Positronen-Emissions-Tomographie mit 64-Kupfer als Tracer zur Untersuchung kupferbedingter Erkrankungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie ⁶⁴Cu PET/CT- und PET/MRT-Bildgebung am Menschen durchgeführt werden können, um kupferbedingte Erkrankungen wie Morbus Wilson und die Auswirkungen der Behandlung auf den Kupferstoffwechsel zu untersuchen.

Zusammenfassung

Kupfer ist ein essentielles Spurenelement, das in der Katalyse und bei der Signalübertragung in biologischen Systemen eine Rolle spielt. Radioaktiv markiertes Kupfer wird seit Jahrzehnten zur Untersuchung des grundlegenden menschlichen und tierischen Kupferstoffwechsels und kupferbedingter Erkrankungen wie Morbus Wilson (WD) und Morbus Menke verwendet. Neu hinzugekommen ist die 64-Kupfer (64 Cu) Positronen-Emissions-Tomographie (PET), die die genaue anatomische Bildgebung moderner Computertomographen (CT) oder Magnetresonanztomographen (MRT) mit der Bioverteilung des ⁶⁴Cu PET-Tracer-Signals kombiniert. Dies ermöglicht es, Kupferflüsse und -kinetik in vivo zu verfolgen und so den Verkehr und Stoffwechsel von Kupferorganen bei Mensch und Tier direkt sichtbar zu machen. Folglich eignet sich ⁶⁴Cu PET gut für die Bewertung klinischer und präklinischer Behandlungseffekte und hat bereits gezeigt, dass es in der Lage ist, WD genau zu diagnostizieren. Darüber hinaus haben ^{sich 64}Cu-PET/CT-Studien in anderen wissenschaftlichen Bereichen wie der Krebs- und Schlaganfallforschung als wertvoll erwiesen. Der vorliegende Artikel zeigt, wie ⁶⁴Cu PET/CT oder PET/MR beim Menschen durchgeführt werden können. Hier werden Verfahren für die Handhabung von ⁶⁴Cu, die Patientenvorbereitung und die Einrichtung des Scanners demonstriert.

Einleitung

Kupfer ist ein lebenswichtiger katalytischer Cofaktor, der mehrere wichtige biochemische Prozesse antreibt, die für das Leben unerlässlich sind, und Defekte in der Kupferhomöostase sind direkt für menschliche Krankheiten verantwortlich. Mutationen in den Genen ATP7A oder ATP7B , die für kupfertransportierende ATPasen kodieren, verursachen Morbus Menke bzw. Wilson. Morbus Menke (ATP7A) ist eine seltene tödliche Erkrankung der intestinalen Kupferhyperakkumulation mit schwerem Kupfermangel im peripheren Gewebe und Defiziten in kupferabhängigen Enzymen¹. Morbus Wilson (WD) (ATP7B) ist eine seltene Erkrankung, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, überschüssiges Kupfer in die Galle auszuscheiden, was zu einer Kupferüberladung und anschließenden Organschäden führt, die am stärksten die Leber und das Gehirn betreffen².

Studien zum Kupferstoffwechsel verwenden seit Jahrzehnten radioaktiv markiertes Kupfer (normalerweise 64-Kupfer [⁶⁴Cu] oder 67-Kupfer), und diese Studien haben sich als von unschätzbarem Wert für unser Verständnis des Kupferstoffwechsels von Säugetieren erwiesen, einschließlich der Absorptionsstelle und der Ausscheidungswege 3,4,5,6. Früher wurden Gamma-Zähler verwendet, um das radioaktive Signal mit einer begrenzten anatomischen Auflösung zu detektieren, aber vor kurzem wurde die 64-Cu-Positronen-Emissions-Tomographie (PET) in Kombination mit Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRT) sowohl in Human- als auch in Tierstudien eingeführt. Heute haben PET-Scanner eine so hohe Empfindlichkeit, dass es möglich ist, ⁶⁴Cu bis zu 70 h nach der Injektion zu verfolgen. Die lange Halbwertszeit von 12,7 h für ⁶⁴Cu ermöglicht die Langzeitbeurteilung von Kupferflüssen. Diese Verbesserung der Auflösung hat erst vor kurzem Einzug in die Kupferstudien gehalten, und Studien über den normalen und pathologischen Kupferstoffwechsel sowie Studien, die die Auswirkungen bestimmter Behandlungen bewerten, beginnen sich abzuzeichnen. Darüber hinaus wird die Einführung von Ganzkörper-PET-Scannern mit erweitertem Sichtfeld die Sensitivität dieser Untersuchungen weiter erhöhen.

Diese methodische Arbeit zielt darauf ab, Kliniker und Wissenschaftler in die Lage zu versetzen, das bestehende Repertoire an Instrumenten um ⁶⁴Cu PET CT/MRT als robuste und einfach zu handhabende Methode zur Beurteilung des Kupferstoffwechsels in einer zwischen nuklearmedizinischen Abteilungen vergleichbaren Weise zu erweitern. Die Herstellung von ⁶⁴Cu Kupfer kann mit verschiedenen Verfahren erfolgen und wird in der Regel in speziellen Anlagen durchgeführt. Unter den Kernreaktionen ist die 64 Ni (p,n)64 Cu-Methode weit verbreitet, da auf diesem Weg eine hohe Produktionsausbeute von ⁶⁴Cu mit niederenergetischen Protonen erzielt werden kann ^7,8. Eine detaillierte Beschreibung der Produktionsmethoden würde den Rahmen dieser Arbeit sprengen, und die Verfügbarkeit wird je nach Land und Region unterschiedlich sein.

In diesem Artikel beschreiben wir zunächst die Herstellung der notwendigen Radiochemie und des Tracers. Anschließend werden die Prinzipien zur Vorbereitung der PET/CT- oder PET/MRT-Scanner demonstriert.

Protokoll

Einige klinische Studien mit diesem ⁶⁴Cu PET/CT- oder PET/MRT-Protokoll wurden von der regionalen Ethikkommission der Region Midt, Dänemark, genehmigt [1-10-72-196-16 (EudraCT 2016-001975-59), 1-10-72-41-19 (EudraCT 2019-000905-57), 1-10-72-343-20 (EudraCT 2020-005832-31), 1-10-72-25-21 (EudraCT 2021-000102-25) und 1-10-72-15-22 (EudraCT 2021-005464-21)]. Bei der Einschreibung wurde von den Teilnehmern eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Einschlusskriterien für alle Teilnehmerinnen waren das Alter >18 Jahren und für Frauen die Verwendung sicherer Verhütungsmittel. Die Ausschlusskriterien für Patienten mit Morbus Wilson waren eine dekompensierte Zirrhose, ein MELD-Score (Model for End-stage Liver Disease) >11) oder ein modifizierter Nazer-Score >6. Die Ausschlusskriterien für alle Teilnehmerinnen waren eine bekannte Überempfindlichkeit gegen ⁶⁴Cu oder andere Inhaltsstoffe der Tracer-Säuglingsnahrung, Schwangerschaft, Stillzeit oder der Wunsch, vor Ende der Studie schwanger zu werden.

1. Herstellung von ⁶⁴CuCl₂

1. ⁶⁴CuCl₂ in Salzsäure (0,1 M) auflösen und Natriumacetatpuffer (0,5 M) hinzufügen, um den pH-Wert auf ~5 zu erhöhen. Mit Kochsalzlösung formulieren und die Lösung filtern und sterilisieren, indem sie durch einen 0,22-μm-Filter geleitet wird (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Natriumacetatpuffer (0,5 M) wird aus Natriumacetattrihydrat und sterilem Wasser hergestellt, das durch einen 0,22 μm Sterilisationsfilter geleitet wird.
2. Zur Qualitätskontrolle der hergestellten ⁶⁴_{CuCl2-Lösung} sind eine pH-Messung, ein bakterieller Endotoxintest, eine Bestimmung der radiochemischen Reinheit und eine radionuklidische Identifizierung ^7,8 durchzuführen.
3. Lagern Sie das Produkt in einem Bleibehälter bei Raumtemperatur und bewahren Sie es in Quarantäne auf, bis alle Qualitätskontrollspezifikationen zufriedenstellend erfüllt sind.
   ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurde ⁶⁴CuCl₂ mit einer radionuklidischen Reinheit von ≥99 % und einer radiochemischen Reinheit von ≥95 %) hergestellt. Der als Ausgangsmaterial verwendete Solid ⁶⁴CuCl₂ wurde aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

2. Vorbereitung des PET-Scanners

1. Führen Sie am Scanner eine Qualitätsprüfung (QC)⁹ gemäß dem Protokoll des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: QCs müssen täglich morgens vor den Patientenscans durchgeführt werden.

3. Zeichnung des Tracers für die intravenöse (i.v.) Injektion und die orale (PO) Verabreichung

1. Tragen Sie Plastikhandschuhe und entfernen Sie den Deckel vom Bleibehälter.
2. Desinfizieren Sie mit einer langen Pinzette die Gummimembran der tracerhaltigen Glasflasche im Inneren des Bleibehälters mit einem Desinfektionstupfer.
3. Führen Sie mit einer Pinzette eine kurze Kanüle (~0,5 mm x 16 mm) in die Membran ein, um ein Überlaufen des Vakuums in der Flasche zu vermeiden.
4. Verwenden Sie eine Pinzette, um eine längere Kanüle einzuführen, aus der Sie ziehen können. Diese Kanüle sollte lang genug sein, um den Boden der Flasche zu erreichen (normalerweise 50 mm).
5. Stellen Sie sicher, dass der Dosiskalibrator (siehe Materialtabelle) für ⁶⁴Cu kalibriert ist. Berechnen Sie ein ungefähres Volumen, das für die erste Ziehung gezeichnet werden soll.
   HINWEIS: Aus den Berichten zur chemischen Qualitätskontrolle sind die Aktivitätsmenge und das Volumen der Flüssigkeit verfügbar, so dass ein ungefähres Volumen berechnet werden kann.
6. Tragen Sie Plastikhandschuhe, führen Sie eine Plastikspritze in geeigneter Größe in die lange Kanüle ein und entnehmen Sie das berechnete Volumen. Dieses Volumen hängt von der Konzentration von 64 Cu im Produkt ab und davon, wie viel ⁶⁴Cu für das Protokoll festgelegt wird (siehe Dosisberechnungen unter den repräsentativen Ergebnissen).
7. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Kanüle zu halten, während Sie die Spritze zum Dosiskalibrator bewegen, um die Radioaktivität zu messen.
8. Ziehen Sie so lange, bis die entsprechende Radioaktivitätsmenge erreicht ist. Etwa 5 % des Tracers verbleiben nach der Injektion in der Spritze und Kanüle.
   Anmerkungen: Das ⁶⁴Cu sollte nicht in Salzwasser verdünnt werden, da der Tracer ausfallen kann. Daher kann die Spritze nach der Injektion nicht mit Salzwasser gespült werden (dies ist für die PO-Verabreichung nicht relevant).
9. Setzen Sie mit der Pinzette eine Kanüle mit einer Kappe (~16 mm Kanüle) an, um die Spritze zu verschließen, und bewahren Sie sie bis zur Anwendung in einem Bleibehälter auf.

4. Anwendung des Tracers

1. Intravenöse Injektion
   1. Führen Sie eine intravenöse Kanüle (~22 G, 25 mm) ein, vorzugsweise in eine Kubitalvene, und spülen Sie sie mit Salzwasser ab, um eine korrekte Platzierung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Ein Arbeitsblatt mit dem Namen des Teilnehmers, einem Stempel oder einer Unterschrift für die Freigabe der Tracer-Qualitätskontrolle sowie Zeitpunkten und Radioaktivität für das Zeichnen, die Injektion und den übrig gebliebenen Tracer sollte verfügbar sein.
   2. Messen Sie die Radioaktivität in der Spritze mit dem verfügbaren Dosiskalibrator und notieren Sie die Zeit und Aktivität auf dem Arbeitsblatt.
   3. Transportieren Sie die Spritze in einem Bleibehälter an das Bett des Teilnehmers.
   4. Wenn die Injektion zu einem Überlaufen kommt, legen Sie eine Serviette unter den Ellbogen des Teilnehmers, damit die verschüttete Radioaktivität gemessen werden kann.
   5. Entfernen Sie mit einer Pinzette die Kappe/Kanüle von der Spritze und verbinden Sie die Spritze mit Plastikhandschuhen mit dem Infusionszugang. Notieren Sie sich die Zeit auf dem Arbeitsblatt und injizieren Sie in einer gleichmäßigen Bewegung.
      Anmerkungen: Wie bereits erwähnt, sollte die Spritze nicht mit Kochsalzlösung gespült werden, da der Tracer ausfallen kann.
   6. Nehmen Sie die Spritze aus dem Infusionszugang, setzen Sie die Kappe/Kanüle auf und legen Sie sie bei Bedarf in den Elektrodenbehälter mit der Serviette.
   7. Spülen Sie den Infusionszugang mit Salzwasser durch.
   8. Notieren Sie die Zeit und die verbleibende Radioaktivität in der Spritze auf dem Arbeitsblatt.
      HINWEIS: Die injizierte Aktivität wird als Differenz zwischen der Spritzenaktivität vor und nach der Injektion berechnet, wobei jedoch das PET-Scan-Protokoll verwendet wird, um Karies zu korrigieren. So werden alle drei Zeitpunkte (Entnahme-, Injektions- und Restemessung) und die gemessene Radioaktivität bei der Entnahme und den Restemessungen in das PET-Scan-Protokoll eingetragen, wenn der Teilnehmer gescannt wird (siehe Schritt 5).
   9. Entsorgen Sie das übrig gebliebene Material gemäß den Sicherheitsvorschriften der Einrichtung ordnungsgemäß.
   10. Entfernen Sie den IV-Zugang. Falls allergische Reaktionen auftreten, lassen Sie den Infusionszugang 30 Minuten lang drinnen.
2. Orale Verabreichung
   HINWEIS: Ein Arbeitsblatt mit dem Namen des Teilnehmers, einem Stempel oder einer Unterschrift für die Freigabe der Tracer-Qualitätskontrolle sowie Zeitpunkten und Radioaktivität für das Zeichnen, die Verabreichung und den übrig gebliebenen Tracer sollte verfügbar sein.
   1. Gießen Sie in einen Einweg- und Weichplastikbecher etwa 100 ml Wasser oder Likör; die ⁶⁴Cu ist geschmacksneutral. Ein Einweg-Plastikstrohhalm und eine kleine Einweg-Plastiktüte sollten vorhanden sein.
   2. Messen Sie die Radioaktivität in der Spritze mit dem verfügbaren Dosiskalibrator und notieren Sie die Zeit und Aktivität auf dem Arbeitsblatt.
   3. Transportieren Sie die Spritze in einem Bleibehälter an das Bett des Teilnehmers. Der Teilnehmer sollte in einem Bett oder Stuhl sitzen.
   4. Entfernen Sie die Kappe/Kanüle mit einer Pinzette von der Spritze und injizieren Sie den Tracer mit Plastikhandschuhen in den Becher, wobei Sie darauf achten sollten, dass nichts verschüttet wird. Ziehen Sie etwas von dem Wasser/Kräuterlikör auf und injizieren Sie es erneut in die Tasse.
   5. Legen Sie einen Plastikstrohhalm in den Becher (um das Risiko eines Überlaufens beim Trinken zu minimieren).
   6. Notieren Sie sich die Zeit auf dem Arbeitsblatt und lassen Sie den Teilnehmer trinken. Der Becher sollte so leer wie möglich sein.
   7. Legen Sie den leeren Becher und den Strohhalm in die Einweg-Plastiktüte mit der leeren Spritze und legen Sie sie in den Bleibehälter.
   8. Notieren Sie sich die Zeit und messen Sie die verbleibende Radioaktivität in der Spritze. Notiz im Arbeitsblatt.
      HINWEIS: Die injizierte Aktivität wird als Differenz zwischen der Spritzenaktivität vor und nach der Injektion berechnet, wobei jedoch das PET-Scan-Protokoll verwendet wird, um Karies zu korrigieren.
So werden alle drei Zeitpunkte (Entnahme-, Injektions- und Restemessung) und die gemessene Radioaktivität bei der Entnahme und Restemessung in das PET-Scan-Protokoll eingetragen, wenn der Teilnehmer gescannt wird (siehe Scan).
3. Entsorgen Sie das übrig gebliebene Material gemäß den Sicherheitsvorschriften der Einrichtung ordnungsgemäß.
   Anmerkungen: Es kann angemessen sein, den Teilnehmer nach der Einnahme 30 Minuten lang auf akute allergische Reaktionen zu beobachten.

5. PET-Scans

1. Legen Sie den Teilnehmer in Rückenlage in den Scanner.
2. Führen Sie eine Übersichts-CT- oder MR-Untersuchung durch, um die spezifische Region zu planen, die während des PET-Scans untersucht werden soll.
3. Notieren Sie den Zeitpunkt der Entnahme, Injektion und Restemessung sowie die Radioaktivität bei der Entnahme und Restemessung im PET-Protokoll.
4. Führen Sie einen PET-Scan durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   HINWEIS: Das PET-Scan-Protokoll muss in Bezug auf die Scandauer und die Bildrekonstruktionsparameter für alle Teilnehmer derselben Studie standardisiert werden. Veröffentlichten Berichten sollte 10,11,12 gefolgt werden.
   1. Führen Sie statische PET-Scans mit einer Scanzeit von 4,5 min/Bettposition für bis zu 24 h nach Tracer-Verabreichung und 10 min/Bettposition für bis zu 68 h nach Tracer-Verabreichung durch (für weitere Ausführungen siehe Scan unter den repräsentativen Ergebnissen).
      HINWEIS: Beim dynamischen PET-Scannen wird der Zerfall kontinuierlich aufgezeichnet und anschließend in eine Rahmenstruktur segmentiert. Dies ermöglicht die Auswahl von Frames aus kurzen Zeitintervallen, um die Dynamik der ^{64-Cu-Verteilung}zu betonen, und Frames aus längeren Zeitintervallen, um die Empfindlichkeit zu priorisieren. Typischerweise werden kürzere Intervalle direkt nach der Injektion gewählt und danach allmählich erhöht¹⁰.

6. Bildrekonstruktion

1. Rekonstruieren Sie die Bilder mit den besten verfügbaren Korrekturen für Dämpfung, Streuung, Laufzeit und Punktspreizfunktion.
   HINWEIS: Die Parameter für die Bildrekonstruktion müssen sorgfältig ausgewählt werden, um die Bildeigenschaften zu optimieren, wie z. B. Signalwiederherstellung und Signal-Rausch-Verhältnis. Für multizentrische Studien ist es wichtig, die Bildqualität zwischen den Zentren zu standardisieren.

7. Datenanalyse

HINWEIS: Die vorliegende Studie beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung des 64-Cu-Gehalts in der Leber. Das PET-Signal wird als Standard-Aufnahmewert (SUV) gemessen, wobei die Radioaktivitätskonzentration des Gewebes an das Gewicht der injizierten Aktivität des Teilnehmers und/oder Kilobecquerel (kBq) pro ml Gewebe angepasst ist.

1. Laden Sie Daten in ein geeignetes Programm, z. B. Dicom-Dateien, auf PMOD herunter.
   HINWEIS: Es gibt wahrscheinlich viele verschiedene Programme zur Analyse von PET-Bildern, wie z. B. Hermes oder PMOD (siehe Materialtabelle).
2. Passen Sie die CT/MR-Scantöne an, um die anatomischen Strukturen zu unterscheiden.
3. Stellen Sie sicher, dass sich der anatomische Scan und der PET-Scan überlappen.
4. Arbeiten Sie in der horizontalen Ebene mit dem besten MRT- oder CT-Scan, lokalisieren Sie die Leber und die großen Strukturen.
5. Platzieren Sie ein angemessenes Volumen von Interesse (VOI) oder mehrere VOIs in der Leber.
   HINWEIS: Ein VOI ist ein definierter Gewebebereich, in dem der SUV gemessen wird. Ein VOI besteht aus mehreren Regions of Interest (ROIs), bei denen es sich um Gewebebereiche in einer Ebene handelt. Viele Programme haben sphärische VOIs als Voreinstellung, was bedeutet, dass nicht mehrere ROIs (einer in jeder Ebene) gezeichnet werden müssen, um einen VOI zu bilden. Der rechte Leberlappen ist tendenziell homogener und daher eine gute Position, um VOIs zu platzieren.
6. Platzieren Sie mehrere VOIs im rechten Leberlappen in verschiedenen horizontalen Ebenen, um ein möglichst genaues Maß für die Aktivität zu erreichen, da der SUV im rechten Leberlappen etwas variieren kann (~5%). Berechnen Sie den mittleren SUV dieser VOIs.
7. Um den SUV z. B. in der gesamten Leber zu quantifizieren, zeichnen Sie ROIs, die das gesamte Lebervolumen in jeder Ebene für Dosimetriestudien abdecken.
   HINWEIS: Vermeiden Sie bei dieser Methode große Strukturen wie Arterien und Venen.

Ergebnisse

Dosisberechnung
Basierend auf Dosimetrieberechnungen beträgt die effektive Radioaktivitätsdosis für die intravenöse Verabreichung 62 ± 5 μSv/MBq Tracer¹⁰. Daher wird je nach Zeitrahmen eine Dosis von 50 MBq empfohlen. Bis zu 75-80 MBq sind für längere Untersuchungen geeignet und liefern Bilder in guter Qualität, ohne eine ethisch zulässige Dosis zu überschreiten. Die effektive Dosis für die orale Verabreichung beträgt 113 ± 1 μSv/MBq Tracer, was auf die intestina...

Diskussion

Die Methode ist wie jede andere PET-Methode, aber die lange Halbwertszeit von 12,7 h bietet die Möglichkeit, langfristige Kupferflüsse zu untersuchen (wir haben gute Ergebnisse von bis zu 68 h nach intravenöser Tracerinjektion). Alle Schritte des Protokolls müssen von Personal durchgeführt werden, das mit PET vertraut ist, obwohl sie nicht kritischer sind als jede andere PET-Untersuchung.

Fehlerbehebung
Da wir ^{häufig 64}Cu für Langzeituntersuchungen verwend...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 micrometer sterilizing filter	Merck Life Science
Cannula 21 G 50 mm	BD Microlance	301155
Cannula 25 G 16 mm	BD Microlance	300600
Dose calibrator	Capintec CRC-PC calibrator
PET/CT scanner	Siemens: Biograph
PET/MR scanner	GE Signa
PMOD version 4.0	PMOD Technologies LLC
Saline solution 0.9% NaCl	Fresenius Kabi
Sodium acetate trihydrate BioUltra	Sigma Aldrich	71188
Solid 64CuCl2	Danish Technical University Risø
Sterile water	Fresenius Kabi
Venflon 22 G 25 mm	BD Venflon Pro Safety	393280