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Resumo

O presente protocolo estabelece e caracteriza um modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) de carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) e carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP), uma vez que os modelos PDX estão rapidamente se tornando o padrão no campo da oncologia translacional.

Resumo

Os modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) preservam fielmente as características histológicas e genéticas do tumor primário e mantêm sua heterogeneidade. Os resultados farmacodinâmicos baseados em modelos PDX são altamente correlacionados com a prática clínica. O carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) é o subtipo mais maligno de câncer de tireoide, com forte invasividade, prognóstico ruim e tratamento limitado. Embora a taxa de incidência de ATC seja responsável por apenas 2%-5% do câncer de tireoide, sua taxa de mortalidade é tão alta quanto 15%-50%. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é uma das neoplasias malignas mais comuns de cabeça e pescoço, com mais de 600.000 novos casos em todo o mundo a cada ano. Neste trabalho, são apresentados protocolos detalhados para estabelecer modelos PDX de ATC e CECP. Neste trabalho, os principais fatores que influenciam a taxa de sucesso de construção do modelo foram analisados, e as características histopatológicas foram comparadas entre o modelo PDX e o tumor primário. Além disso, a relevância clínica do modelo foi validada pela avaliação da eficácia terapêutica in vivo de fármacos representativos de uso clínico nos modelos PDX construídos com sucesso.

Introdução

O modelo PDX é um modelo animal no qual o tecido tumoral humano é transplantado em camundongos imunodeficientes e cresce no ambiente fornecido pelos camundongos1. Os modelos tradicionais de linhagens celulares tumorais sofrem de várias desvantagens, como a falta de heterogeneidade, a incapacidade de reter o microambiente tumoral, a vulnerabilidade a variações genéticas durante repetidas passagens in vitro e a pobre aplicaçãoclínica2,3. As principais desvantagens dos modelos animais geneticamente modificados são a perda potencial das características genômicas dos tumores humanos, a introdução de novas mutações desconhecidas e a dificuldade em identificar o grau de homologia entre tumores de camundongos e tumoreshumanos4. Além disso, a preparação de modelos animais geneticamente modificados é cara, demorada e relativamente ineficiente4.

O modelo PDX tem muitas vantagens sobre outros modelos tumorais em termos de refletir a heterogeneidade tumoral. Do ponto de vista histopatológico, embora a contraparte do camundongo substitua o estroma humano ao longo do tempo, o modelo PDX preserva bem a estrutura morfológica do tumor primário. Além disso, o modelo PDX conserva a identidade metabolômica do tumor primário por pelo menos quatro gerações e reflete melhor as complexas inter-relações entre as células tumorais e seu microambiente, tornando-o único na simulação do crescimento, metástase, angiogênese e imunossupressão do tecido tumoralhumano5,6,7. Em nível celular e molecular, o modelo PDX reflete com precisão a heterogeneidade inter e intratumoral de tumores humanos, bem como as características fenotípicas e moleculares do câncer original, incluindo padrões de expressão gênica, status de mutação, número de cópias, metilação e proteômica do DNA 8,9. Modelos PDX com passagens diferentes têm a mesma sensibilidade à terapia medicamentosa, indicando que a expressão gênica de modelos PDX é altamente estável10,11. Estudos têm demonstrado excelente correlação entre a resposta do modelo PDX a um fármaco e as respostas clínicas dos pacientes a esse fármaco12,13. Portanto, o modelo PDX emergiu como um poderoso modelo de pesquisa pré-clínica e translacional, particularmente para triagem de drogas e predição de prognóstico clínico.

O câncer de tireoide é um tumor maligno comum do sistema endócrino e é uma neoplasia maligna humana que tem mostrado um rápido aumento na incidência nos últimosanos14. O carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) é o câncer mais maligno da tireoide, com sobrevida mediana de apenas 4,8meses15. Embora apenas uma minoria dos pacientes com câncer de tireoide seja diagnosticada com ATC a cada ano na China, a taxa de mortalidade é próxima de 100%16,17,18. A ATC geralmente cresce rapidamente e invade os tecidos adjacentes do pescoço, bem como os linfonodos cervicais, e cerca de metade dos pacientes apresenta metástases àdistância19,20. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto câncer mais comum no mundo e uma das principais causas de morte por câncer, estimando-se que 600.000 pessoas sofram de CEC de cabeça e pescoço a cada ano21,22,23. O CEC de cabeça e pescoço inclui um grande número de tumores, incluindo nariz, seios da face, boca, amígdalas, faringe e laringe24. ATC e CEC de cabeça e pescoço são duas das principais neoplasias malignas de cabeça e pescoço. Para facilitar o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e tratamentos personalizados, é necessário desenvolver modelos animais pré-clínicos robustos e avançados, como os modelos PDX de ATC e HNSCC.

Este artigo apresenta métodos detalhados para estabelecer o modelo PDX subcutâneo de ATC e CEC de cabeça e pescoço, analisa os principais fatores que afetam a taxa de tomada tumoral na construção do modelo e compara as características histopatológicas entre o modelo PDX e o tumor primário. Enquanto isso, neste trabalho, testes farmacodinâmicos in vivo foram realizados utilizando os modelos PDX construídos com sucesso para validar sua relevância clínica.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do West China Hospital, Sichuan University. Camundongos imunodeficientes NOD-SCID com idade entre 4-6 semanas de idade (de ambos os sexos) e camundongos fêmeas Balb/c nude com idade entre 4-6 semanas foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). O comitê de ética do West China Hospital autorizou o estudo com seres humanos (protocolo número 2020353). Cada paciente assinou o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Preparação experimental

  1. Arrume lâminas descartáveis, tesouras e pinças esterilizadas e outros instrumentos necessários para o transplante de tumor, coloque-os na bancada ultralimpa e irradie-os com luz ultravioleta com antecedência.
  2. Preparar soro fisiológico estéril e placas de Petri para uso durante o teste.

2. Aquisição e transporte de tecido tumoral fresco

  1. Obter amostras tumorais frescas (geralmente maiores que 5 mm x 5 mm de tamanho) da sala de cirurgia e colocá-las em um tubo centrífugo de 15 mL ou 50 mL contendo solução HTK estéril (ver Tabela de Materiais) ou soro fisiológico. Rotule os tubos de centrífuga.
    OBS: Amostras tumorais frescas foram obtidas por remoção cirúrgica ou punção de pacientes com CTA ou CEC de cabeça e pescoço.
  2. Coloque os tubos da centrífuga em uma caixa de gelo preparada com antecedência.
    NOTA: Durante este tempo, o operador de transplante deve preparar os itens necessários para o transplante (ver Tabela de Materiais).
  3. Certifique-se de que o tempo entre a coleta da amostra e o transporte para o laboratório para a construção do PDX não exceda 2 h. Durante o transporte, envolva os tubos que contêm os tecidos com uma mistura de água gelada ou bolsas de gelo para preservar a atividade do tecido.

3. Transplante de tumor

  1. Assim que os tecidos tumorais chegarem ao laboratório, registre-os e renumere-os.
    OBS: Para o presente estudo, as informações dos pacientes foram mantidas em absoluto sigilo. As demais etapas do procedimento foram realizadas em laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2). Ao entrar no laboratório, recomenda-se o uso de um smock sobre a roupa de trabalho ou de proteção, um chapéu e uma máscara. O tratamento do tecido tumoral é realizado em um gabinete de biossegurança.
  2. Desinfetar os tubos de centrífuga contendo os tecidos tumorais com álcool 75% e colocá-los na mesa de operação. Transfira os tecidos tumorais para placas de Petri de 6 cm preenchidas com soro fisiológico utilizando pinça oftálmica esterilizada. Em seguida, corte-os em pequenos pedaços de cerca de 2 mm x 2 mm e 3 mm x 3 mm usando uma lâmina.
  3. Transfira os pedaços de tecidos tumorais para uma placa de Petri de 6 cm contendo a quantidade adequada de soro fisiológico, envolva a placa com o filme selante, coloque-a em uma caixa de gelo e leve-a para a sala de animais específica livre de patógenos (FPS) juntamente com os instrumentos necessários (uma tesoura, pinça e agulhas de inoculação).
  4. Prepare o animal seguindo os passos abaixo.
    1. Remova os pelos no tórax lateral direito de camundongos imunodeficientes NOD-SCID fêmeas ou machos de 4-6 semanas de idade e desinfete a pele com álcool a 75%. Anestesiar os ratos através de uma injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina (ver Tabela de Materiais) e manchar os olhos com pomada veterinária para evitar o ressecamento. Confirme a profundidade da anestesia através da perda do reflexo pedal.
    2. Faça uma incisão de 2 mm com tesoura através da pele no meio do tórax lateral direito de camundongos.
  5. Pegue um pedaço de tumor da placa de Petri e coloque-o na agulha do trocarte de 2,4 mm x 2,0 mm (ver Tabela de Materiais) com pinças.
  6. Segure o rato, aperte a pele no local da punção, use o trocarte contendo as peças do tumor para inserir o tumor através da incisão inicial de 2 mm na pele, mova-se para a parte de trás do ombro e empurre o núcleo do trocarte.
  7. Certifique-se de que o pedaço do tumor seja empurrado para fora e seja deixado no seio transicional formado pela punção do trocarte e, em seguida, puxe o trocarte.
  8. Se o tumor se mover com a agulha quando for retirado, use o trocarte para resetá-lo e suturar a incisão.
    OBS: Neste estudo, cada camundongo foi inoculado nos membros dorsais anteriores e posteriores. Um a três camundongos foram inoculados por amostra tumoral de cada paciente com base no tamanho do tumor.

4. Preservação, fixação e congelamento de tecidos tumorais

OBS: Os demais tecidos tumorais foram utilizados para preservação, fixação e congelamento de DNA/RNA/proteínas, respectivamente.

  1. Remova o soro fisiológico da superfície do tumor com uma gaze estéril antes de colocá-lo no tubo de criopreservação para garantir que a superfície do tumor não esteja excessivamente úmida.
  2. Colocar quatro a seis pedaços de tecido tumoral de 2 mm x 2 mm em um tubo de criopreservação de células de 2 mL, adicionar 1 mL de solução de criopreservação composta de soro fetal bovino (FBS) a 90% e dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% no tubo, colocar o tubo em uma caixa de resfriamento gradiente, congelá-lo a -80 °C durante a noite e, finalmente, transferi-lo para nitrogênio líquido.
  3. Colocar os blocos de tecido tumoral de 3 mm x 3 mm em formalina tamponada a 10% para fixação do tecido para exame anatomopatológico.
  4. Coloque o bloco de tecido de 3 mm x 3 mm em um tubo de criopreservação de células de 2 mL, congele-o rapidamente em nitrogênio líquido e, em seguida, transfira para um refrigerador de -80 °C para extração de DNA/RNA e proteína.
  5. Coletar as informações clínicas dos pacientes, como história tabágica, tamanho do tumor, diferenciação, subtipo patológico, grau de câncer, estádio do câncer, metástase à distância, origem, história clínica, imunohistoquímica, infecção pelo papilomavírus humano (HPV) em pacientes com CEC de cabeça e pescoço e medicação de tratamento.

5. Passaging, criopreserva e ressuscitação de tumores modelo PDX

  1. Medir o comprimento e a largura dos tumores subcutâneos em camundongos usando paquímetro vernier uma vez por semana e calcular o volume tumoral de acordo com a fórmula: volume tumoral = 0,5 × comprimento × largura2. Desenhar a curva de crescimento do tumor.
  2. Quando o tumor PDX atingir 2.000 mm3, passe-o para a próxima geração de camundongos e realize o retransplante do tumor. Realizar a preparação dos instrumentos seguindo o passo 4.
  3. Eutanásia dos camundongos por deslocamento cervical após anestesia com 80 mg/kg de cetamina.
  4. Desinfetar a pele com álcool a 75%. Em seguida, corte a pele ao redor do tumor usando uma tesoura, depois remova o tumor com pinça e coloque-o em uma placa de Petri.
  5. Realizar o procedimento de transplante de tumor seguindo o passo 3.
  6. Realizar a preservação e criopreservação dos tumores modelo PDX seguindo o passo 4.
  7. Para a ressuscitação do tecido tumoral, siga o princípio de congelamento lento e dissolução rápida. Depois de retirar os crióvios do azoto líquido, coloque-os rapidamente num banho-maria a 37 °C para uma rápida dissolução.
  8. Agite suavemente os crióvios em banho-maria para acelerar o processo de descongelamento.
  9. Descongelar, transferir os pedaços do tumor para o soro fisiológico preparado para lavagem e, em seguida, inocular a próxima geração de camundongos. Para a operação específica, consulte o procedimento de transplante de tecido na etapa 3.

6. Determinação da eficácia terapêutica do lenvatinibe e da cisplatina no modelo ATC PDX

OBS: O modelo ATC PDX foi utilizado para testar o efeito terapêutico do inibidor de tirosina quinase lenvatinibe e do quimioterápico cisplatina25,26,27.

  1. Selecionar o tecido tumoral da geração P5 de um modelo ATC PDX (THY-017), cortar em pedaços de tecido de 2-4 mm 3 e inocular subcutaneamente (passo3 ) no dorso direito de dez camundongos Balb/c nus fêmeas de 4-6 semanas.
  2. Selecionar 15 camundongos com volumes tumorais entre 50-150 mm3 e dividi-los em três grupos.
  3. Administrar lenvatinib (10 mg/kg) por via intragástrica a um grupo uma vez por dia durante 15 dias, administrar cisplatina (3 mg/kg) por via intraperitoneal a um grupo a cada 3 dias, num total de seis doses, e administrar o grupo controlo com o mesmo volume de solução salina normal.
  4. Medir o peso corporal e o volume tumoral dos ratos duas vezes por semana.
  5. No final do teste, eutanasiar os camundongos (etapa 5.3) e pesar os tumores.

Resultados

Um total de 18 espécimes de câncer de tireoide foram transplantados, e cinco modelos PDX de câncer de tireoide foram construídos com sucesso (taxa de tomada tumoral de 27,8%), incluindo quatro casos de câncer indiferenciado de tireoide e um caso de câncer anaplásico de tireoide. A correlação entre a taxa de sucesso de construção do modelo e a idade, sexo, diâmetro do tumor, grau e diferenciação tumoral foram analisadas. Embora a taxa de sucesso do modelo de amostras tumorais de grau 4 tenha sido maior do qu...

Discussão

Este estudo estabeleceu com sucesso os modelos PDX subcutâneos de ATC e CEC de cabeça e pescoço. Há muitos aspectos a serem observados durante o processo de construção do modelo PDX. Quando o tecido tumoral é separado do paciente, ele deve ser colocado na caixa de gelo e enviado ao laboratório para inoculação o mais rápido possível. Depois que o tumor chega ao laboratório, o operador deve se atentar para manter um campo estéril e praticar procedimentos assépticos. Para amostras de biópsia por agulha, como...

Divulgações

Não são divulgados potenciais conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (Grant Nos. 2019JDRC0019 e 2021ZYD0097), o projeto 1.3.5 para disciplinas de excelência, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. ZYJC18026), o projeto 1.3.5 para disciplinas de excelência-Projeto de Incubação de Pesquisa Clínica, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. 2020HXFH023), os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (SCU2022D025), o Projeto de Cooperação Internacional do Escritório de Ciência e Tecnologia de Chengdu (Processo nº 2022-GH02-00023-HZ), o Projeto Centelha de Inovação da Universidade de Sichuan (Bolsa nº 2019SCUH0015) e o Fundo de Treinamento de Talentos para a Integração de Engenharia Médica do Hospital da China Ocidental - Universidade de Ciência e Tecnologia Eletrônica (Bolsa nº. HXDZ22012).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2.4 mm x 2.0 mm trocarShenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd18-9065
Balb/c nude miceBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.401
Biosafety cabinetSuzhou AntaiBSC-1300IIA2
BladeShenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd18-0823
Centrifuge tube Corning430791/430829
Cryopreservation tubeChengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd/
Custodiol HTK-SolutionCustodiol2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO)SIGMA-ALORICHD5879-500mL
Electronic balanceMETTLERME104
Electronic digital caliperChengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd0-220
fetal bovine serum(FBS)VivaCellC04001-500
IBM SPSS Statistics 26IBM
KetamineJiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd 100761663
LenvatinibApexBioA2174
NOD SCID immunodeficient miceBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.406
Pen-Strep SolutionBiological Industries03-03101BCS
Petri dishWHBWHB-60/WHB-100
Saline Sichuan KelunW220051705
ScissorShenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd18-0110
TweezerShenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd18-1241
Vet ointmentPfizer Inc.P10015353
XylazineDunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd070031777

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