トランスポゾン活性に対するIS200/IS605ファミリー関連TnpBの影響のリアルタイム定量

要約

アクセサリータンパク質TnpBが個々の生きた 大腸菌 細胞の転位のダイナミクスにどのように影響するかを定量化するために、ライブリアルタイムイメージングを実行するためのプロトコルが概説されています。

要約

ここでは、転位に結合された一連の蛍光レポーターを使用して、生細菌細胞における転移因子活性のライブリアルタイムイメージングを実行するためのプロトコルの概要を説明します。特に、トランスポーズ可能なエレメントのIS200/IS605ファミリーのメンバーであるトランスポザブルエレメントIS608の活性に対するアクセサリータンパク質TnpBの影響を評価するために、リアルタイムイメージングをどのように使用できるかを示しています。IS200/IS605ファミリーの転移性エレメントは、自然界に見られる最も無数の遺伝子の1つであるtnpBと結合した豊富な可動エレメントです。配列相同性は、TnpBタンパク質がCRISPR/Cas9システムの進化的前駆体である可能性があることを示唆しています。さらに、TnpBは、Cas様RNA誘導DNAエンドヌクレアーゼとして作用することが示され、新たな関心を集めています。IS608の転位率に対するTnpBの効果は定量化され、IS608のTnpBの発現は、TnpB発現を欠く細胞と比較してトランスポゾン活性を~5倍増加させることが実証されています。

概要

転移要素(TE)は、切除または触媒コピーとそれに続くゲノム再統合によって宿主ゲノム内で動員される遺伝的要素です。TEは生命のすべてのドメインに存在し、転位は宿主ゲノムを再構築し、コード領域と制御領域を変異させます¹。これにより、進化^2,3、発生^4,5、および癌⁷を含むいくつかのヒト疾患⁶において重要な役割を果たす突然変異と多様性が生成されます。

転位活性の側面を蛍光レポーターに結合する新しい遺伝子構築物を使用して、私たちの以前の研究では、広く普及しているIS200/IS605ファミリーのTEファミリーの代表である細菌TE IS608に基づく実験システムの開発について説明しました^。 TE システムを図 1A に示します。TEは、トランスポザーゼコード配列tnpAで構成され、TnpAの認識部位と切除部位である左端(LE)と右端(RE)の不完全な回文反復(IP)が挟まれています。tnpAは、テットリプレッサーによって抑制され、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)⁹で誘導されるプロモーターP_LTetO1を用いて発現されます。TEは、構成的P_lacIQ1プロ^{モーター10の-10}および-35配列を青色レポーターmCerulean3¹¹のために分割する。図1Cに示すように、tnpAの産生が誘導されると、TEを切除することができ、プロモーター再構成につながる。産生された細胞はmCerulean3を発現し、青色を発する。TnpAのN末端は黄色レポーターVenus¹²に融合しており、黄色蛍光によるTnpAレベルの測定が可能です。

IS608およびIS200/IS605ファミリーのトランスポゾンの他のメンバーも、これまで知られていなかった機能の2番目の遺伝子であるtnpB¹³を典型的にコードする。TnpBタンパク質は、非常に豊富ではあるが不完全に特徴付けられたヌクレアーゼファミリーであり、いくつかの細菌および古細菌の^TE14,15によってコードされており、多くの場合tnpB¹⁶のみで構成されています。さらに、最近の研究では、TnpBがCRISPR/Cas様プログラマブルRNAガイドエンドヌクレアーゼとして機能し、さまざまな条件下でdsDNAまたはssDNA切断のいずれかを生成することを発見することにより、TnpBへの関心が新たになっています^17,18。しかし、転位の調節においてTnpBがどのような役割を果たすかは不明である。IS608転位に対するTnpBの影響をリアルタイムで可視化するために、赤色蛍光タンパク質mCherryへのN末端融合を有するTnpBのコード領域を含むトランスポゾンのバージョンが作成された。

Kuhlman lab¹⁹によって実施されたより詳細なバルクレベルの研究を補完するために、トランスポゾン活性のリアルタイムイメージングが転位ダイナミクスに対するTnpBまたは他のアクセサリータンパク質の影響を定量的に明らかにする方法がここで示されています。TnpBをmCherryに融合させることにより、個々の転位事象を青色蛍光によって同定し、TnpA(黄色蛍光)およびTnpB(赤色蛍光)の発現レベルと相関させる。

プロトコル

1.細菌培養物の調製

1. プラスミドトランスポゾン構築物(Kimら⁸で前述)を含む大腸菌株MG1655を、適切な抗生物質(25 μg/mLのカナマイシン、材料の表を参照)を含むLB中で37°Cで一晩増殖させます。
   注:使用されるコンストラクトの配列および関連する配列は、GenBank²⁰ アクセッション番号OP581959、OP581957、OP581958、OP717084、およびOP717085として入手できます。
2. 定常状態の指数関数的成長を達成するには、培養液を≥M63培地(100 mM KH 2 PO 4、1 mM MgSO₄、1.8 μM FeSO 4、15 mM [NH 4]₂SO ₄、0.5 μg/mLチアミン[ビタミンB1])に希釈し、炭素源(ここでは0.5%w / vグルコース)と適切な抗生物質(材料の表を参照)を添加します。
3. 600 nm(OD600)での光学密度が~0.2に達するまで、37°Cで培養物を成長させます。文化は使用の準備ができています。

2.スライドの準備

1. M63を電子レンジで0.5%w / vグルコースと1.5%w / vアガロースで沸騰させてスライドを準備し、アガロースを溶かし、完全に溶融してよく混合されていることを確認します。
2. 抗生物質と誘導剤(25 μg/mLカナマイシンと10 ng/μLアンヒドロテトラサイクリン[aTc]、 材料の表を参照)を加える前に、混合物を~55°Cに冷却します。
3. 顕微鏡スライドを作業台に置きます。最初のスライドに垂直にさらに2つのスライドを積み重ね、別のスライドを下のスライドと平行に上に配置します。下部スライドと上部スライドの間にスライドの厚さが 1 つに等しい隙間があることを確認します。M63アガロース混合物をスライド間のこの隙間に~1 mLピペットでゆっくりと入れ、小さなゲルの正方形を作成します。
4. ゲルが固まったら(~10〜15分)、上部のスライドをスライドさせて取り除きます。かみそりの刃またはナイフでアガロースパッドを切り取ります。次に培養液2.5 μLをピペットで入れ(ステップ1.3)、カバーガラスを上に置きます。
5. スライドとカバーガラスの間のスペースをエポキシでシールします( 材料の表を参照)。エポキシを乾燥させ、細胞をアガロースパッド上に37°Cで少なくとも1時間沈降させます。

3. タイムラプス蛍光顕微鏡

1. 調製したサンプル(ステップ1.3)を蛍光顕微鏡( 材料表参照)に置き、37°Cに加熱・維持した環境下に置く。
   1. 画像取得に使用するカメラに適した露出時間を設定します。光退色を最小限に抑えるように照明強度を調整します。
      注:本研究では、各波長の2秒の露光時間を使用しました。
   2. 各波長について、最小蛍光を含む視野(FOV)を見つけます。バックグラウンド減算の解析中に使用する画像を取得します。
2. グリッド内の画像を異なる波長で一定の時間間隔で取得するためのプロトコルを設定します。
   1. タイムラプス写真をプロトコルにエンコードします。取得頻度を希望の時間間隔(ここでは20分)に設定し、合計タイムラプス時間を希望の長さ(24時間)に設定します。
   2. 適切な波長をプロトコルにエンコードします(使用する構造によって異なります)。
      注:mCherry励起ピークは587nmにあり、発光ピークは610nmにあります²¹;mVenusは515 nmと527 nm¹²にあり、mCerulean3は433 nmと475 nm¹¹にあります。
   3. 必要な数のFOV間でキャプチャするグリッドサイズを設定します。
      注:ここに示す代表的なデータは、8 x 8 FOVを使用しています。

4. 画像解析

1. 各カラーチャンネルで、手順3.1.2で取得したそれぞれの背景画像を使用して、背景減算を実行します。すべての分析ステップでは、オープンソースプラットフォームFiji²² の標準モジュールを使用します( 材料表を参照)。
2. mCerulean チャネルを閾値化し、閾値面積を平均細胞面積で割ることにより、各時点における総人口を概算します。
3. ユニークな切除イベントをカウントするには、mCerulean3チャネルの時間微分を取ります。これを実行するには、mCerulean3チャネル内の連続する画像を減算します。切除イベントは、蛍光の明るい閃光として時間微分で検出されます。
   1. 切除イベントのスタックに閾値を付けて、不要な蛍光を排除します。このプロセスでは、切除自体の一部がしきい値化されることに注意してください。これを修正するには、画像を拡張して切除を元のサイズに戻します。
      注:同様の閾値化および画像解析技術を使用した分析は、他の蛍光チャネルでも実行できます(たとえば、切除イベントをトランスポザーゼTnpA[黄色の金星蛍光]およびTnpB[赤色のmCherry蛍光]のレベルと相関させます)。

結果

生細胞中のトランスポゾン活性を蛍光顕微鏡で可視化するこの方法は、バルク蛍光測定よりもスループットは低いものの、個々の生細胞におけるトランスポゾン活性を直接可視化することができます。トランスポゾン切除イベントはmCerulean3のプロモーターの再構成をもたらし(図1)、明るい青色蛍光によってトランスポゾン活性を受けている細胞を同定することができます(図

ディスカッション

生細胞における転移因子活性のリアルタイムイメージングのためにここで紹介するユニークな方法は、生細胞における転位をリアルタイムで直接検出し、この活性をアクセサリータンパク質の発現と相関させることができる高感度アッセイです。スループットはバルク法で達成できるよりも低くなりますが、この方法では個々の生細胞におけるTE活性とタンパク質発現の詳細な測定が可能に?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 Ton Clear Epoxy	Devcon	31345
Agarose	Sigma-Aldrich	5066
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919
Argon Laser	Melles Griot	35-IMA-840-015
Blue Filter Cube	Chroma	Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Eclipse Ti-E Microscope	Nikon		Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g	Fisher Scientific	706834
Fiji			Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)	Fisher Scientific	BP9723-2
Glass Cover Slide	Fisher Scientific	12-542B
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	1355006
Magnesium sulfate Cert Ac	Fisher Scientific	XXM63SP3KG
Microscope Heater	World Precision Instruments	96810-1
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	17001H
ProScan III Stage	Prior
Red Filter Cube	Chroma	Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser	Coherent	1170412
Slide, Microscope	Fisher Scientific	125535B
Thiamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich (SIAL)	T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch	Nikon
Yellow Filter Cube	Chroma	Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M