Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, demonstramos um modelo organoide de três etapas (expansão bidimensional [2D], estimulação 2D, maturação tridimensional [3D]) oferecendo uma ferramenta promissora para pesquisa fundamental de tendões e um potencial método livre de andaimes para engenharia de tecidos tendinosos.

Abstract

Tendões e ligamentos (T/L) são estruturas fortes e hierarquicamente organizadas que unem o sistema musculoesquelético. Esses tecidos têm uma matriz extracelular (MEC) rica em colágeno tipo I estritamente disposta e células da linhagem T/L posicionadas principalmente em fileiras paralelas. Após a lesão, o T/L requer muito tempo para reabilitação com alto risco de falha e resultados de reparo muitas vezes insatisfatórios. Apesar dos recentes avanços na pesquisa em biologia T/L, um dos desafios remanescentes é que o campo T/L ainda carece de um protocolo de diferenciação padronizado que seja capaz de recapitular o processo de formação T/L in vitro. Por exemplo, a diferenciação óssea e gordurosa de células precursoras mesenquimais requer apenas cultura de células bidimensionais (2D) padrão e a adição de meios de estimulação específicos. Para diferenciação em cartilagem, é necessária cultura tridimensional (3D) de pellets e suplementação de TGFß. No entanto, a diferenciação celular para o tendão precisa de um modelo de cultura 3D muito ordenado, que idealmente também deve ser submetido a estimulação mecânica dinâmica. Estabelecemos um modelo organoide de 3 etapas (expansão, estimulação e maturação) para formar uma estrutura 3D semelhante a uma haste a partir de uma folha de células automontada, que fornece um microambiente natural com seus próprios fatores ECM, autócrinos e parácrinos. Esses organoides em forma de bastonete têm uma arquitetura celular de várias camadas dentro de um ECM rico e podem ser manuseados com bastante facilidade para exposição a tensão mecânica estática. Aqui, demonstramos o protocolo de 3 etapas usando fibroblastos dérmicos disponíveis comercialmente. Pudemos mostrar que esse tipo de célula forma organoides robustos e abundantes em MEC. O procedimento descrito pode ser ainda mais otimizado em termos de meios de cultura e otimizado para estimulação mecânica axial dinâmica. Da mesma forma, fontes celulares alternativas podem ser testadas quanto ao seu potencial para formar organoides T/L e, assim, sofrer diferenciação T/L. Em suma, a abordagem organoide 3D T/L estabelecida pode ser usada como modelo para pesquisa básica de tendões e até mesmo para engenharia T/L sem andaimes.

Introduction

Tendões e ligamentos (T/L) são componentes vitais do sistema músculo-esquelético que fornecem suporte e estabilidade essenciais ao corpo. Apesar de seu papel crítico, esses tecidos conjuntivos são propensos à degeneração e lesão, causando dor e comprometimento da mobilidade1. Além disso, seu suprimento sanguíneo limitado e capacidade de cicatrização lenta podem levar a lesões crônicas, enquanto fatores como envelhecimento, movimentos repetitivos e reabilitação inadequada aumentam ainda mais o risco de degeneração e lesões2. Os tratamentos convencionais, como repouso, fisioterapia e intervenções cirúrgicas, são incapazes ....

Protocol

NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas por meio de técnicas assépticas.

1. Cultura e pré-expansão dos NHDFs

  1. Descongelar rapidamente o frasco criogênico contendo fibroblastos dérmicos humanos normais criopreservados adultos (NHDFs, 1 x 106 células) a 37 ° C até que estejam quase descongelando.
  2. Adicione lentamente 1 mL de meio de crescimento de fibroblastos pré-aquecido 2 (kit pronto para uso incluindo meio basal, soro fetal de bezerr.......

Representative Results

O modelo organoide 3D T/L foi previamente estabelecido e demonstrado aqui pela implementação de NHDF comprado comercialmente (n=3, 3 organoides por doador, NHDF foram usados nas passagens 5-8). O fluxo de trabalho do modelo está resumido na Figura 1. A Figura 2 mostra imagens representativas de contraste de fase da cultura de NHDF durante a pré-expansão em frascos T-75 (Figura 2A), bem como no início e após 5 dias de cultura .......

Discussion

Os resultados demonstrados neste estudo fornecem informações valiosas sobre o estabelecimento e caracterização do modelo organoide 3D NHDF para o estudo de tecidos T/L. O protocolo de 3 etapas levou à formação de organoides 3D semelhantes a bastonetes que exibem características típicas do nicho T / L. Este modelo foi relatado anteriormente em Kroner-Weigl et al. 20237 e demonstrado em grande detalhe aqui.

As imagens de contraste de fase apresentadas na.......

Acknowledgements

DD e SM-D. reconhecer a Concessão BMBF "CellWiTaL: Sistemas celulares reprodutíveis para pesquisa de medicamentos - impressão a laser sem camada de transferência de células únicas altamente específicas em estruturas celulares tridimensionais" Proposta Nr. 13N15874. DD e VRA reconhecem a concessão da UE MSCA-COFUND OTASKILLS "Treinamento holístico de pesquisas de osteoartrite de próxima geração" GA Nr. 101034412. Todos os autores agradecem à Sra. Beate Geyer pela assistência técnica.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany  A8960
10 cm adherent cell culture dishSigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430167
10 cm non-adherent petri dish Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430591
Cryo-mediumTissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands  4583
Cryomold standard Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands4557
D(+)-Sucrose AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, GermanyA2211
DMEM high glucose medium Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany DMEM-HA
DMEM low glucoseCapricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  DMEM-LPXA
Fetal bovine serum Anprotec, Bruckberg, Germany AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2 PromoCell, Heidelberg, Germany  C-23020
Inverted microscope with high resolution cameraZeissNAZeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  NEAA-B
Metal pins EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic 04.31
Normal human dermal fibroblasts  PromoCell, Heidelberg, Germany C-12302
Paraformaldehyde AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A3813
Penicillin/streptomycin Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany15140122
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P4417
TGFß3 R&D Systems, Wiesbaden, Germany  8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  TRY-1B

References

  1. Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
  2. Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D.

Explore More Articles

BioengenhariaEdi o 208tend esligamentosfibroblastos d rmicosautomontagemorganoides tridimensionais 3Dengenharia de tecidos sem andaimes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved