Etablierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms und des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll etabliert und charakterisiert ein patientenabgeleitetes Xenotransplantat-Modell (PDX) für anaplastisches Schilddrüsenkarzinom (ATC) und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC), da PDX-Modelle schnell zum Standard im Bereich der translationalen Onkologie werden.

Zusammenfassung

Patient-derived xenograft (PDX)-Modelle bewahren die histologischen und genetischen Merkmale des Primärtumors und bewahren seine Heterogenität. Pharmakodynamische Ergebnisse, die auf PDX-Modellen basieren, korrelieren stark mit der klinischen Praxis. Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist die bösartigste Subform des Schilddrüsenkarzinoms mit starker Invasivität, schlechter Prognose und begrenzter Behandlung. Obwohl die Inzidenzrate von ATC nur 2%-5% des Schilddrüsenkrebses ausmacht, liegt die Sterblichkeitsrate bei 15%-50%. Das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist mit über 600.000 Neuerkrankungen weltweit eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen des Kopfes und Halses. Im Folgenden werden detaillierte Protokolle vorgestellt, um PDX-Modelle von ATC und HNSCC zu erstellen. In dieser Arbeit wurden die Schlüsselfaktoren, die die Erfolgsrate der Modellkonstruktion beeinflussen, analysiert und die histopathologischen Merkmale zwischen dem PDX-Modell und dem Primärtumor verglichen. Darüber hinaus wurde die klinische Relevanz des Modells validiert, indem die in vivo therapeutische Wirksamkeit repräsentativer klinisch eingesetzter Medikamente in den erfolgreich konstruierten PDX-Modellen evaluiert wurde.

Einleitung

Das PDX-Modell ist ein Tiermodell, bei dem menschliches Tumorgewebe in immundefiziente Mäuse transplantiert wird und in der von den Mäusen bereitgestellten Umgebung wächst¹. Herkömmliche Tumorzelllinienmodelle leiden unter mehreren Nachteilen, wie z. B. der mangelnden Heterogenität, der Unfähigkeit, die Tumormikroumgebung zu erhalten, der Anfälligkeit für genetische Variationen während wiederholter In-vitro-Passagen und der schlechten klinischen Anwendung ^2,3. Die Hauptnachteile gentechnisch veränderter Tiermodelle sind der potenzielle Verlust der genomischen Merkmale menschlicher Tumore, die Einführung neuer unbekannter Mutationen und die Schwierigkeit, den Grad der Homologie zwischen Maustumoren und menschlichen Tumoren zu bestimmen⁴. Hinzu kommt, dass die Herstellung gentechnisch veränderter Tiermodelle teuer, zeitaufwendig und relativ ineffizient ist⁴.

Das PDX-Modell hat gegenüber anderen Tumormodellen viele Vorteile in Bezug auf die Widerspiegelung der Tumorheterogenität. Aus histopathologischer Sicht ersetzt das Maus-Pendant zwar im Laufe der Zeit das menschliche Stroma, aber das PDX-Modell bewahrt die morphologische Struktur des Primärtumors gut. Darüber hinaus bewahrt das PDX-Modell die metabolomische Identität des Primärtumors für mindestens vier Generationen und spiegelt die komplexen Wechselbeziehungen zwischen Tumorzellen und ihrer Mikroumgebung besser wider, was es einzigartig in der Simulation von Wachstum, Metastasierung, Angiogenese und Immunsuppression von menschlichem Tumorgewebe macht ^5,6,7. Auf zellulärer und molekularer Ebene spiegelt das PDX-Modell die Heterogenität zwischen und innerhalb des Tumors menschlicher Tumore sowie die phänotypischen und molekularen Merkmale des ursprünglichen Krebses genau wider, einschließlich Genexpressionsmuster, Mutationsstatus, Kopienzahl sowie DNA-Methylierung und Proteomik ^8,9. PDX-Modelle mit unterschiedlichen Passagen weisen die gleiche Sensitivität gegenüber medikamentöser Therapie auf, was darauf hindeutet, dass die Genexpression von PDX-Modellen sehr stabil ist^10,11. Studien haben eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem Ansprechen des PDX-Modells auf ein Medikament und dem klinischen Ansprechen der Patienten auf dieses Medikament gezeigt^12,13. Daher hat sich das PDX-Modell zu einem leistungsstarken präklinischen und translationalen Forschungsmodell entwickelt, insbesondere für das Wirkstoffscreening und die Vorhersage klinischer Prognosen.

Schilddrüsenkrebs ist ein häufiger bösartiger Tumor des endokrinen Systems und eine bösartige Erkrankung des Menschen, deren Inzidenz in den letzten Jahren rapide zugenommen hat¹⁴. Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist mit einer medianen Überlebenszeit von nur 4,8 Monaten der bösartigste Schilddrüsenkrebs¹⁵. Obwohl in China jedes Jahr nur bei einer Minderheit der Schilddrüsenkrebspatienten ATC diagnostiziert wird, liegt die Sterblichkeitsrate bei fast 100 %16,17,18. ATC wächst in der Regel schnell und dringt in das angrenzende Gewebe des Halses sowie in die zervikalen Lymphknoten ein, und etwa die Hälfte der Patienten hat Fernmetastasen^19,20. Das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist die sechsthäufigste Krebserkrankung der Welt und eine der häufigsten Krebstodesursachen, wobei jedes Jahr schätzungsweise 600.000 Menschen an HNSCC erkranken^21,22,23. Das HNSCC umfasst eine große Anzahl von Tumoren, darunter solche in der Nase, den Nasennebenhöhlen, dem Mund, den Mandeln, dem Rachen und dem Kehlkopf²⁴. ATC und HNSCC sind zwei der wichtigsten Malignome von Kopf und Hals. Um die Entwicklung neuartiger Therapeutika und personalisierter Behandlungen zu erleichtern, ist es notwendig, robuste und fortschrittliche präklinische Tiermodelle wie PDX-Modelle von ATC und HNSCC zu entwickeln.

In diesem Artikel werden detaillierte Methoden zur Etablierung des subkutanen PDX-Modells von ATC und HNSCC vorgestellt, die Schlüsselfaktoren analysiert, die die Tumoraufnahmerate in der Modellkonstruktion beeinflussen, und die histopathologischen Charakteristika zwischen dem PDX-Modell und dem Primärtumor verglichen. Währenddessen wurden in vivo pharmakodynamische Tests unter Verwendung der erfolgreich konstruierten PDX-Modelle durchgeführt, um deren klinische Relevanz zu validieren.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des West China Hospital der Universität Sichuan genehmigt wurden. Für die vorliegende Studie wurden immundefiziente NOD-SCID-Mäuse im Alter von 4-6 Wochen (beiderlei Geschlechts) und weibliche Balb/c-Nacktmäuse im Alter von 4-6 Wochen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle). Die Ethikkommission des West China Hospital genehmigte die Studie mit menschlichen Probanden (Protokollnummer 2020353). Jeder Patient gab eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Ordnen Sie Einwegklingen, sterilisierte Scheren und Pinzetten und andere für die Tumortransplantation erforderliche Instrumente an, legen Sie sie auf die ultrareine Werkbank und bestrahlen Sie sie im Voraus mit ultraviolettem Licht.
2. Bereiten Sie sterile Kochsalzlösung und Petrischalen für die Verwendung während des Tests vor.

2. Gewinnung und Transport von frischem Tumorgewebe

1. Frische Tumorproben (in der Regel größer als 5 mm x 5 mm) aus dem Operationssaal entnehmen und in ein 15-ml- oder 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit steriler HTK-Lösung (siehe Materialtabelle) oder Kochsalzlösung geben. Beschriften Sie die Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Frische Tumorproben wurden durch chirurgische Entfernung oder Punktion von Patienten mit ATC oder HNSCC gewonnen.
2. Stellen Sie die Zentrifugenröhrchen in eine im Voraus vorbereitete Eisbox.
   HINWEIS: Während dieser Zeit muss der Transplantationsarzt die für die Transplantation erforderlichen Gegenstände vorbereiten (siehe Materialtabelle).
3. Stellen Sie sicher, dass die Zeit zwischen der Probenentnahme und dem Transport zum Labor für die PDX-Konstruktion 2 Stunden nicht überschreitet. Umgeben Sie die Röhrchen, die das Gewebe enthalten, während des Transports mit einem Eis-Wasser-Gemisch oder Eisbeuteln, um die Gewebeaktivität zu erhalten.

3. Tumortransplantation

1. Sobald das Tumorgewebe im Labor angekommen ist, wird es aufgezeichnet und neu nummeriert.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden die Patienteninformationen streng vertraulich behandelt. Die restlichen Schritte des Verfahrens wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Beim Betreten des Labors wird empfohlen, einen Kittel über der Arbeitskleidung oder Schutzkleidung, einen Hut und eine Maske zu tragen. Die Behandlung des Tumorgewebes erfolgt in einer Biosicherheitswerkbank.
2. Desinfizieren Sie die Zentrifugenröhrchen mit dem Tumorgewebe mit 75%igem Alkohol und legen Sie sie auf den OP-Tisch. Das Tumorgewebe wird mit einer sterilisierten Augenzange in 6 cm dicke, mit Kochsalzlösung gefüllte Petrischalen überführt. Schneiden Sie sie anschließend mit einer Klinge in kleine Stücke von ca. 2 mm x 2 mm und 3 mm x 3 mm.
3. Übertragen Sie die Stücke des Tumorgewebes in eine 6-cm-Petrischale mit der entsprechenden Menge Kochsalzlösung, wickeln Sie die Schale mit der Siegelfolie ein, stellen Sie sie in eine Eisbox und tragen Sie sie zusammen mit den erforderlichen Instrumenten (Schere, Pinzette und Impfnadeln) in den speziellen erregerfreien Tierraum (SPF).
4. Bereiten Sie das Tier vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Entfernen Sie die Haare am rechten seitlichen Thorax von 4-6 Wochen alten weiblichen oder männlichen immundefizienten NOD-SCID-Mäusen und desinfizieren Sie die Haut mit 75%igem Alkohol. Betäuben Sie die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin (siehe Materialtabelle) und schmieren Sie ihre Augen mit Tierarztsalbe ein, um Trockenheit zu verhindern. Bestätigen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust des Pedalreflexes.
   2. Machen Sie einen 2-mm-Schnitt mit einer Schere durch die Haut in der Mitte des rechten seitlichen Brustkorbs von Mäusen.
5. Nehmen Sie ein Tumorstück aus der Petrischale und legen Sie es mit einer Pinzette in die 2,4 mm x 2,0 mm große Trokarnadel (siehe Materialtabelle).
6. Halten Sie die Maus fest, straffen Sie die Haut an der Einstichstelle, führen Sie den Tumor mit dem Trokar mit den Tumorstücken durch den ersten 2 mm Hautschnitt ein, bewegen Sie sich auf die Rückseite der Schulter und schieben Sie den Trokarkern.
7. Stellen Sie sicher, dass das Tumorstück herausgedrückt wird und in der durch die Trokarpunktion gebildeten Übergangshöhle verbleibt, und ziehen Sie dann den Trokar heraus.
8. Wenn sich der Tumor beim Herausziehen mit der Nadel bewegt, verwenden Sie den Trokar, um ihn zurückzusetzen und den Schnitt zu vernähen.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde jede Maus an den dorsalen Vorder- und Hinterbeinen geimpft. Pro Tumorprobe wurden von jedem Patienten ein bis drei Mäuse geimpft, basierend auf der Tumorgröße.

4. Konservierung, Fixierung und Einfrieren von Tumorgewebe

HINWEIS: Das verbleibende Tumorgewebe wurde für die Konservierung von Samen, die Fixierung bzw. das Einfrieren von DNA/RNA/Proteinen verwendet.

1. Entfernen Sie die Kochsalzlösung mit einer sterilen Gaze von der Tumoroberfläche, bevor Sie sie in das Kryokonservierungsröhrchen legen, um sicherzustellen, dass die Tumoroberfläche nicht übermäßig nass wird.
2. Geben Sie vier bis sechs Stücke von 2 mm x 2 mm Tumorgewebe in ein 2-ml-Zellkryokonservierungsröhrchen, geben Sie 1 ml Kryokonservierungslösung, die zu 90 % aus fötalem Knöberserum (FBS) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) besteht, in das Röhrchen, legen Sie das Röhrchen in eine Gradientenkühlbox, frieren Sie es über Nacht bei −80 °C ein und schließen Sie es Übertragen Sie es in flüssigen Stickstoff.
3. Legen Sie die 3 mm x 3 mm großen Tumorgewebeblöcke in 10%iges gepuffertes Formalin zur Gewebefixierung für die pathologische Untersuchung.
4. Legen Sie den 3 mm x 3 mm großen Gewebeblock in ein 2-ml-Zellkryokonservierungsröhrchen, frieren Sie ihn schnell in flüssigem Stickstoff ein und stellen Sie ihn dann zur DNA/RNA- und Proteinextraktion in einen Kühlschrank mit einer Temperatur von −80 °C.
5. Sammeln Sie die klinischen Informationen der Patienten, wie z. B. die Raucheranamnese, die Tumorgröße, die Differenzierung, den pathologischen Subtyp, den Krebsgrad, das Krebsstadium, die Fernmetastasen, die Herkunft, die Krankengeschichte, die Immunhistochemie, die Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) bei HNSCC-Patienten und die Behandlungsmedikation.

5. Passierung, Kryokonservierung und Reanimation von PDX-Modelltumoren

1. Messen Sie die Länge und Breite der subkutanen Tumore bei Mäusen einmal pro Woche mit Nonius-Messschiebern und berechnen Sie das Tumorvolumen nach der Formel: Tumorvolumen = 0,5 × Länge × Breite². Zeichne die Tumorwachstumskurve.
2. Wenn der PDX-Tumor 2.000 mm³ erreicht, wird er an die nächste Generation von Mäusen weitergegeben und eine erneute Tumortransplantation durchgeführt. Führen Sie die Vorbereitung der Instrumente gemäß Schritt 4 durch.
3. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation nach Betäubung mit 80 mg/kg Ketamin.
4. Desinfizieren Sie die Haut mit 75%igem Alkohol. Schneiden Sie dann die Haut, die den Tumor umgibt, mit einer Schere ab, entfernen Sie den Tumor mit einer Pinzette und legen Sie ihn in eine Petrischale.
5. Führen Sie die Tumortransplantation nach Schritt 3 durch.
6. Führen Sie die Konservierung und Kryokonservierung der PDX-Modelltumoren gemäß Schritt 4 durch.
7. Für die Wiederbelebung des Tumorgewebes gilt das Prinzip des langsamen Einfrierens und der schnellen Auflösung. Nachdem Sie die Kryogefäße aus flüssigem Stickstoff entnommen haben, legen Sie sie schnell in ein Wasserbad bei 37 °C, um sie schnell aufzulösen.
8. Schütteln Sie die Kryogefäße vorsichtig im Wasserbad, um den Auftauprozess zu beschleunigen.
9. Tauen Sie die Tumorstücke auf, geben Sie sie zum Waschen in die vorbereitete normale Kochsalzlösung und impfen Sie dann die nächste Generation von Mäusen. Für die spezifische Operation lesen Sie bitte das Gewebetransplantationsverfahren in Schritt 3.

6. Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Lenvatinib und Cisplatin im ATC-PDX-Modell

HINWEIS: Das ATC-PDX-Modell wurde verwendet, um die therapeutische Wirkung des Tyrosinkinase-Inhibitors Lenvatinib und des Chemotherapeutikums Cisplatin^25,26,27 zu testen.

1. Wählen Sie das Tumorgewebe der P5-Generation eines ATC-PDX-Modells (THY-017) aus, schneiden Sie es in 2-4^{mm 3} Gewebestücke und inokulieren Sie subkutan (Schritt 3) auf den rechten Rücken von zehn 4-6 Wochen weiblichen Balb/c-Nacktmäusen.
2. Wählen Sie 15 Mäuse mit einem Tumorvolumen zwischen 50 und 150^mm3 aus und teilen Sie sie in drei Gruppen ein.
3. Verabreichen Sie einer Gruppe 15 Tage lang einmal täglich intragastrisch Lenvatinib (10 mg/kg), einer Gruppe alle 3 Tage alle 3 Tage intraperitoneal Cisplatin (3 mg/kg) für insgesamt sechs Dosen und der Kontrollgruppe das gleiche Volumen normaler Kochsalzlösung.
4. Messen Sie zweimal pro Woche das Körpergewicht und das Tumorvolumen der Mäuse.
5. Am Ende des Tests werden die Mäuse eingeschläfert (Schritt 5.3) und die Tumore gewogen.

Ergebnisse

Insgesamt wurden 18 Schilddrüsenkrebsproben transplantiert und fünf PDX-Modelle für Schilddrüsenkrebs erfolgreich konstruiert (27,8 % Tumorentnahmerate), darunter vier Fälle von undifferenziertem Schilddrüsenkrebs und ein Fall von anaplastischem Schilddrüsenkrebs. Der Zusammenhang zwischen der Erfolgsrate der Modellkonstruktion und dem Alter, dem Geschlecht, dem Tumordurchmesser, dem Tumorgrad und der Differenzierung wurde analysiert. Obwohl die Modellerfolgsrate von Tumorproben Grad 4 höher war als bei Proben mi...

Diskussion

In dieser Studie konnten die subkutanen PDX-Modelle von ATC und HNSCC erfolgreich etabliert werden. Es gibt viele Aspekte, auf die beim Bau von PDX-Modellen geachtet werden muss. Wenn das Tumorgewebe vom Patienten getrennt wird, sollte es so schnell wie möglich in die Eisbox gelegt und zur Impfung ins Labor geschickt werden. Nachdem der Tumor im Labor angekommen ist, muss der Bediener auf die Aufrechterhaltung eines sterilen Feldes achten und aseptische Verfahren anwenden. Da das Tumorgewebe bei Nadelbiopsieproben beson...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm x 2.0 mm trocar	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-9065
Balb/c nude mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	401
Biosafety cabinet	Suzhou Antai	BSC-1300IIA2
Blade	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0823
Centrifuge tube	Corning	430791/430829
Cryopreservation tube	Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd	/
Custodiol HTK-Solution	Custodiol	2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	SIGMA-ALORICH	D5879-500mL
Electronic balance	METTLER	ME104
Electronic digital caliper	Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd	0-220
fetal bovine serum(FBS)	VivaCell	C04001-500
IBM SPSS Statistics 26	IBM
Ketamine	Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd	100761663
Lenvatinib	ApexBio	A2174
NOD SCID immunodeficient mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	406
Pen-Strep Solution	Biological Industries	03-03101BCS
Petri dish	WHB	WHB-60/WHB-100
Saline	Sichuan Kelun	W220051705
Scissor	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0110
Tweezer	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-1241
Vet ointment	Pfizer Inc.	P10015353
Xylazine	Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd	070031777