Mappatura cerebrale utilizzando un array di elettrodi di grafene

Riepilogo

Presentiamo una procedura di mappatura cerebrale basata su array di grafene per ridurre l'invasività e migliorare la risoluzione spazio-temporale. Gli elettrodi di superficie basati su array di grafene mostrano biocompatibilità a lungo termine, flessibilità meccanica e idoneità per la mappatura cerebrale in un cervello contorto. Questo protocollo consente di costruire più forme di mappe sensoriali contemporaneamente e in sequenza.

Abstract

Le mappe corticali rappresentano l'organizzazione spaziale delle risposte neurali dipendenti dalla posizione agli stimoli sensomotori nella corteccia cerebrale, consentendo la previsione di comportamenti fisiologicamente rilevanti. Vari metodi, come gli elettrodi penetranti, l'elettroencefalografia, la tomografia a emissione di positroni, la magnetoencefalografia e la risonanza magnetica funzionale, sono stati utilizzati per ottenere mappe corticali. Tuttavia, questi metodi sono limitati da una scarsa risoluzione spazio-temporale, da un basso rapporto segnale/rumore (SNR), da costi elevati e dalla non biocompatibilità o causano danni fisici al cervello. Questo studio propone un metodo di mappatura somatosensoriale basato su array di grafene come caratteristica dell'elettrocorticografia che offre una biocompatibilità superiore, un'elevata risoluzione spazio-temporale, un SNR desiderabile e un danno tissutale ridotto al minimo, superando gli inconvenienti dei metodi precedenti. Questo studio ha dimostrato la fattibilità di un array di elettrodi di grafene per la mappatura somatosensoriale nei ratti. Il protocollo presentato può essere applicato non solo alla corteccia somatosensoriale ma anche ad altre cortecce come la corteccia uditiva, visiva e motoria, fornendo una tecnologia avanzata per l'implementazione clinica.

Introduzione

Una mappa corticale è un insieme di chiazze locali che rappresentano le proprietà di risposta agli stimoli sensomotori nella corteccia cerebrale. Sono una formazione spaziale di reti neurali e consentono la previsione della percezione e della cognizione. Pertanto, le mappe corticali sono utili per valutare le risposte neurali agli stimoli esterni e per elaborare le informazioni sensomotorie 1,2,3,4. Sono disponibili metodi invasivi e non invasivi per la mappatura corticale. Una delle metodiche invasive più comuni prevede l'uso di elettrodi intracorticali (o penetranti) per^{la mappatura} 5,6,7,8.

La valutazione delle mappe corticali ad alta risoluzione su richiesta utilizzando elettrodi penetranti ha incontrato diversi ostacoli. Il metodo è troppo laborioso per ottenere una mappa decente e troppo invasivo per essere implementato per uso clinico, impedendo ulteriori sviluppi. Tecnologie più recenti come l'elettroencefalografia (EEG), la tomografia a emissione di positroni (PET), la magnetoencefalografia (MEG) e la risonanza magnetica funzionale (fMRI) hanno guadagnato popolarità perché sono meno invasive e riproducibili. Tuttavia, dati i loro costi proibitivi e la scarsa risoluzione, vengono utilizzati in un numero limitato di casi 9,10,11. Recentemente, gli elettrodi di superficie flessibili con un'affidabilità del segnale superiore hanno attirato una notevole attenzione. Gli elettrodi di superficie a base di grafene dimostrano biocompatibilità a lungo termine e flessibilità meccanica, fornendo registrazioni stabili in un cervello contorto 12,13,14,15,16. Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato un array multicanale a base di grafene per la registrazione ad alta risoluzione e la neurostimolazione sito-specifica sulla superficie corticale. Questa tecnologia ci permette di tenere traccia delle rappresentazioni corticali delle informazioni sensoriali per un periodo prolungato.

Questo articolo descrive i passaggi necessari per acquisire una mappa cerebrale della corteccia somatosensoriale utilizzando un array multielettrodo di grafene a 30 canali. Per misurare l'attività cerebrale, un array di elettrodi di grafene viene posizionato sull'area subdurale della corteccia, mentre la zampa anteriore, l'arto anteriore, la zampa posteriore, l'arto posteriore, il tronco e i baffi vengono stimolati con un bastoncino di legno. I potenziali evocati somatosensoriali (SEP) vengono registrati per le aree somatosensoriali. Questo protocollo può essere applicato anche ad altre aree cerebrali, come la corteccia uditiva, visiva e motoria.

Protocollo

Tutte le procedure di gestione degli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università Nazionale di Incheon (INU-ANIM-2017-08).

1. Preparazione dell'animale per l'intervento chirurgico

NOTA: Utilizzare Sprague Dawley Rat (8-10 settimane) senza pregiudizi sessuali per questo esperimento.

1. Anestetizzare il ratto con 90 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di cocktail di xilazina per via intraperitoneale. Per mantenere la profondità di anestesia desiderata durante l'intervento, fornire un supplemento di 45 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di cocktail di xilazina quando il ratto mostra segni di risveglio.
2. Verificare che il ratto sia in anestesia profonda e controllare regolarmente i riflessi del corpo come il pizzicamento delle dita dei piedi, il pizzicamento della coda e il riflesso corneale.
3. Radere il pelo tra gli occhi e la parte posteriore delle orecchie usando un rifinitore.
4. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino.

2. Chirurgia per l'esposizione della superficie corticale

1. Fissare la testa di ratto sull'apparecchio stereotassico con un adattatore stereotassico. Per mantenere la temperatura corporea di 37 °C durante l'intervento, posizionare il ratto su un termoforo a temperatura controllata.
2. Sterilizzare la zona rasata con scrub alternati di alcool e iodio povidone per tre volte.
3. Utilizzare una pinza per afferrare saldamente il cuoio capelluto e iniettare 0,1 ml di lidocaina (2%) con una siringa direttamente nel cuoio capelluto per indurre l'anestesia locale nell'area chirurgica.
4. Fai un'incisione sulla linea mediana lunga 2-3 cm con un bisturi e separa il cuoio capelluto per esporre il cranio.
5. Blocca il cuoio capelluto con una pinza per zanzare per esporre il cranio.
6. Grattare la superficie del cranio con una pinza per rimuovere il periostio.
7. Smussare sezionare i muscoli sopra il cranio occipitale per esporre la cisterna magna sopra l'asse sulla parte superiore del midollo spinale.
8. Incidere la cisterna magna con la lama per drenare il liquido cerebrospinale e mettere una garza sterile all'interno dell'incisione della cisterna magna per assorbire costantemente il liquido cerebrospinale per prevenire l'edema cerebrale e ridurre al minimo l'infiammazione.
9. Usando una matita, segnare sul cranio una finestra rettangolare di 3 mm nell'asse antero-posteriore e 6 mm in direzione laterale destra dal bregma dell'emisfero destro.
   NOTA: La marcatura deve garantire una distanza di 1 mm dalla linea mediana per evitare la rottura del seno sagittale superiore.
10. Forare l'area contrassegnata secondo la coordinata stereotassica e rimuovere il cranio con un rongeur osseo.
11. Per rimuovere la dura madre, piegare la punta dell'ago da 26 G a 90°, creare un foro nella dura madre, sollevare la dura madre, inserire una pinza in quel foro e strapparla con una pinza.
12. Metti una garza bagnata con soluzione salina sulla corteccia somatosensoriale per evitare che si secchi.

3. Preparazione dell'array di elettrodi di grafene collegato al sistema di registrazione

1. Preparare un array di elettrodi di grafene con un connettore omnetics.
   1. Staccare l'array di multielettrodi di grafene senza causare danni applicando la soluzione salina.
   2. Rimuovere il rivestimento esterno dei cavi di riferimento e di terra dal connettore.
2. Collegare lo stadio di testa con l'array di elettrodi di grafene al connettore.
3. Collegare il cavo di interfaccia collegato al palco principale al sistema di registrazione.
4. Fissare il complesso dell'array di elettrodi di grafene nel braccio stereotassico.
5. Per catturare i segnali neurali da tutti i canali, posizionare l'array sulla corteccia somatosensoriale senza alcuna flessione, seguendo le coordinate stereotassiche predeterminate.
6. Posizionare un filo di riferimento sotto il tessuto dietro l'osso occipitale e collegare il filo di terra al tavolo ottico con messa a terra.

4. Stimolazione fisica e registrazione dei SEP per la mappatura

1. Aprire il software di registrazione del segnale neurale.
2. Impostare l'ambiente del software di registrazione: (1) impostare la frequenza di campionamento per i SEP e il filtro notch (60 o 50 Hz, una frequenza dell'energia elettrica domestica) per rimuovere il rumore dalla linea elettrica.
3. Per la mappatura dei baffi, piega i baffi con un bastoncino fine.
4. Colpisci costantemente la zampa anteriore, l'arto anteriore, la zampa posteriore, l'arto posteriore e il tronco con un bastoncino di legno per mappare il corpo.
5. Registrare i segnali neurali nel sistema di acquisizione dati per il tempo indicato.

5. Eutanasia animale

1. Dopo tutte le procedure di registrazione, sacrificare i ratti con l'anestesia utilizzando l'isoflurano al >5% ed eseguire la dissezione cervicale.

6. Misurazione SEP per la mappatura corticale

1. Apri MATLAB, nome in codice read_Intan_RHS2000_file.m, per l'analisi dei segnali.
   NOTA: read_Intan_RHS2000_file.m può essere scaricato da "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software".
2. Fare clic sul pulsante Esegui , selezionare il file di registrazione con l'estensione ".rhs" e attendere che il file venga elaborato e letto.
3. Immettere il comando "plot (t, amplifier_data("channel number",:))" per creare un grafico a linee 2D dei dati di registrazione, trovare i SEP e calcolare l'ampiezza dei SEP in tutti i canali.
   NOTA: Immettere il numero del canale in "numero canale". Ad esempio, "plot(t, amplifier_data(1,:))" crea il grafico a linee 2D del canale 1. Inoltre, quando lo sperimentatore calcola l'ampiezza della risposta, sceglie la risposta registrata da ciascun canale.
4. Ottenere i dati colorando la griglia con una tonalità diversa in base all'ampiezza dei SEP.
   NOTA: Il comando MATLAB "imagesc" consente di ottenere una mappa topografica più rapidamente.

Risultati

Questo protocollo descrive il modo in cui un array multicanale di grafene viene montato sulla superficie del cervello. La mappa somatosensoriale è stata costruita acquisendo risposte neurali a stimoli fisici e calcolando l'ampiezza della risposta. La Figura 1 mostra lo schema di questo esperimento.

La Figura 2A presenta le caratteristiche strutturali di un array di elettrodi in grafene. Ci sono fori passanti del substrato tra gli ele...

Discussione

Il protocollo presentato fornisce un processo approfondito e passo dopo passo che spiega come accedere e mappare le risposte somatosensoriali dei ratti utilizzando un array di elettrodi di grafene. I dati acquisiti dal protocollo sono SEP che forniscono informazioni somatosensoriali che sono sinapticamente collegate a ciascuna parte del corpo.

Diversi aspetti di questo protocollo dovrebbero essere considerati. Quando si estrae il liquido cerebrospinale per prevenire l'edema cerebrale e mitigar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
3mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
Bone rongeur	Fine Science Tools	16220-14	remove the skull
connector	Gbrain		Connect graphene electrode to headstage
drill	FALCON tool		grind the skull
drill bits	Osstem implant		grind the skull
Graefe iris forceps slightly curved serrated	vubu	vudu-02-73010	remove the tissue from the skull or hold wiper
graphene multielectrode array	Gbrain		records signals from neuron
isoflurane	Hana Pharm Corporation		sacrifce the subject
ketamine	yuhan corporation		used for anesthesia
lidocaine(2%)	Daihan pharmaceutical		local anesthetic
Matlab R2021b	Mathworks		Data analysis Software
mosquito hemostats	Fine Science Tools	91309-12	fasten the scalp
ointment	Alcon		prevent eye from drying out
povidone	Green Pharmaceutical corporation		disinfect the incision area
RHS 32ch Stim/Record headstage	intan technologies	M4032	connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip
RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable	intan technologies	M3206	connect graphene electrode to headstage
RHS Stim/Recording controller software	intan technologies		Data Acquisition Software
RHS stimulation/ Recording controller	intan technologies	M4200
saline	JW Pharmaceutical
scalpel	Hammacher	HSB 805-03
stereotaxic instrument	stoelting		fasten the subject
sterile Hypodermic Needle	KOREAVACCINE CORPORATION		remove the dura mater
Steven Iris Tissue Forceps	KASCO	50-2026	remove the dura mater
surgical blade no.11	FEATHER		inscise the scalp
surgical sicssors	Fine Science Tools	14090-09	inscise the scalp and remove the dura mater
wooden stick			whisker stimulation
xylazine	Bayer Korea		used for anesthesia