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摘要

该协议介绍了可用于在大分子的冷冻EM图谱中建模小分子配体的工具。

摘要

破译大分子复合物中的蛋白质-配体相互作用对于理解分子机制、潜在的生物学过程和药物开发至关重要。近年来，低温样品电子显微镜（cryoEM）已成为确定大分子结构和研究近原子分辨率配体结合模式的有力技术。由于目标分子的各向异性分辨率和数据中固有的噪声，在冷冻电磁图谱中识别和建模非蛋白质分子通常具有挑战性。在本文中，向读者介绍了目前用于配体鉴定、模型构建和使用选定大分子细化原子坐标的各种软件和方法。如烯醇化酶所示，识别配体存在的最简单方法之一是减去有和没有配体获得的两张图谱。即使在更高的阈值下，配体的额外密度也可能在差异图中脱颖而出。在某些情况下，如代谢型谷氨酸受体 mGlu5 的情况所示，当无法生成这种简单的差异图时。最近引入的推导Fo-Fc省略图的方法可以作为验证和证明配体存在的工具。最后，以经过充分研究的β-半乳糖苷酶为例，分析了分辨率对冷冻电子显微镜图谱中配体和溶剂分子建模的影响，并对冷冻电子镜在药物发现中的应用进行了展望。

引言

细胞通过同时独立地进行无数的化学反应来实现其功能，每个化学反应都经过精心调节，以确保它们的生存和对环境线索的适应性。这是通过分子识别实现的，它使生物分子（尤其是蛋白质）能够与其他大分子以及小分子或配体形成瞬时或稳定的复合物1。因此，蛋白质-配体相互作用是生物学中所有过程的基础，包括蛋白质表达和活性的调节、酶对底物和辅因子的识别，以及细胞如何感知和传递信号 1,2。更好地了解蛋白质-配体复合物的动力学、热力学和结构特性揭示了配体相互作用的分子基础，并通过优化药物相互作用和特异性促进了合理的药物设计。研究蛋白质-配体相互作用的一种经济且更快的方法是使用分子对接，这是一种计算方法，可以虚拟筛选各种小分子并预测这些配体与靶蛋白的结合模式和亲和力3。然而，通过 X 射线衍射 （XRD）、核磁共振 （NMR） 或电子冷冻显微镜 （cryoEM） 确定的高分辨率结构的实验证据为此类预测提供了必要的证据，并有助于开发针对给定靶点的更新、更有效的激活剂或抑制剂。本文使用缩写“cryoEM”，因为该技术通常被称为“cryoEM”。然而，关于选择正确的命名法一直存在争议，最近，有人提出了术语冷冻基因样本 Electron Microscopy （cryoEM） 来表示样本处于低温并用电子成像4。同样，从冷冻电镜得出的图被称为电子电位、静电势或库仑电位，为了简单起见，这里我们使用冷冻电镜图5,6,7,8,9,10。

尽管 XRD 一直是蛋白质-配体复合物高分辨率结构测定的金标准技术，但分辨率革命后的11 cryoEM 已经获得了动力，正如过去几年中沉积在电子显微镜数据库 （EMDB） 12 中的库仑电位图或冷冻 EM 图的激增所表明的那样 14。由于样品制备、成像和数据处理方法的进步，2010 年至 2020 年间，使用冷冻电镜的蛋白质数据库 （PDB）14 沉积数量从 0.7% 增加到 17%，2020 年报告的结构中约有 50% 是以 3.5 Å 或更高的分辨率确定的 15,16。CryoEM 已迅速被包括制药行业在内的结构生物学界采用，因为它允许以近原子分辨率研究柔性和非结晶性生物大分子，尤其是膜蛋白和多蛋白复合物，克服了结晶过程并获得通过 XRD 进行高分辨率结构测定所需的衍射良好的晶体。

在cryoEM图谱中准确建模配体至关重要，因为它在分子水平上是蛋白质-配体复合物的蓝图。X 射线晶体学中使用了几种自动配体构建工具，这些工具依赖于配体密度的形状和拓扑结构，以便将配体拟合或构建到电子密度中 17,18,19,20。然而，如果分辨率低于 3 Å，这些方法往往会产生不太理想的结果，因为它们识别和构建所依赖的拓扑特征变得不那么明确。在许多情况下，这些方法已被证明在将配体准确建模到 cryoEM 图谱中是无效的，因为这些图谱是在中低分辨率范围内确定的，通常在 3.5 Å-5 Å17 之间。

使用 cryoEM 测定蛋白质-配体复合物 3D 结构的第一步包括将配体与蛋白质共纯化（当配体与蛋白质具有高结合亲和力时）或在网格制备之前将蛋白质溶液与配体孵育特定持续时间。随后，将少量样品放置在等离子体清洁的多孔透射电镜网格上，然后在液态乙烷中快速冷冻，最后使用冷冻透射电镜成像。对数十万到数百万个单个粒子的 2D 投影图像进行平均，以重建大分子的 3D （3D） 库仑势图。在许多情况下，由于图谱上的各向异性分辨率（即大分子之间的分辨率不均匀）、配体结合区域的灵活性以及数据中的噪声，这些图谱中的配体和溶剂分子的识别和建模带来了重大挑战。许多为 XRD 开发的建模、改进和可视化工具现在正被用于冷冻电子市场，用于相同的目的 18,19,20,21。在本文中，概述了目前用于识别配体、构建模型和优化从 cryoEM 得出的坐标的各种方法和软件。已经提供了一个分步方案来说明使用具有不同分辨率和复杂性的特定蛋白质-配体复合物对配体进行建模所涉及的过程。

在冷冻EM图谱中对配体进行建模的第一步包括识别图谱中的配体密度（非蛋白质）。如果配体结合不会引起蛋白质的任何构象变化，那么计算蛋白质-配体复合物和载脂蛋白之间的简单差异图基本上突出了额外密度的区域，表明配体的存在。这种差异可以立即观察到，因为它只需要两张图谱，甚至在3D细化过程中的中间图也可以用来检查配体是否存在。此外，如果分辨率足够高 （<3.0 Å），那么差异图还可以深入了解水分子的位置以及与配体和蛋白质残基相互作用的离子。

在没有 apo-protein maps 的情况下，现在可以使用 Servalcat22，它可作为独立工具使用，并且作为 Refmac 改进的一部分也已集成到 CCP-EM 软件套件 23,24 和 CCP4 8.0 版本25,26 中。Servalcat 允许使用未锐化的半图和载脂蛋白模型作为输入来计算 FSC 加权差 （Fo-Fc） 图。Fo-Fc 省略图表示实验图（Fo）和从模型派生的图（Fc）之间的差异。在模型中没有配体的情况下，Fo-Fc图谱中的正密度与实验EM图谱重叠通常表明配体的存在。这里的假设是蛋白质链在图谱中拟合良好，剩余的正密度表明配体的位置。然而，重要的是要仔细检查正密度是否源于建模的不准确性，例如蛋白质侧链的错误转子。

第二步涉及从可用的化学信息中获取或创建配体的笛卡尔坐标文件，该配体具有明确定义的几何形状。CCP4 单体库中已有的标准配体（例如，ATP 和 NADP+）可以通过其单体登录代码检索坐标和几何文件来用于精细化。但是，对于未知或非标准配体，可以使用各种工具来创建几何文件。其中一些示例包括 Phenix28 中的 eLBOW27 - （电子配体构建器和优化工作台）、Lidia - Coot29 中的内置工具、JLigand/ACEDRG30,31、CCP-EM23,24、Ligprep32-薛定谔套件中的 Glide 模块。然后，在实验冷冻电镜图和Coot中的差异图的指导下，将配体坐标文件拟合到密度中。接下来是 Phenix28 中的实时空间细化或 Refmac33 中的倒数细化。需要 Linux 工作站或配备优质显卡和上述软件的笔记本电脑。这些程序中的大多数都包含在各种套件中。CCP-EM24 和 Phenix28 可供学术用户免费使用，并包含本文中使用的各种工具，包括 Coot、Refmac533、34、35、36、Servalcat、phenix.real_space_refine 等。同样，Chimera37 和 ChimeraX38 为学术用户提供免费许可证。

研究方案

1. 结核分枝杆菌烯醇化酶中的磷酸烯醇丙酮酸 （PEP） 建模

  1. PEP-烯醇化酶复合物冷冻电镜图中配体密度的鉴定
    1. 从 EMDB 中的其他数据中下载 apo-烯醇化酶的未锐化半图（emd_30988_additional_1.map 和 emd_30988_additional_2.map）（参见 材料表）。
    2. 打开 ChimeraX（参见 材料表）。通过单击工具栏中的“ 打开 ”并选择文件名来打开 apo-烯醇化酶的半图。在命令行中键入 vop add #1 #2 以合并两个半映射以获得 apo-enolase 未锐化映射。
      注意：#1 和 #2 表示 apo-烯醇化酶的两个半图，如步骤 1.1.1 中所述。
    3. 通过键入 rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map 重命名组合地图（ChimeraX 地图 ID：#3）。从模型面板中将地图设置为灰色。该图表明，烯醇化酶在溶液中是八聚体，具有 D4 对称性。
    4. 使用以下半映射重复步骤 1.1.1-1.1.3 emd_30989_additional_1.map（映射 ID：4）和 emd_30989_additional_2.map（映射 ID：5）以获取 PEP-烯醇化酶未锐化映射（映射 ID：#6）。
    5. 为了计算差异图，首先通过单击ChimeraX的地图面板（工具栏）中的拟合（图中图）将两个图（步骤1.1.3和步骤1.1.4中的PEP-烯醇化酶和apo-烯醇化酶未锐化图）相互拟合。
      注意：在两个映射之间不执行归一化。在某些情况下，可能需要进行归一化才能使地图达到相同的比例。
    6. 通过在命令行中键入 vop subtract #6 #3 ，从 apo-enolase 图中减去 PEP-烯醇化酶图。
      注意：#6 = PEP-烯醇化酶未锐化映射，#3 = Apo-烯醇化酶未锐化映射。
    7. 将减去的图谱（图ID：7）涂成绿色，表示正密度（按照X射线晶体学的惯例）39。
    8. 从蛋白质数据库 （PDB） 下载 结核分 枝杆菌八聚体烯醇化酶 （PDB： 7e4x） 的坐标，单击工具栏中的 打开 ，然后选择 文件名。
    9. 通过在命令行中键入 rename #8 Apo_enolase.pdb 来重命名模型 7e4x.pdb。#8 表示 ChimeraX 中的 Apo_enolase.pdb。
    10. 从模型面板中选择模型。单击工具栏中的鼠标右键。单击“移动分子”，将模型放置在靠近 PEP-烯醇化酶图（#2） 的位置，并使模型相对于图对齐。通过在命令行中键入 fit #8 in #6，将此模型拟合到 PEP-enolase-unsharpened-map 中。在这里，地图编号为 6，模型编号为 8。
      注意：在某些情况下，ChimeraX 中的局部拟合可能不足以对齐模型。在这些情况下，可以在 Phenix 中执行额外的全局拟合步骤（DockinMap，参见 材料表）。
    11. 通过在命令行中键入 save Apo-enolase.pdb #8 来保存拟合模型。
  2. PEP-烯醇化酶复合物的 B 因子锐化冷冻电镜图中 PEP 的建模和细化
    1. 通过键入 ./Coot & 从端子打开“coot”（参见材料表）。
    2. 通过单击 “文件”>打开坐标 Apo-enolase.pdb 来显示“Apo-enolase.pdb”。坐标文件由键显示（颜色由原子显示）。
    3. 从 EMDB 下载 PEP 结合的烯醇化酶锐化地图，即 emd_30989.map。通过单击 “文件”>“打开地图”> emd_30989.map 来显示相同的内容。通过滚动鼠标中键将阈值设置为 7.00 σ 。
    4. 通过单击“ 验证”>“未建模的 blobs”>“查找 Blob”来查找未建模的 blob。
    5. 在烯醇化酶模型的活性位点残基 Ser 42、Lys-386 和 Arg-364 附近找到未建模的配体密度。
    6. 通过单击 “文件”>“获取单体 ”并从 Coot 单体库中获取 PEP 单体模型文件，然后输入 PEP 作为 3 个字母的代码。
    7. 使用侧边栏菜单中的旋转/平移-区域/链/分子选项将 PEP 分子移动到密度。在 Coot 中使用实时空间细化，通过单击侧边栏菜单中的 Real Space Refine Zone，将 PEP 分子拟合到密度中。使用编辑选项卡中的合并分子选项将拟合的配体与 Apo-enolase.pdb 合并。将模型另存为 PEP-Enolase.pdb。
      注意：也可以使用 配体>Jiggle-Fit 配体 选项来拟合配体。
    8. 要将配体添加到坐标文件中的其余单体中，请单击 “计算 NCS 工具> NCS 配体>。将出现一个名为“查找 NCS 相关配体”的单独窗口。对于 Protein with NCS 选项，选择坐标文件 Apo-enolase.pdb 和 链 ID A 作为 NCS 主链。
      1. 对于含有配体的分子，选择 Apo-enolase.pdb 作为坐标文件， 并选择链 ID、J 和残基编号 1 到 1。点击 “查找候选人职位”。将出现一个名为“拟合配体”的窗口，其中包含候选位置的列表。通过单击单个候选配体来评估拟合，并直观地分析拟合。
        注意：在Servalcat/Refmac中，只能提供单体模型，可以给出重建中使用的对称性来获得扩展模型。
    9. 在配体附近还观察到溶剂分子的额外密度。来自各种同系物的烯醇化酶的高分辨率晶体结构表明存在两个 Mg2+ 离子40,41，这可能稳定了反应中间体的负电荷。通过单击“将原子置于指针上”并从“指针原子类型”列表中选择“MG”，对活性位点密度中的两个 Mg2+ 离子进行建模。
      注意：键的几何形状和距离可用作选择金属离子的指南。在 Mg2+ 与蛋白质残基中的氧原子结合的情况下，键距在 2.1 Å -2.4 Å 之间变化，具有八面体几何形状。但是，在低分辨率地图的情况下，协调球通常是不完整的，并且由于分辨率的限制，距离也可能有所不同。
    10. 重复步骤1.2.8，以在对称性相关单体中添加Mg2+ 离子。
    11. 通过单击 “文件”>“保存坐标”>“选择文件名 >”并键入 Enolase+PEP+Mg.pdb 来保存模型。
    12. 打开 Phenix 图形用户界面 （参见 材料表）。使用默认参数，分别使用 Enolase+PEP+Mg.pdb 和 emd_30989.map 作为输入模型和地图来运行真实空间细化作业。此步骤是使用 Coot 迭代完成的，以实现良好的地图模型拟合和几何形状。
      注意：未锐化的差异图用于演示配体的存在，例如在图中。出于建模目的，已使用并建议使用 B 因子锐化贴图。与未锐化映射相比，B 因子锐化映射也可用于计算差异映射以进行演示。但是，如果配体结合区域的分辨率较低，则用于锐化整个图谱的单个B因子可能无法清楚地揭示配体密度。
  3. 建模配体的可视化和图形生成
    1. 通过单击“文件”>“打开”并选择文件名，从PyMOL42中的最终Phenix精炼作业中打开精制的烯醇化酶+PEP+Mg模型（参见材料表）。
    2. 通过单击“打开文件”并选择文件名来加载 emd-30989.map（PEP 绑定>锐化地图）。
    3. 通过单击针对emd_30989对象重命名的操作>并键入 PEP-sharpened，将地图重命名为 PEP-sharpened。
      注意：在大多数情况下，例如烯醇化酶，在 pymol 中打开时的映射会被归一化，因为在 pymol 中默认选中归一化映射选项。由于冷冻电磁图以一个更大的盒子为中心，因此归一化将包括盒子中的所有内容。因此，在 pymol 中打开之前，可以关闭归一化。
    4. 通过单击 “显示>序列”来选择配体。
    5. 在命令行中键入 isomesh mesh_ligands， PEP-sharpened， 6.0， sele， carve=3.0，然后按 回车键。
    6. 通过单击mesh_ligand对象旁边的最后一个框 C，将mesh_ligand着色为蓝色。
    7. 显示活性位点残基 Ser-42、Asp-241、Glu-283、Asp-310、Arg-364 和 Lys-386 分别在棒状和球状表示中与 PEP 和 Mg2+ 相互作用，并在卡通表示中显示烯醇化酶。
    8. 通过键入 ray 3600、3600 生成出版质量的图像，并通过单击 “文件”>保存 并选择 PEP.png 作为文件名来另存为 png 文件。

2. 代谢型谷氨酸受体 mGlu 5 中配体的建模

  1. 识别和建模激动剂和拮抗剂结合的 mGlu 的 cryoEM 图中的配体密度5
    1. 下载两个半图以及每个激动剂结合 （EMD-31536、7fd8.pdb） 和拮抗剂结合 （EMD-31537,7fd9.pdb） mGlu5 复合物的相应坐标文件。
    2. 打开 ChimeraX
      1. 单击“ 打开 ”并选择“7fd8.pdb”，打开坐标文件 7fd8.pdb。
      2. 在命令行中键入 delete ligand ，然后按 Enter 键。
      3. 同样，使用命令 delete/B 删除链 B。
        注意：可以使用顶部的下拉菜单使用 选择 和 操作>原子/键>删除来删除配体和链。
      4. 通过在命令行中键入以下内容来保存未配体的 pdb： save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1。#1 表示模型 ID。
      5. 对 7fd9.pdb 重复步骤 2.1.2.1-2.1.2.4。
    3. 打开 CCP-EM。创建一个名为 mGlu5 的新项目，并指定项目目录和用户名。
      1. 从左侧面板的选项中打开 Relion 。
        1. 转到 Mask Creation 选项卡。
        2. 提供 EMD-31536 的其中一个半图作为输入。
          注意：Relion 接受带有 .mrc 作为后缀的地图，而 EMD 地图具有 .map 后缀。地图文件可以在ChimeraX中打开以供检查，并以.mrc格式保存。
        3. 在 掩模 选项卡中，提供 0.89 Å 的像素大小和 0.007 的初始二值化阈值。
        4. 使用别名 31536（或任何其他易于遵循的名称）运行作业。
        5. 同样，为 EMD - 31537 半贴图创建掩膜。
      2. 从CCPEM左侧面板的选项中打开 Refmac Servalcat 程序。
        1. 提供名称为 mGlu5_agonist。
        2. 按照模型部分 2.1.2.4 中所述导入7fd8_noligand_chainA .pdb 文件。提供两个半贴图的位置以及在 Relion 中创建的相应蒙版。
        3. 将分辨率指定为 3.8 Å。
        4. 转到 Strict Symmetry >细化设置 ，并提及 C2 作为 Relion 点群对称性。
        5. 按下顶部的开始按钮启动程序。
    4. 作业完成后，在 Coot 中打开结果（选项位于结果部分的顶部）。默认情况下，这将在 Coot 中显示 diffmap.mtz，其中红色和绿色分别表示负和正密度。
      1. 转到 显示管理器> 标记为 DELFWT PHDELWT 的差异映射的属性，并将等值线级别更改为 4.0 （绝对值）。
        注意：阈值的选择取决于地图和分辨率。
      2. 隐藏标记为 FWT PHWT 的映射和标记为 refined.pdb 的分子。
      3. 使用鼠标移动地图以可视化正密度（绿色），并将较大的斑点置于中心。
      4. 转到 文件>获取单体，键入 QUS，然后按 回车键。
      5. 转到 Calculate > Modeling > Rigid Body Fit 分子 ，然后双击 QUS 单体以调整分子以适应 Fo-Fc 密度。
      6. 使用编辑选项卡中的合并分子选项将 QUS 分子添加到坐标文件 refined.pdb。
      7. 重复步骤 2.1.4.3-2.1.4.6，分别在细胞外和跨膜结构域顶部的较小斑点中拟合具有单体代码 NAG 和 CHS 的配体。
      8. 将坐标另存为 refined_ligands.pdb。
        注意：跨膜 （TM） 结构域的分辨率较低，因此此处不讨论。
  2. mGlu5 配体结构的改进
    1. 打开 CCPEM 并克隆上一个优化作业（步骤 2.1.3.2），并使用 refined_ligands.pdb 和锐化映射 （emd.31536.mrc） 作为输入，使用默认参数和 C2 对称性。
      注意：如果程序无法识别配体，则需要提供 CIF 文件。这些 CIF 文件可以从 PDB 下载或使用各种程序生成（有关详细信息，请参阅步骤 3.1.1）。
  3. PyMOL中的可视化和图形生成
    1. 在 PyMOL 中打开最新的 Refmac 优化作业中的 refined_expanded.pdb 模型。
    2. 转到 File > Open 并浏览到 Refmac 作业目录以加载 diffmap_normalised_fofc.mrc（与步骤 2.1.3.2 中的 Servalcat 作业的差异映射）文件。
      注意：如果 .mrc 扩展名文件在浏览时不可见，请将文件类型更改为 所有文件 并浏览。
    3. 使用 显示>序列选择配体。
    4. 转到 “操作 ”按钮，然后将选择重命名为配体。
    5. 在命令行中键入以下内容 并按回车键：isomesh mesh_ligands， diffmap_normalised_fofc， 6.0， ligands， carve=2.5。
      注意： 网格宽度可以调整。这里使用 0.2 网格宽度，这是使用以下命令设置的： set mesh_width=0.2。
    6. 右键单击其中一个 单体 ，然后转到 链接>颜色 以指定每个单体的颜色。使用配体中 标记为 c 的最后一个框 为配体和网格着色，并mesh_ligands对象。mGlu5 受体二聚体以卡通表示形式显示，单体呈蓝绿色和小麦色。配体以棒状显示，构成配体轮廓的网状物为绿色。
    7. 使用 对对象>定向/居中/缩放 选项的操作，并手动调整以清晰地可视化网格。选择附近可能与配体相互作用的残基，例如，QUS 的 Tyr64、Trp100，并根据需要显示它们的侧链或主链或两者作为棒状表示。
    8. 光线追踪可生成高分辨率图像并将其保存为 png 文件。
      注：对拮抗剂绑定图EMD-31537和相应的坐标文件PDB-7fd9重复上述步骤。

3. 在高分辨率锐化β-半乳糖苷酶图谱中对抑制剂、脱氧半乳糖-野尻霉素 （DGN） 和溶剂分子进行建模

  1. 使用 cryoEM 的半图鉴定配体 DGN
    1. 用于建模的未知配体字典的制备 [Deoxygalacto-nojirimycin（DGN）]
      注：脱氧半乳糖-nojirimycin 字典文件作为 DGJ（3 个字母配体 ID）包含在 CCP4 单体库中。然而，这里它被认为是一种新的和未知的配体，以说明为未知配体生成字典文件的过程，DGN 用作 3 个字母的代码。
      1. 在 PubChem 网页中打开脱氧半乳糖-野尻霉素 （DGN） 的化合物摘要，并复制化合物脱氧半乳糖-野尻霉素的微笑字符串。
      2. Open Phenix > 配体 > eLBOW.
      3. 将 smiles 字符串指定为输入。
      4. 指定适当的配体构建优化方法。这里，使用了简单的优化。
      5. 将化学微笑字符串粘贴到配体定义部分。
      6. 提供适当的职位名称、输出文件前缀和配体 ID，然后按运行。
        注意：作业的输出包含坐标文件 DGN.pdb 和字典文件 DGN.cif 文件。Jligand29 也可用于制作 cif 文件。
    2. 从 PDB 下载 β-半乳糖苷酶坐标文件 （6tsh.pdb），并使用文本编辑器或 Coot 中的删除链/区域选项删除蛋白质链（B、C、D）、配体、DGN 和其他溶剂分子的坐标。将坐标文件另存为 apo-betaGal_chainA.pdb。
      注意：ChimeraX 或 Pymol 也可用于去除配体/溶剂分子。
    3. 从 EMDB 的 EMD-10563 条目的其他数据中下载半地图（emd_10563_half_map_1.map 和 emd_10563_half_map_2.map）。
    4. 打开 CCPEM 并使用 Relion 在阈值 0.01 处为地图创建掩码（如步骤 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4 中所述）。
    5. 使用步骤 3.1.3 中获得的半映射和步骤 3.1.2 中获得的 apo 模型和 D2 对称性运行 Servalcat（在步骤 2 中所述的 CCPEM 套件中）。
      注意：模型必须与半图或全图之一对齐，以定位配体密度。这可以通过使用 ChimeraX 将模型拟合到地图中，然后保存相对于半地图的坐标来完成。在此示例中，半贴图和EMDB中的主贴图具有不同的框大小/网格，需要将模型放置在半贴图中。
    6. 打开 Coot。
      1. 打开 DGN.cif 以获取在步骤 3.1.1 中使用 Phenix eLBOW 生成的配体字典。这是通过转到 文件>导入 CIF 字典 并浏览 eLBOW 作业目录来完成的。
      2. 打开蛋白质和配体坐标文件，分别是步骤 3.1.2 中的 apo-betaGal_chainA.pdb 和步骤 3.1.6 中的 DGN.pdb。
      3. 从 Servalcat 作业（步骤 3.1.5）自动打开 diffmap.mtz 文件，并在 Coot 中可视化标记为 DELFWT PHDELWT 的地图。在阈值 ~ 4 绝对值处绘制地图轮廓。
        注意：通过键入 标题 map.mrc 或使用 Chimera 中的工具来检查地图统计信息非常重要。可以获得有关像素大小、框大小、最小值、平均值和最大密度以及与平均密度的均方根偏差的所有必要信息。检查冷冻EM图谱的像素大小和盒子大小至关重要。3D 图表示 3D 体素网格中的蛋白质-配体图体积。在每个体素中，都存储了电子势值或在该位置找到电子的概率。当选择某个阈值时，密度低于指定值的体素将设置为零。这有助于最小化地图中的实验噪声，并更好地可视化地图特征43.因此，地图的轮廓应设置在一个阈值处，在该阈值下，地图要素易于看到，并且地图中的噪声最小。
      4. 转到 配体>查找配体。在出现的新窗口中，选择配体、差值图和 apo-betaGal_chainA.pdb 模型。将其他选项保留为默认设置，然后单击“ 查找配体 ”以开始搜索。
      5. 显示潜在配体密度的热门命中列表，并在每个密度中放置一个副本。手动检查放置配体的所有命中。保留最可能的命中，并删除模棱两可的命中。
        注：在高阈值下图谱密度的差异清楚地表明活性位点中存在配体。
  2. 对配体 DGN 和溶剂分子进行建模
    1. 在Coot中进行 实空间细化 ，使配体（DGN.pdb）拟合到差密度图中，然后将配体坐标与apo-betaGal_chainA.pdb 合并 ，另存为betaGal_chainA+ligand.pdb。
      注意：在保存合并的坐标文件时，可以删除已放置在其他链区域的配体，并且不会合并。其他链中的配体可以通过NCS配体生成，如示例1，步骤1.2.8所示，或者在Refmac / Servalcat中使用对称扩展。
    2. 如上所述（步骤 3.1.5）运行另一个 Servalcat 作业，将 betaGal_chainA+ligand.pdb 作为输入模型，并使用 D2 对称性进行半映射（来自步骤 3.1.3）。
    3. 建模配体周围的差异密度（来自步骤 3.2.2 的 Servalcat 作业）表明存在与配体分子配位的溶剂分子。对于水分子来说，靠近配体的中心密度似乎太大。
    4. 根据先前的生化和结构数据表明该位置存在 Mg2+，通过单击放置原子选项并将原子指定为 MG，可以在此处对 Mg2+ 离子进行建模。
    5. 通过单击指针处的放置原子并选择水，对活性位点中指示溶剂分子存在的不同密度中的水分子进行建模。
      注意：Coot 还可以选择自动选择水分子。在这里，由于焦点仅在活性位点上，因此水分子是手动添加的。
    6. 将 Mg2+ 和水的坐标与 betaGal+ligand.pdb 文件合并，并将其另存为 betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb。
    7. 使用 betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb，在具有 D2 对称性的 Servalcat 中执行 Refmac 细化。
      注意：此作业的输出差值图可以作为一种方法来验证配体是否已准确建模，因为差值图应显示最小的残余正或负密度。
  3. 使用 PyMOL 进行可视化和图形生成
    注意：下面概述的步骤提供了一些使用模型和图谱制作图形的示例，这些模型和图谱可用于说明配体和溶剂的存在。
    1. 打开最后一个Servalcat作业（步骤3.2.6）的refined_expanded.pdb，并对配体和溶剂进行建模。
    2. 分别选择不同的链，将它们染成洋红色、黄色、绿色和蓝绿色，如示例 2 中所述。
    3. 转到 “显示>序列”，分别选择水分子、镁和 DGN，并将对象分别重命名为水、MG 和 DGN。
    4. 通过选择 对象，右键单击并 显示球体，将 MG 和水分子显示为球体>。同样，以棒状表示形式显示配体，并适当地为配体和溶剂着色。在这种情况下，配体被杂原子染成黄色，镁离子被染成紫色，水分子被染成红色。
    5. 选择 DGN、MG 和 水分子。右键单击并选择 >复制到对象的操作 ，并将其命名为配体。
    6. 在步骤 3.2.6 中打开 Servalcat 作业中的 diffmap_normalised_fo.mrc，并重命名为 ligand_fo.mrc。键入以下命令： isomesh mesh_ligands_fo， ligand_fo， 3， ligands， carve=2。
      注意：2 Å 的雕刻选项应用于原子周围，根据地图的分辨率和质量，可以使用 3-5 的值。此外，在 PyMOL 中打开 cryoEM 地图时，建议将normalize_ccp4_maps设置为关闭。
    7. 使用 定向/缩放选项>操作 并手动调整以可视化配体和附近的相互作用残基（如果适用），如步骤 2.3.7 所示。
    8. 光线追踪这些场景以使用命令 ray 3600、3600 保存高分辨率图像。
    9. 将场景另存为.png文件。
      注意：以下步骤是可选的，并概述了可视化 （1） 未建模配体 DGN 的差异密度 （Fo-Fc）、（2） 建模配体的密度 （Fo） 以及未建模溶剂的差异密度 （Fo-Fc） 以及最后 （3） 建模配体的密度 （Fo） 、DGN 和活性位点中的溶剂分子。
    10. 要使用差异图证明配体、DGN 和周围溶剂分子的存在，请在步骤 3.1.5 中从 Servalcat 作业中打开 diffmap_normalised_fofc.mrc 。通过单击地图对象旁边的 操作>重命名 ，将地图文件重命名为 unliganded_fofc.mrc。在命令行中键入以下内容： isomesh mesh_ligands_fofc， unliganded_fofc， ligands， level=6， carve=2。
    11. 要演示建模配体 DGN 的密度和周围未建模的溶剂密度，请在步骤 3.2.2 中打开 servalcat 作业中的 diffmap_normalised_fo.mrc 和 diffmap_normalised_fofc.mrc 。将 diffmap_normalised_fo.mrc 重命名为 DGN_fo ，将 diffmap_normalised_fofc.mrc 重命名为 DGN_unmodelled_solvents_fofc。
    12. 从“显示>序列”中选择“MG”和“水”，右键单击并选择>复制到对象的操作，并将它们命名为溶剂。
    13. 在命令行中键入以下内容： isomesh mesh_DGN_fo， DGN_fo， DGN， level=3， carve=2;isomesh mesh_solvent_fofc， DGN_unmodelled_solvents_fofc， solvents， level=6， carve=2。
      注意：mesh_DGN_fo将显示配体的密度，mesh_solvent_fofc将显示 MG 和水的省略密度。
    14. 最后，要可视化建模的配体以及活性位点中的周围溶剂分子，请在步骤 3.2.6 中从 Servalcat 作业中打开 diffmap_normalised_fo.mrc ，并将其重命名为 ligand_fo.mrc。
    15. 在命令行中键入以下内容： isomesh mesh_ligand_fo， ligand_fo， selection=ligands， level=3， carve=2。
      注意：在这里，我们使用了 diffmap_normalised_fo.mrc，但最终的锐化图可用于显示配体和周围残基的密度。在图例中提及所使用的地图类型、B 因子锐化值是一种很好的做法。
    16. 可以通过键入以下命令来设置网格宽度和球体大小： set mesh_width=0.2 和 set sphere_scale=0.25 以减小球体尺寸。
    17. 将 fo 网格涂成蓝色，将 fofc 网格涂成绿色。
    18. 使用 定向/缩放选项>操作 并手动调整以可视化配体和附近的相互作用残基（如果适用），如步骤 2.3.7 所示。
    19. 光线追踪这些场景以使用命令 ray 3600、3600 保存高分辨率图像。
    20. 将各个场景另存为.png文件。

4. 分辨率对β-半乳糖苷酶配体建模的影响

  1. 打开 Terminal 并转到包含两个半映射的目录。
  2. 在 ChimeraX 中打开 .map 格式的两个半映射（步骤 3.1.3），将它们可视化并将它们保存为 emd10563_half1_1_unfil.mrc 和 emd10563_half2_1_unfil.mrc。
  3. 在步骤 3.1.4 中创建的掩码可以用作输入。
  4. 在 Relion 中使用步骤 4.2-4.3 中的半贴图和掩码，使用默认参数运行 PostProcessing 作业。
  5. 重复步骤 4.4，现在启用 Skip FSC 称量 并指定 3 Å 的临时低通滤光片。
  6. 使用 3.5 Å 的临时低通滤波器重复步骤 4.4。
  7. 在PyMOL中打开步骤4.4-4.6中的映射（postprocess.mrc），以不同的分辨率进行过滤，以及步骤3.1.2中的模型坐标6tsh.pdb（与ChimeraX中的半映射对齐）文件。将不同的映射重命名为 3.0、3.5 和 2.3，具体取决于其分辨率。
    注意：可以通过在 ChimeraX 或 Coot 中可视化地图来确认地图的低通过滤。
  8. 如步骤3.3.6中所述，通过在配体和溶剂分子周围以6σ的阈值创建2 Å的网格，将映射过滤到不同的分辨率，从而可视化分辨率对配体和溶剂分子密度的影响。

结果

示例 1
来自结核分枝杆菌的烯醇化酶催化糖酵解的倒数第二步，并将 2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇丙酮酸 （PEP），这是几种代谢途径的重要中间体44,45。在相同像素大小 1.07 Å 下收集 apo-烯醇化酶和 PEP 结合烯醇化酶样品的 CryoEM 数据，并使用 Relion 3.146,47 进行图像处理。载脂蒲-烯醇化酶?...

讨论

近年来，显微镜硬件和软件的改进导致冷冻电子显微镜结构数量的增加。尽管目前在单颗粒冷冻EM中实现的最高分辨率为1.2 Å 57,58,59，但大多数结构的确定分辨率约为3-4 Å。在中低分辨率图谱中对配体进行建模可能很棘手，而且往往充满歧义。鉴于冷冻电镜在学术界和制药行业广泛用于转化研究和药物发现，确保配体建模正确?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

SJ 是 DAE-TIFR 博士生奖学金的获得者，并且资金得到认可。KRV 感谢 DBT B-Life 赠款 DBT/PR12422/MED/31/287/2014 以及印度政府原子能部在项目识别号下的支持。RTI4006.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
CCP4-8.0Consortium of several instituteshttps://www.ccp4.ac.ukFree for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EMConsortium of several instituteshttps://www.ccpem.ac.uk/download.phpFree for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot Paul Emsley, LMB, Cambridgehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)Consortium of several instituteshttps://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.htmlSoftware inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank Consortium of several instituteshttps://www.ebi.ac.uk/emdb/Public Repository for Electron Microscopy maps
FalconThermo Fisher Scientific https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdfCommercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix Consortium of several instituteshttps://phenix-online.org/downloadFree for academic users and includes Coot
Protein Data BankConsortium of several instituteshttps://rcsb.orgPublic database of macromolecular structures
PymolSchrodingerhttps://pymol.org/2/Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
RelionMRC-LMB, Cambridgehttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.htmlSoftware for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan KriosThermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF ChimeraUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.htmlGeneral purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera XUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/General purpose software for display, analysis and more

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