEA)または参照電極を左側に配置します(シングルウェルMEA)。
4. MEAシステム一体型加熱を38°Cに設定します。 MEAチップの上に小さなチャンバーを置き、加湿カルボゲン(5%CO₂ および95%O₂)でセルを常に灌流して、インキュベーターの状態を再現し、蒸発を防ぎます。
5. デバイスの蓋を閉じます。統合された安全スイッチは、MEAチップ上で蓋が閉じられている場合にのみレーザーをアクティブにすることができます。MEA 構成プログラムを使用して MEA システム フィルタを 0.1 Hz 以下のハイパスと 3,500 Hz のローパスに設定します。
6. MC_Rackソフトウェア(録音ソフトウェア)または代替ソフトウェアを使用して録音してください。必要に応じて入力範囲を調整し、信号が飽和しないようにします ampリファイアとサンプリングレート(20kHzなど)。ソフトウェアの長期表示機能を使用して、記録を確認します。

3. レーザー誘起細胞ポレーション

1. MEAチップをMEAセットアップに挿入し、ソフトウェアをセットアップした後、FB Alpsソフトウェア(初期化ソフトウェア)を使用してレーザーメカニクスを初期化します。
2. まず、[ 初期化 ]ボタンをクリックします。初期化の最後に、仮想レーザーポイントは、6ウェルMEAの場合はウェルDに、シングルウェルMEAの場合は左下にあります。
3. Ctrl +マウスクリックで仮想レーザーポイントを電極D5の中央に移動し、フォーカスを調整します。Ctrl +マウスホイールでスクロールしてフォーカスを調整します。
4. ボタンを押します P1を設定します.仮想レーザーポイントは自動的にウェルFに移動します。 電極F5でこのプロセスを繰り返し、 セットP2を選択します。
5. この手順の後、レーザーポイントはウェルBに移動します。 電極B5で同じプロセスを繰り返し、ソフトウェアの セットP3 を押します。これで、システムが調整されました。
6. 細胞のニーズに応じてレーザー出力と処理時間を調整します。ここでは、40%の電力と25%の処理時間が使用されました。
7. レーザーを有効にするには、[レーザーオフ]ボタンをクリックすると、 レーザー オンとして表示されます。録音ソフトウェアに切り替えてファイル名を選択し、 赤い録音 ボタンをクリックしてから、ウィンドウ 上部の再生ボタンをクリックして 測定値を記録します。
8. レーザーでセルを開く前に60秒のベースラインを記録します。初期化ソフトウェアに切り替えます。
9. 右側の仮想マップ上のレーザーによって除外される電極をCtrl+マウスクリックで非アクティブ化します。目的の電極をソフトウェアウィンドウの右側にあるアレイ表示でアクティブにして選択します。
10. レーザーを開始するには、Alt +マウスクリックを使用して、このウェルの中心電極を選択します。これにより、レーザーが開始され、このウェルの各電極のセルが自動的に開きます。ウェルごとに繰り返します。レーザーは、選択したウェルの以前にアクティブ化されたすべての電極を自動的に開きます。

4.薬物の取り扱いと適用

1. 薬物検査に使用するすべての物質は、測定当日に新鮮に準備してください。最終適用濃度が培地の10倍であることを確認して、ウェル内で1:10に希釈します。
2. ニフェジピン、E4031、およびドフェチリドを最初にDMSOにmM濃度で溶解し、次にさらに培地に溶解して所望の濃度の10倍にします。ウェル内の最終DMSO濃度0.1%を超えないようにしてください。
3. ベースラインアクティビティを60秒間記録します。プロトコルのステップ3で説明されているようにレーザー誘起ポレーションを開始し、FPをliAP形状に変換します。
4. すべての薬をウェルあたりの単一濃度として適用します。6ウェルMEAの場合はウェルあたり20 μL、シングルウェルMEAの場合は100 μLの培地を除去します。MEAの種類に応じて、測定する薬物のストック溶液を20 μLまたは100 μLウェルに加え、慎重にピペットで上下に2〜3回行います。統計的関連性を達成するために、各薬物および濃度の少なくとも3回の複製を実行する。
5. コンパウンドを300秒間洗い流します。この間、liAP形状がFP形状に戻る場合があります。繰り返しになりますが、レーザー誘発性ポレーションを誘発し、liAPに対する化合物誘発効果の可能性をさらに60秒間記録します。

5. データのエクスポート

1. 録音ソフトウェアで録音を再生して、関連する電極を選択します。MC_DataToolを使用して、MC_Rack ファイルを ASCII .txt ファイルに変換します。
2. [ファイル]をクリックして>MCDを開き>MC_Rackファイルを選択します。txtボタン(青いテキスト)をクリックします。
3. 電極を選択します。選択した電極が右側のリストに表示されます。
4. [ 参照 ]をクリックしてフォルダを選択し、新しい.txtファイルの名前を変更します。[ 保存]をクリックします。
5. エクスポートした電極の選択を解除し、エクスポートする次の電極を選択します。目的のすべての電極に対して手順を繰り返します。

6. データの取り扱いと統計分析

1. 変換されたバイナリトレースを^R19にインポートします。次のパッケージを含むカスタムメイドのスクリプトを使用して、データを視覚化/分析します:dplyr、tidyr、およびggplot2^20,21,22。

Discussion

この革新的な方法は、心活性薬理学的ツール化合物の適用中の心臓活動電位の薬理学的調節を in vitro で調査する新しい方法を示しています。

古典的なMEA記録は、心臓^AP14の派生物であるFP記録を可能にする。この間接的な記録により、脱分極と再分極の時間経過が複雑になり、AP の本質的な特性が排除されます。さらに、APの経細胞間電圧変化は通常約100mVの値に達しますが、全体のFP振幅は比較的低く、ピーク振幅は数100μVから1桁のmV値の間にあります。記録原理により、再分極位相は小さい。多くの場合、それは単に検出可能であり、しばしば不明確な形状であるため、FPの終わりを定義することは困難です。細胞膜の開口部により、細胞内電圧へのアクセスが可能になり、それによって心臓APの時間経過が明らかになります。FP記録と比較して、この記録方法には複数の利点があります。まず、信号振幅がより顕著になり、優れた信号対雑音比を提供します。第二に、波形は再分極の検出をより良くします。第三に、再分極相の形状は、信号緩和の急峻さによって提供される試験化合物の作用機序への洞察に寄与する。そして最後に、この方法は、図6に示されているように、LIAPでは発生するがFPでは発生しないEADの発生について図 6 に示されているように、重大な薬物副作用を検出するための感度が向上しています。

これまでのところ、細胞内APにアクセスする方法は2つあります。第1のものは、エレクトロポレーション^26,27によって達成される。ここで、記録電極を介して印加される短くて強い電圧パルスは、細胞膜²⁸を開くことができる。第2の可能性は、表面プラズモン共鳴という物理現象を利用したレーザーパルスによる膜開口です。エレクトロポレーションと比較した利点の1つは、連続した開口部の可能性が高いことです。高度に集束されたレーザースポット(1〜3μm)のため、この効果は目的の電極に非常に局所的に制限されます。興味深いことに、liAPの開始は、培養されたシンシチウムのシグナル伝播を変えませんでした。これは、細胞の完全性が損なわれているが、心筋細胞が膜の穴を介して脱分極していないように見えることを示しています。

この方法には制限があります。エレクトロポレーションと同様に、膜の開口部は、ほとんどの場合、実験コース全体にわたって持続しません。目的の特定の細胞タイプの安定した開口部に必要なレーザーパルスの最小パワーと持続時間の設定は、実験の前に独立して定義する必要があります。我々は、パラメータが異なる細胞タイプ(我々の場合、いくつかのhiPS由来および初代心筋細胞)間で劇的に異なることを見出した(図示せず)。これにより、化合物試験実験中の細胞への不必要なストレスを回避し、より信頼性が高く再現性の高いデータが得られます。セルと電極に明確に焦点を合わせるためにz軸を調整することは非常に重要です。焦点の合っていないカメラ画像は、最適ではないレベルにあるレーザースポットを生成し、細胞膜を開くことができない可能性があります。パラメータを最適に調整しても、liAP効果は過渡的であり、振幅は時間とともに減少します。さらに、細胞の細胞内空間へのアクセスは、同じ電極の連続した開口部内および電極間の両方で、liAP誘導間で変化する。これにより、LiAP振幅の変動性が高くなります。その理由はまだ完全には理解されていません。考えられる説明には、レーザー焦点のドリフトや膜開口部の異なる細胞内局在などの機械的問題が含まれます。これにより、この時点では、試験化合物の振幅効果の分析が複雑になります。また、MEAシステムによる電気的活動の記録には、避けられないベースラインドリフトを補償するためのハイパスフィルタリングが必要です。ここで使用したシステムでは、このフィルタリングは0.1 Hz(このシステムで利用可能な最も低いフィルター設定)に設定されていましたが、プラトー期中のフィルタリング効果は依然として見られ、その結果、心臓APのプラトー期にはベースラインへの電圧偏向の傾向が遅くなりました。これは、ここで使用されているiPS細胞由来のiCell心筋細胞² のように、制御条件下ですでに>700ミリ秒のAPを生成している、非常に長い基盤となるAPで特に問題になります。フィルタリングの低いシステムを使用すると、AP の形状をより適切に保存し、再分極フェーズの時間経過へのアクセスがさらに向上する可能性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 well MEA chip	Multi Channel Systems MCS GmbH	890301
6 well MEA chip	Multi Channel Systems MCS GmbH	7600069
DMSO	Merck KGaA	20-139 Sigma-Aldrich	solvent for drugs
Dofetilide	ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS	D-100	Drug-Measurement
dPBS	Fisher Scientific GmbH	12037539	Coating
E4031	ALOMONE LABS ISRAEL HEADQUARTERS	E-500	Drug-Measurement
Falcon	Fisher Scientific GmbH	10788561
FB Alps version 0.5.005	Foresee Biosystems
Fibronectin	Merck KGaA	11051407001	Coating
iCell cardiomyocytes	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)	C1016
IntraCell	Foresee Biosystems
IntraCell	Foresee Biosystems
Isopropanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	CN09.1	For cleaning of MEA contact pads
Maintenance Medium	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)	#M1003	For cell-culture
MC_Data Tool	Multi Channel Systems MCS GmbH		Data export
MC_Rack	Multi Channel Systems MCS GmbH		MEA recording
MEA 2100 - 2x60 - system	Multi Channel Systems MCS GmbH	890485	For MEA-recordings
Nifedipine	Merck KGaA	N7634 Sigma-Aldrich	Drug-Measurement
Plating Medium	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)	M1001	For cell-culture
Tergazyme	VWR International, LLC	1304-1	cleaning of MEAs