Echtzeit-Quantifizierung der Auswirkungen von IS200/IS605-Familien-assoziiertem TnpB auf die Transposonaktivität

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll skizziert, um Live-Echtzeit-Bildgebung durchzuführen, um zu quantifizieren, wie das akzessorische Protein TnpB die Dynamik der Transposition in einzelnen lebenden Escherichia coli-Zellen beeinflusst.

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll skizziert, um eine Live-Echtzeit-Bildgebung der transponierbaren Elementaktivität in lebenden Bakterienzellen unter Verwendung einer Reihe von fluoreszierenden Reportern durchzuführen, die mit der Transposition gekoppelt sind. Insbesondere wird gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung verwendet werden kann, um die Auswirkungen des akzessorischen Proteins TnpB auf die Aktivität des transponierbaren Elements IS608, einem Mitglied der IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente, zu bewerten. Die IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente sind reichlich vorhandene mobile Elemente, die mit einem der unzähligen Gene in der Natur, tnpB, verbunden sind. Sequenzhomologien deuten darauf hin, dass das TnpB-Protein ein evolutionärer Vorläufer von CRISPR/Cas9-Systemen sein könnte. Darüber hinaus hat TnpB erneut Interesse geweckt, da gezeigt wurde, dass es als Cas-ähnliche RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease wirkt. Die Auswirkungen von TnpB auf die Transpositionsraten von IS608 werden quantifiziert, und es wird gezeigt, dass die Expression von TnpB von IS608 zu ~5x erhöhter Transposonaktivität im Vergleich zu Zellen ohne TnpB-Expression führt.

Einleitung

Transposable Elements (TEs) sind genetische Elemente, die innerhalb ihres Wirtsgenoms durch Exzision mobilisieren oder kopieren und anschließend genomische Reintegration katalysieren. TEs existieren in allen Lebensbereichen, und die Transposition strukturiert das Wirtsgenom um und mutiert kodierende und Kontrollregionen¹. Dies erzeugt Mutationen und Diversität, die eine wichtige Rolle in der Evolution^2,3, der Entwicklung^4,5 und mehreren menschlichen Krankheiten⁶, einschließlich Krebs^7, spielen.

Unter Verwendung neuartiger genetischer Konstrukte, die Aspekte der Transpositionsaktivität an fluoreszierende Reporter koppeln, beschrieben unsere früheren Arbeiten die Entwicklung eines experimentellen Systems basierend auf dem bakteriellen TE IS608, einem Vertreter der weit verbreiteten IS200/IS605-Familie von TEs, das die Echtzeitvisualisierung der Transposition in einzelnen lebenden Zellen ermöglicht⁸ (Abbildung 1). Das TE-System ist in Abbildung 1A dargestellt. Die TE umfasst die Transposase-kodierende Sequenz, tnpA, flankiert von Left End (LE) und Right End (RE) imperfect palindromic repeats (IPs), die die Erkennungs- und Exzisionsstellen für TnpA sind. tnpA wird unter Verwendung des Promotors P_LTetO1 exprimiert, der durch den Tet-Repressor unterdrückt wird und mit Anhydrotetracyclin (aTc)⁹ induzierbar ist. Der TE teilt die -10- und -35-Sequenzen eines konstitutiven P_lacI Q1-Promotors¹⁰ für den blauen Reporter mCerulean3 ₁₁ auf. Wie in Abbildung 1C gezeigt, kann der TE herausgeschnitten werden, wenn die Produktion von tnpA induziert wird, was zu einer Rekonstitution des Promotors führt. Die produzierte Zelle exprimiert mCerulean3 und fluoresziert blau. Der N-Terminus von TnpA ist mit dem gelben Reporter Venus¹² verschmolzen, was die Messung der TnpA-Spiegel durch gelbe Fluoreszenz ermöglicht.

IS608 und andere Mitglieder der IS200/IS605-Familie von Transposons kodieren typischerweise auch für ein zweites Gen der bisher unbekannten Funktion, tnpB¹³. Die TnpB-Proteine sind eine enorm häufige, aber unvollkommen charakterisierte Familie von Nukleasen, die von mehreren bakteriellen und archaealen TEs^14,15 kodiert werden^, die oft nur aus tnpB¹⁶ bestehen. Darüber hinaus haben neuere Studien das Interesse an TnpB erneuert, indem sie festgestellt haben, dass TnpB als CRISPR / Cas-ähnliche programmierbare RNA-gesteuerte Endonuklease fungiert, die unter verschiedenen Bedingungen entweder dsDNA- oder ssDNA-Brüche erzeugt^17,18. Es bleibt jedoch unklar, welche Rolle TnpB bei der Regulierung der Umsetzung spielen könnte. Um die Auswirkungen von TnpB auf die IS608-Transposition in Echtzeit zu visualisieren, wurde eine Version des Transposons, einschließlich der kodierenden Region von TnpB mit einer N-terminalen Fusion zum rot fluoreszierenden Protein mCherry, erstellt.

Ergänzend zu detaillierteren Bulk-Level-Studien, die vom Kuhlman-Labor¹⁹ durchgeführt wurden, wird hier gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung der Transposonaktivität den Einfluss von TnpB oder anderen akzessorischen Proteinen auf die Transpositionsdynamik quantitativ aufdecken kann. Durch die Fusion von TnpB zu mCherry werden die einzelnen transpositionalen Ereignisse durch blaue Fluoreszenz identifiziert und mit Expressionsniveaus von TnpA (gelbe Fluoreszenz) und TnpB (rote Fluoreszenz) korreliert.

Protokoll

1. Vorbereitung von Bakterienkulturen

1. E. coli-Stamm MG1655 mit Plasmidtransposon-Konstrukten (zuvor beschrieben in Kim et ^al.8) über Nacht in LB mit den entsprechenden Antibiotika (25 μg/ml Kanamycin, siehe Materialtabelle) bei 37 °C züchten.
   HINWEIS: Die Sequenzen der verwendeten Konstrukte und die zugehörigen Sequenzen sind als GenBank^{20-Zugangsnummern} OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 und OP717085 verfügbar.
2. Um ein exponentielles Wachstum im stationären Zustand zu erreichen, verdünnen Sie Kulturen ≥100-fach in das M63-Medium (100 mMKH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]₂SO ₄, 0,5 μg / ml Thiamin [Vitamin B1]), ergänzt mit einer Kohlenstoffquelle (0,5% w/v Glukose hier) und geeigneten Antibiotika (siehe Tabelle der Materialien).
3. Züchten Sie Kulturen bei 37 °C, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD600) ~0,2 erreicht. Die Kulturen sind einsatzbereit.

2. Objektträgervorbereitung

1. Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie M63 mit 0,5% w/v Glucose und 1,5% w/v Agarose in der Mikrowelle kochen, um die Agarose zu schmelzen und sicherzustellen, dass sie vollständig geschmolzen und gut gemischt ist.
2. Lassen Sie die Mischung auf ~55 °C abkühlen, bevor Sie Antibiotika und Induktoren (25 μg/ml Kanamycin und 10 ng/μL Anhydrotetracyclin [aTc], siehe Materialtabelle) hinzufügen.
3. Legen Sie einen Objektträger auf die Werkbank. Stapeln Sie zwei weitere Folien senkrecht zur ersten und legen Sie eine weitere oben parallel zur unteren Folie auf. Stellen Sie sicher, dass zwischen den unteren und oberen Folien ein Spalt vorhanden ist, der einer Objektträgerstärke entspricht. Pipettieren Sie ~1 mL der M63-Agarosemischung langsam in diesen Spalt zwischen den Objektträgern, um ein kleines Gelquadrat zu erzeugen.
4. Sobald das Gel erstarrt ist (~10-15 min), schieben Sie den oberen Objektträger, um ihn zu entfernen. Schneiden Sie das Agarosettenkissen mit einer Rasierklinge oder einem Messer ab. Dann pipetten Sie 2,5 μL der Kultur (Schritt 1.3) und legen Sie das Deckglas darauf.
5. Verschließen Sie den Raum zwischen Objektträger und Deckglas mit Epoxidharz (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Epoxidharz trocknen und die Zellen setzen sich mindestens 1 h bei 37 °C auf dem Agarosepad ab.

3. Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie

1. Die vorbereitete Probe (Schritt 1.3) wird auf ein Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) in einer auf 37 °C erhitzten und gehaltenen Umgebung gelegt.
   1. Stellen Sie die Belichtungszeiten entsprechend der Kamera ein, die für die Bildaufnahme verwendet wird. Stellen Sie die Beleuchtungsintensität ein, um das Photobleichen zu minimieren.
      HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde eine Expositionszeit von 2 s für jede Wellenlänge verwendet.
   2. Suchen Sie für jede Wellenlänge ein Sichtfeld (FOV) mit minimaler Fluoreszenz. Erfassen Sie Bilder, die während der Analyse für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden sollen.
2. Richten Sie ein Protokoll ein, um Bilder in einem Raster bei verschiedenen Wellenlängen und in regelmäßigen Zeitintervallen zu erfassen.
   1. Kodieren Sie Zeitrafferaufnahmen in das Protokoll. Stellen Sie die Erfassungsfrequenz auf das gewünschte Zeitintervall (hier 20 min) und die gesamte Zeitrafferdauer auf die gewünschte Länge (24 h) ein.
   2. Kodieren Sie geeignete Wellenlängen in das Protokoll (abhängig vom verwendeten Konstrukt).
      HINWEIS: Der mCherry-Anregungspeak liegt bei 587 nm und der Emissionspeak bei 610 nm²¹; mVenus liegt bei 515 nm und 527 nm¹², während mCerulean3 bei 433 nm und 475 nm¹¹ liegt.
   3. Legen Sie die Rastergröße fest, die zwischen der gewünschten Anzahl von FOVs erfasst werden soll.
      HINWEIS: Die hier gezeigten repräsentativen Daten verwendeten 8 x 8 FOVs.

4. Bildanalyse

1. Führen Sie die Hintergrundsubtraktion für jeden Farbkanal durch, indem Sie die entsprechenden Hintergrundbilder verwenden, die in Schritt 3.1.2 erfasst wurden. Für alle Analyseschritte verwenden wir Standardmodule der Open-Source-Plattform Fiji²² (siehe Materialtabelle).
2. Nähern Sie sich der Gesamtpopulation zu jedem Zeitpunkt an, indem Sie den mCerulean-Kanal schwellieren und den Schwellenwertbereich durch die durchschnittliche Zellfläche dividieren.
3. Um die eindeutigen Exzisionsereignisse zu zählen, nehmen Sie die Zeitableitung des mCerulean3-Kanals. Tun Sie dies, indem Sie aufeinanderfolgende Bilder im mCerulean3-Kanal subtrahieren. Die Exzisionsereignisse werden in der Zeitableitung als heller Fluoreszenzblitz detektiert.
   1. Schwelle des Stapels von Exzisionsereignissen, um unerwünschte Fluoreszenz zu eliminieren. Beachten Sie, dass dieser Prozess Teile der Exzisionen selbst ausschließt. Um dies zu beheben, erweitern Sie die Bilder, um die Exzisionen auf ihre ursprüngliche Größe wiederherzustellen.
      HINWEIS: Analysen mit ähnlichen Schwellenwert- und Bildanalysetechniken können auch an den anderen Fluoreszenzkanälen durchgeführt werden (z. B. Korrelation von Exzisionsereignissen mit Transposase-TnpA [gelbe Venusfluoreszenz] und TnpB [rote mCherry-Fluoreszenz].

Ergebnisse

Diese Methode zur Visualisierung der Transposonaktivität in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht bei geringerem Durchsatz als Massenfluoreszenzmessungen die direkte Visualisierung der Transposonaktivität in einzelnen lebenden Zellen. Transposon-Exzisionsereignisse führen zur Rekonstitution des Promotors für mCerulean3 (Abbildung 1), was die Identifizierung von Zellen ermöglicht, die Transposonaktivität durch hellblaue Fluoreszenz durchlaufen (Abbildung 2, TnpB+: Sup...

Diskussion

Die hier vorgestellte einzigartige Methode zur Echtzeit-Bildgebung der Aktivität transponierbarer Elemente in lebenden Zellen ist ein empfindlicher Assay, der die Transposition in lebenden Zellen und in Echtzeit direkt nachweisen und diese Aktivität mit der Expression akzessorischer Proteine korrelieren kann. Während der Durchsatz geringer ist, als dies mit Massenmethoden erreicht werden kann, erreicht diese Methode detaillierte Messungen der TE-Aktivität und Proteinexpression in einzelnen lebenden Zellen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 Ton Clear Epoxy	Devcon	31345
Agarose	Sigma-Aldrich	5066
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919
Argon Laser	Melles Griot	35-IMA-840-015
Blue Filter Cube	Chroma	Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Eclipse Ti-E Microscope	Nikon		Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g	Fisher Scientific	706834
Fiji			Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)	Fisher Scientific	BP9723-2
Glass Cover Slide	Fisher Scientific	12-542B
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	1355006
Magnesium sulfate Cert Ac	Fisher Scientific	XXM63SP3KG
Microscope Heater	World Precision Instruments	96810-1
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	17001H
ProScan III Stage	Prior
Red Filter Cube	Chroma	Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser	Coherent	1170412
Slide, Microscope	Fisher Scientific	125535B
Thiamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich (SIAL)	T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch	Nikon
Yellow Filter Cube	Chroma	Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M