АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описан протокол для выполнения живой визуализации в режиме реального времени для количественной оценки того, как вспомогательный белок TnpB влияет на динамику транспозиции в отдельных живых клетках кишечной палочки .

Аннотация

Здесь описан протокол для выполнения живой визуализации в режиме реального времени транспонируемой активности элементов в живых бактериальных клетках с использованием набора флуоресцентных репортеров, связанных с транспозицией. В частности, он демонстрирует, как визуализация в реальном времени может быть использована для оценки влияния дополнительного белка TnpB на активность транспонируемого элемента IS608, члена семейства транспонируемых элементов IS200/IS605. Семейство транспонируемых элементов IS200/IS605 представляет собой множество подвижных элементов, связанных с одним из самых бесчисленных генов, обнаруженных в природе, tnpB. Гомологии последовательностей предполагают, что белок TnpB может быть эволюционным предшественником систем CRISPR/Cas9. Кроме того, TnpB получил новый интерес, поскольку было показано, что он действует как эндонуклеаза ДНК, управляемая Cas-РНК. Влияние TnpB на скорость транспозиции IS608 количественно определено, и показано, что экспрессия TnpB IS608 приводит к увеличению транспозонной активности в ~5 раз по сравнению с клетками, в которых отсутствует экспрессия TnpB.

Введение

Транспонируемые элементы (ТЭ) являются генетическими элементами, которые мобилизуются в геномах своих хозяев путем иссечения или катализируют копирование с последующей геномной реинтеграцией. ТЭ существуют во всех областях жизни, и транспозиция реструктурирует геном хозяина, мутируя кодирующие и управляющие области1. Это порождает мутации и разнообразие, которые играют важную роль в эволюции 2,3, развитии 4,5 и нескольких заболеваниях человека6, включая рак7.

Используя новые генетические конструкции, которые связывают аспекты транспозиционной активности с флуоресцентными репортерами, наша предыдущая работа описывала разработку экспериментальной системы на основе бактериального TE IS608, представителя широко распространенного семейства ТЭ IS200/IS605 , которое позволяет в режиме реального времени визуализировать транспозицию в отдельных живых клетках8 (рисунок 1). Система TE показана на рисунке 1A. TE содержит транспозазную кодирующую последовательность tnpA, окруженную несовершенными палиндромными повторами (IP) левого конца (LE) и правого конца (RE), которые являются сайтами распознавания и иссечения для TnpA. tnpA экспрессируют с помощью промотора PLTetO1, который подавляется тет-репрессором и индуцируется ангидротетрациклином (aTc)9. TE разделяет последовательности -10 и -35 конститутивного промотора PlacIQ1 10 для синего репортера mCerulean311. Как показано на рисунке 1С, при индуцировании производства tnpA ТЭ может быть иссечен, что приводит к восстановлению промотора. Продуцируемая клетка экспрессирует mCerulean3 и флуоресцес синего цвета. N-конец TnpA слит с желтым репортером Venus12, что позволяет измерять уровни TnpA с помощью желтой флуоресценции.

IS608 и другие члены семейства транспозонов IS200/IS605 также обычно кодируют второй ген до сих пор неизвестной функции, tnpB13. Белки TnpB представляют собой чрезвычайно обильное, но несовершенное семейство нуклеаз, кодируемых несколькими бактериальными и архейными TEs14,15, которые часто состоят только из tnpB16. Кроме того, недавние исследования возобновили интерес к TnpB, обнаружив, что TnpB функционирует как CRISPR/Cas-подобная программируемая РНК-управляемая эндонуклеаза, которая будет давать либо dsDNA, либо ssDNA разрывы в различных условиях17,18. Однако остается неясным, какую роль TnpB может играть в регулировании транспозиции. Для выполнения визуализации в реальном времени эффектов TnpB на транспозицию IS608 была создана версия транспозона, включающая кодирующую область TnpB с N-концевым слиянием с красным флуоресцентным белком mCherry.

В дополнение к более подробным объемным исследованиям, выполненным лабораторией Кульмана19, здесь показано, как визуализация транспозонной активности в режиме реального времени может количественно выявить влияние TnpB или любых других вспомогательных белков на транспозициональную динамику. При слиянии TnpB с mCherry отдельные транспозиционные события идентифицируются синей флуоресценцией и коррелируют с уровнями экспрессии TnpA (желтая флуоресценция) и TnpB (красная флуоресценция).

протокол

1. Подготовка бактериальных культур

  1. Вырастите штамм E. coli MG1655 с плазмидными транспозонными конструкциями (ранее описанными в Kim et al.8) в течение ночи в LB с соответствующими антибиотиками (25 мкг/мл канамицина, см. Таблицу материалов) при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности используемых конструкций и связанные с ними последовательности доступны в виде номеров присоединения GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 и OP717085.
  2. Для достижения устойчивого экспоненциального роста разбавляют культуры ≥100 раз в среду M63 (100 мМ KH2PO4, 1 мМ MgSO4, 1,8 мкМ FeSO4, 15 мМ [NH4]2SO4, 0,5 мкг/мл тиамина [витамина B1]), дополненного источником углерода (0,5% мас./об.глюкозы здесь) и соответствующими антибиотиками (см. Таблицу материалов).
  3. Выращивайте культуры при 37 °C до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм (OD600) не достигнет ~0,2. Культуры готовы к использованию.

2. Подготовка слайдов

  1. Приготовьте слайд, вскипятив M63 с 0,5% мас./об. глюкозы и 1,5% мас./v агарозы в микроволновой печи, чтобы расплавить агарозу и убедиться, что она полностью расплавлена и хорошо перемешана.
  2. Дайте смеси остыть до ~55 °C перед добавлением антибиотиков и индукторов (25 мкг/мл канамицина и 10 нг/мкл ангидротетрациклина [aTc], см. Таблицу материалов).
  3. Поместите предметное стекло микроскопа на верстак. Сложите еще два слайда перпендикулярно первому и поместите еще один сверху, параллельно нижнему слайду. Убедитесь, что между нижним и верхним слайдами имеется зазор, равный одной толщине затвора. Пипетка ~ 1 мл смеси агарозы M63 в этот зазор между слайдами медленно создает небольшой гель-квадрат.
  4. Как только гель затвердеет (~10-15 мин), сдвиньте верхний слайд, чтобы удалить его. Обрежьте подушечку агарозы лезвием бритвы или ножом. Затем пипетку 2,5 мкл культуры (шаг 1.3) и сверху кладут крышку.
  5. Запечатайте пространство между слайдом и крышкой с помощью эпоксидной смолы (см. Таблицу материалов). Дайте эпоксидной смоле высохнуть, и ячейки осядут на агарозной подушке в течение не менее 1 ч при 37 °C.

3. Таймлапс флуоресцентная микроскопия

  1. Поместите подготовленный образец (этап 1.3) на флуоресцентный микроскоп (см. Таблицу материалов) в среду, нагретую и поддерживаемую при температуре 37 °C.
    1. Установите время экспозиции, соответствующее камере, используемой для получения изображения. Отрегулируйте интенсивность освещения, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования использовалось время экспозиции 2 с для каждой длины волны.
    2. Для каждой длины волны найдите поле зрения (FOV), содержащее минимальную флуоресценцию. Получение изображений для использования во время анализа для вычитания фона.
  2. Настройте протокол для получения изображений в сетке на разных длинах волн и через регулярные промежутки времени.
    1. Закодируйте таймлапс-фотографию в протокол. Установите частоту сбора на желаемый интервал времени (здесь 20 мин), а общую продолжительность таймлапса на нужную длину (24 ч).
    2. Закодируйте соответствующие длины волн в протоколе (в зависимости от используемой конструкции).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пик возбуждения mCherry составляет 587 нм, а пик излучения - 610 нм21; mVenus находится на 515 нм и 527 нм12, в то время как mCerulean3 на 433 нм и 475 нмна 11.
    3. Установите размер сетки для захвата между требуемым количеством FOV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В репрезентативных данных, показанных здесь, использовались 8 x 8 FOV.

4. Анализ изображений

  1. Выполните вычитание фона на каждом цветовом канале, используя соответствующие фоновые изображения, полученные на шаге 3.1.2. Для всех этапов анализа мы используем стандартные модули в платформе с открытым исходным кодом Fiji22 (см. Таблицу материалов).
  2. Аппроксимируйте общую популяцию в каждый момент времени, установив пороговое значение канала mCerulean и разделив пороговую площадь на среднюю площадь ячейки.
  3. Чтобы подсчитать уникальные события иссечения, возьмите производную по времени канала mCerulean3. Выполните это, вычитая последовательные изображения в канале mCerulean3. События иссечения будут обнаружены во временной производной как яркая вспышка флуоресценции.
    1. Пороговое значение стека событий иссечения для устранения нежелательной флуоресценции. Обратите внимание, что этот процесс приведет к выходу из самих частей иссечений. Чтобы исправить это, расширьте изображения, чтобы восстановить иссечения до их первоначальных размеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ с использованием аналогичных методов порогового значения и анализа изображений может быть выполнен и на других флуоресцентных каналах (например, коррелируют события иссечения с уровнями транспозазы TnpA [желтая флуоресценция Венеры] и TnpB [красная флуоресценция вишни).

Результаты

Этот метод визуализации транспозонной активности в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии, имея при этом более низкую пропускную способность, чем объемные флуоресцентные измерения, позволяет непосредственно визуализировать активность транспозонов в отдельных живых кле...

Обсуждение

Уникальный метод, представленный здесь для визуализации транспонируемой активности элементов в живых клетках в режиме реального времени, представляет собой чувствительный анализ, который может непосредственно обнаруживать транспозицию в живых клетках и в режиме реального времени и...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Финансовую поддержку этому исследованию оказали стартап-фонды из Калифорнийского университета.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2 Ton Clear EpoxyDevcon31345
AgaroseSigma-Aldrich5066
Ammonium sulfateSigma-AldrichAX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochlorideSigma-Aldrich37919
Argon LaserMelles Griot35-IMA-840-015
Blue Filter CubeChromaEx: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Eclipse Ti-E MicroscopeNikonDiscontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 gFisher Scientific706834
FijiFiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)Fisher ScientificBP9723-2 
Glass Cover SlideFisher Scientific12-542B 
Kanamycin SulfateSigma-Aldrich1355006
Magnesium sulfate Cert AcFisher ScientificXXM63SP3KG
Microscope HeaterWorld Precision Instruments96810-1
Potassium Phosphate MonobasicFisher Scientific17001H
ProScan III StagePrior
Red Filter CubeChromaEx: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP LaserCoherent1170412
Slide, MicroscopeFisher Scientific125535B
Thiamine HydrochlorideSigma-Aldrich (SIAL)T1270-100G
Ti-LU4 Laser LaunchNikon
Yellow Filter CubeChromaEx: Z514/10X, Em: ET535/30M

Ссылки

  1. Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
  2. Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
  3. Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
  4. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
  5. Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
  6. Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
  7. Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
  8. Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
  9. Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
  10. Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
  11. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
  12. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  13. Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
  14. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  15. Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
  16. Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
  17. Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
  18. Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
  19. Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
  20. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
  24. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены