הדגמה של תרבית יריעות תאים בהרכבה עצמית ויצירה ידנית של אורגנואיד תלת-ממדי דמוי גיד/רצועה באמצעות פיברובלסטים עוריים אנושיים

Summary

כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.

Abstract

גידים ורצועות (T/L) הם מבנים חזקים המאורגנים היררכית המאחדים את מערכת השלד והשרירים. לרקמות אלה יש מטריצה חוץ-תאית עשירה בקולגן מסוג I (ECM) ותאי שושלת T/L המסודרים בקפידה הממוקמים בעיקר בשורות מקבילות. לאחר פציעה, T/L דורשים זמן רב לשיקום עם סיכון גבוה לכישלון ולעתים קרובות תוצאות תיקון לא משביעות רצון. למרות ההתקדמות האחרונה במחקר הביולוגיה של T/L, אחד האתגרים שנותרו הוא שבתחום T/L עדיין חסר פרוטוקול התמיינות סטנדרטי המסוגל לשחזר את תהליך היווצרות T/L במבחנה. לדוגמה, התמיינות עצם ושומן של תאים מקדימים מזנכימליים דורשת רק תרבית תאים דו-ממדית סטנדרטית (2D) ותוספת של אמצעי גירוי ספציפיים. לצורך התמיינות לסחוס, יש צורך בתרבית כדוריות תלת מימדית (תלת מימדית) ותוספת של TGFß. עם זאת, התמיינות תאים לגיד דורשת מודל תרבית תלת ממדי מסודר מאוד, אשר באופן אידיאלי צריך להיות נתון גם לגירוי מכני דינמי. הקמנו מודל אורגנואיד בן 3 שלבים (הרחבה, גירוי והתבגרות) כדי ליצור מבנה דמוי מוט תלת-ממדי מתוך יריעת תאים בהרכבה עצמית, המספקת מיקרו-סביבה טבעית עם גורמי ECM, אוטוקרינים ופרקריניים משלה. לאורגנואידים דמויי מוטות אלה יש ארכיטקטורה תאית רב-שכבתית בתוך ECM עשיר וניתן לטפל בהם די בקלות לחשיפה למתח מכני סטטי. כאן, הדגמנו את פרוטוקול 3 השלבים באמצעות פיברובלסטים עוריים הזמינים באופן מסחרי. אנו יכולים להראות שסוג התא הזה יוצר אורגנואידים חזקים ושופעי ECM. ההליך המתואר יכול להיות ממוטב עוד יותר במונחים של מדיה תרבותית ואופטימיזציה לקראת גירוי מכני צירי דינמי. באותו אופן, מקורות תאים חלופיים יכולים להיבדק עבור הפוטנציאל שלהם ליצור אורגנואידים T / L ובכך לעבור התמיינות T / L. לסיכום, הגישה האורגנואידית התלת-ממדית המבוססת יכולה לשמש כמודל למחקר בסיסי של גידים ואפילו להנדסת T/L ללא פיגומים.

Introduction

גידים ורצועות (T/L) הם מרכיבים חיוניים של מערכת השלד והשרירים המספקים תמיכה חיונית ויציבות לגוף. למרות תפקידן הקריטי, רקמות חיבור אלה מועדות להתנוונות ולפציעות, הגורמות לכאב ולפגיעה בניידות¹. יתר על כן, אספקת הדם המוגבלת שלהם ויכולת הריפוי האיטית שלהם עלולים להוביל לפציעות כרוניות, בעוד שגורמים כגון הזדקנות, תנועה חוזרת ונשנית ושיקום לא תקין מגבירים עוד יותר את הסיכון לניוון ופציעה². טיפולים קונבנציונליים, כגון מנוחה, פיזיותרפיה והתערבויות כירורגיות, אינם מסוגלים לשחזר באופן מלא את המבנה והתפקוד של T/L. במהלך השנים האחרונות, חוקרים שאפו להבין טוב יותר את האופי המורכב של T / L על מנת לחפש טיפולים יעילים להפרעות T / L

Protocol

הערה: כל השלבים חייבים להתבצע באמצעות טכניקות אספטיות.

1. תרבות וטרום התרחבות של NHDFs

1. הפשירו במהירות את בקבוקון ההקפאה המכיל פיברובלסטים עוריים אנושיים רגילים (NHDFs, 1 x 10⁶ תאים) בטמפרטורה של 37°C עד שהם כמעט מפשירים.
2. יש להוסיף באיטיות 1 מ"ל של מדיום גידול פ.......

Discussion

התוצאות שהודגמו במחקר זה מספקות תובנות חשובות לגבי ביסוס ואפיון מודל האורגנואיד התלת-ממדי NHDF לחקר רקמות T/L. פרוטוקול 3 השלבים הוביל להיווצרות אורגנואידים דמויי מוט תלת-ממדי המציגים תכונות אופייניות של נישת T/L. מודל זה דווח בעבר ב- Kroner-Weigl et al. 2023⁷ והודגם בפירוט רב כאן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B