Quantificação em tempo real dos efeitos do tnpB associado à família IS200/IS605 na atividade do transposon

Resumo

Um protocolo é delineado para realizar imagens ao vivo em tempo real para quantificar como a proteína acessória TnpB afeta a dinâmica de transposição em células vivas individuais de Escherichia coli .

Resumo

Aqui, um protocolo é delineado para realizar imagens ao vivo e em tempo real da atividade de elementos transponíveis em células bacterianas vivas usando um conjunto de repórteres fluorescentes acoplados à transposição. Em particular, demonstra como a imagem em tempo real pode ser usada para avaliar os efeitos da proteína acessória TnpB na atividade do elemento transponível IS608, um membro da família de elementos transponíveis IS200/IS605. A família de elementos transponíveis IS200/IS605 são elementos móveis abundantes conectados a um dos mais inúmeros genes encontrados na natureza, o tnpB. As homologias de sequência propõem que a proteína TnpB pode ser um precursor evolutivo dos sistemas CRISPR/Cas9. Além disso, o TnpB recebeu interesse renovado, tendo sido mostrado para atuar como uma endonuclease de DNA guiada por RNA semelhante a Cas. Os efeitos do TnpB sobre as taxas de transposição do IS608 são quantificados, e demonstra-se que a expressão do TnpB do IS608 resulta em ~5x maior atividade de transposon em comparação com as células sem expressão do TnpB.

Introdução

Elementos transponíveis (TEs) são elementos genéticos que se mobilizam dentro de seus genomas hospedeiros por excisão ou catalisação de cópia seguida de reintegração genômica. Os TEs existem em todos os domínios da vida, e a transposição reestrutura o genoma do hospedeiro, mutando regiões de codificação e controle¹. Isso gera mutações e diversidade que desempenham um papel importante na evolução^2,3, desenvolvimento^4,5 e diversas doenças humanas^6, incluindo o câncer⁷.

Usando novas construções genéticas que acoplam aspectos da atividade transposicional a repórteres fluorescentes, nosso trabalho anterior descreveu o desenvolvimento de um sistema experimental baseado na bactéria TE IS608, um representante da ampla família de TEs IS200/IS605, que permite a visualização em tempo real da transposição em células vivas individuais 8 (Figura 1). O sistema TE é exibido na Figura 1A. O TE compreende a sequência de codificação da transposase, tnpA, ladeada por repetições palindrômicas imperfeitas (IPs) da extremidade esquerda (LE) e da extremidade direita (RE), que são os locais de reconhecimento e excisão para TnpA. O tnpA é expresso usando o promotor P_LTetO1, que é reprimido pelo repressor tet e é induzível com anidrotetraciclina (aTc)⁹. O TE divide as sequências -10 e -35 de um promotor constitutivo P_lacIQ1 ¹⁰ para o repórter azul mCerulean3¹¹. Como mostra a Figura 1C, quando a produção de tnpA é induzida, o TE pode ser extirpado, levando à reconstituição do promotor. A célula produzida expressa mCerulean3 e fluoresce azul. O N-terminal de TnpA é fundido ao repórter amarelo Vênus¹², permitindo a medição dos níveis de TnpA por fluorescência amarela.

IS608 e outros membros da família de transposons IS200/IS605 também codificam tipicamente um segundo gene da função até agora desconhecida, tnpB¹³. As proteínas TnpB são uma família de nucleases tremendamente abundante, mas imperfeitamente caracterizadas, codificadas por vários TEs bacterianos e arqueais 14,15^, que muitas vezes consistem apenas em tnpB ¹⁶. Além disso, estudos recentes renovaram o interesse no TnpB ao descobrir que o TnpB funciona como uma endonuclease guiada por RNA programável semelhante à CRISPR/Cas que produzirá quebras de dsDNA ou ssDNA sob diversas condições^17,18. No entanto, ainda não está claro qual o papel que o TnpB pode desempenhar na regulação da transposição. Para realizar a visualização em tempo real dos efeitos do TnpB na transposição do IS608, foi criada uma versão do transposon, incluindo a região codificadora do TnpB com uma fusão N-terminal para a proteína fluorescente vermelha mCherry.

Complementando estudos mais detalhados em nível de volume realizados pelo laboratório Kuhlman¹⁹, é mostrado aqui como a imagem em tempo real da atividade do transposon pode revelar quantitativamente o impacto do TnpB ou de quaisquer outras proteínas acessórias na dinâmica transposicional. Ao fundir TnpB a mCherry, os eventos transposicionais individuais são identificados por fluorescência azul e correlacionados com os níveis de expressão de TnpA (fluorescência amarela) e TnpB (fluorescência vermelha).

Protocolo

1. Preparação de culturas bacterianas

1. Cultivar a cepa MG1655 de E. coli com construções de transposon plasmídico (descritas anteriormente em Kim et ^al.8) durante a noite em LB com os antibióticos apropriados (25 μg/mL de canamicina, ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
   NOTA: As sequências das construções utilizadas e as sequências relacionadas estão disponíveis como números de adesão do GenBank²⁰ OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 e OP717085.
2. Para alcançar o crescimento exponencial em estado estacionário, diluir as culturas ≥100 vezes no meio M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]₂SO ₄, 0,5 μg/mL de tiamina [vitamina B1]) suplementada com uma fonte de carbono (0,5% p/v de glicose aqui) e antibióticos apropriados (ver Tabela de Materiais).
3. Cultivar culturas a 37 °C até que a densidade óptica a 600 nm (OD600) atinja ~0,2. As culturas estão prontas para uso.

2. Preparação de slides

1. Prepare uma lâmina fervendo M63 com 0,5% p/v de glicose e 1,5% p/v de agarose no micro-ondas para derreter a agarose e garantir que ela esteja completamente derretida e bem misturada.
2. Deixe a mistura arrefecer a ~55 °C antes de adicionar antibióticos e indutores (25 μg/ml de canamicina e 10 ng/μL de anidrotetraciclina [aTc], ver Tabela de Materiais).
3. Coloque uma lâmina de microscópio na bancada de trabalho. Empilhe mais dois slides perpendiculares ao primeiro e coloque outro em cima, paralelo ao slide inferior. Verifique se há um espaço igual a uma espessura de slide entre os slides inferior e superior. Pipeta ~1 mL da mistura de agarose M63 nesta lacuna entre as lâminas lentamente para criar um pequeno quadrado de gel.
4. Uma vez que o gel tenha solidificado (~ 10-15 min), deslize a parte superior para removê-lo. Apare a almofada de agarose com uma lâmina de barbear ou faca. Em seguida, pipetar 2,5 μL da cultura (passo 1.3) e colocar a tampa por cima.
5. Sele o espaço entre a lâmina e a folha de cobertura com epóxi (consulte Tabela de materiais). Deixe secar o epóxi e as células se depositem na almofada de agarose durante, pelo menos, 1 h a 37 °C.

3. Microscopia de fluorescência Timelapse

1. Colocar a amostra preparada (etapa 1.3) num microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais) num ambiente aquecido e mantido a 37 °C.
   1. Defina os tempos de exposição apropriados para a câmera usada para aquisição de imagem. Ajuste a intensidade da iluminação para minimizar o fotobranqueamento.
      NOTA: Um tempo de exposição de 2 s para cada comprimento de onda foi utilizado para o presente estudo.
   2. Para cada comprimento de onda, encontre um Campo de Visão (FOV) contendo fluorescência mínima. Adquira imagens para usar durante a análise para subtração de fundo.
2. Configure um protocolo para adquirir imagens em uma grade em diferentes comprimentos de onda e em intervalos de tempo regulares.
   1. Codifique a fotografia de timelapse no protocolo. Defina a frequência de aquisição para o intervalo de tempo desejado (20 min aqui) e a duração total do timelapse para o comprimento desejado (24 h).
   2. Codifique comprimentos de onda apropriados no protocolo (dependendo da construção usada).
      NOTA: O pico de excitação mCherry está a 587 nm e o pico de emissão a 610 nm²¹; mVenus está em 515 nm e 527 nm¹², enquanto mCerulean3 está em 433 nm e 475 nm¹¹.
   3. Defina o tamanho da grade a ser capturado entre o número desejado de FOVs.
      NOTA: Os dados representativos mostrados aqui usaram 8 x 8 FOVs.

4. Análise de imagem

1. Execute a subtração de plano de fundo em cada canal de cor usando as respectivas imagens de plano de fundo adquiridas na etapa 3.1.2. Para todas as etapas de análise, usamos módulos padrão na plataforma de código aberto Fiji²² (consulte Tabela de Materiais).
2. Aproxime a população total em cada ponto no tempo, limitando o canal mCerulean e dividindo a área limiar pela área celular média.
3. Para contar os eventos de excisão exclusivos, pegue a derivada de tempo do canal mCerulean3. Execute isso subtraindo imagens sucessivas no canal mCerulean3. Os eventos de excisão serão detectados na derivada do tempo como um flash brilhante de fluorescência.
   1. Limite da pilha de eventos de excisão para eliminar a fluorescência indesejada. Observe que esse processo limitará partes das próprias excisão. Para corrigir isso, dilate as imagens para restaurar as excisões aos seus tamanhos originais.
      NOTA: Análises usando técnicas semelhantes de limiares e análise de imagem também podem ser realizadas nos outros canais de fluorescência (por exemplo, correlacionar eventos de excisão com níveis de transposase TnpA [fluorescência amarela de Vênus] e TnpB [fluorescência mCherry vermelha].

Resultados

Este método de visualização da atividade de transposon em células vivas por microscopia de fluorescência, embora tenha menor rendimento do que as medições de fluorescência em massa, permite a visualização direta da atividade de transposon em células vivas individuais. Os eventos de excisão do transposon resultam na reconstituição do promotor para mCerulean3 (Figura 1), permitindo a identificação de células submetidas à atividade do transposon por fluorescência azul brilhante (Figur...

Discussão

O método único apresentado aqui para imagens em tempo real da atividade de elementos transponíveis em células vivas é um ensaio sensível que pode detectar diretamente a transposição em células vivas e em tempo real e correlacionar essa atividade com a expressão de proteínas acessórias. Embora a taxa de transferência seja menor do que pode ser realizada por métodos a granel, este método alcança medições detalhadas da atividade de ET e da expressão de proteínas em células vivas individuais.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 Ton Clear Epoxy	Devcon	31345
Agarose	Sigma-Aldrich	5066
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919
Argon Laser	Melles Griot	35-IMA-840-015
Blue Filter Cube	Chroma	Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Eclipse Ti-E Microscope	Nikon		Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g	Fisher Scientific	706834
Fiji			Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)	Fisher Scientific	BP9723-2
Glass Cover Slide	Fisher Scientific	12-542B
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	1355006
Magnesium sulfate Cert Ac	Fisher Scientific	XXM63SP3KG
Microscope Heater	World Precision Instruments	96810-1
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	17001H
ProScan III Stage	Prior
Red Filter Cube	Chroma	Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser	Coherent	1170412
Slide, Microscope	Fisher Scientific	125535B
Thiamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich (SIAL)	T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch	Nikon
Yellow Filter Cube	Chroma	Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M