Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Riepilogo

Fino a tempi recenti, studi di espressione sul cervello umano sono stati limitati alla quantificazione di RNA o proteine. Con le tecniche di immunoprecipitazione della cromatina descritte in questo documento, sarà possibile mappare metilazione dell'istone e gli altri regolatori epigenetici dell'espressione genica nel cervello post-mortem.

Abstract

Croniche malattie neuropsichiatriche come la schizofrenia, malattia bipolare e l'autismo si pensa che il risultato di una combinazione di fattori genetici e ambientali che potrebbero risultare in alterazioni epigenetiche dell'espressione genica e di altre patologia molecolare. Tradizionalmente, tuttavia, studi di espressione nel cervello post-mortem erano limitati alla quantificazione di mRNA o proteine. I limiti riscontrati nella ricerca sul cervello post-mortem come variabilità nel tempo e integrities autolisi dei tessuti sono anche suscettibili di influenzare tutti gli studi di strutture di ordine superiore della cromatina. Tuttavia, l'organizzazione nucleosomal di DNA genomico tra cui DNA: istone nucleo vincolante - sembra essere in gran parte conservati in campioni rappresentativi forniti dalle banche del cervello diverse. Pertanto, è possibile studiare il modello di metilazione ed altre modifiche covalenti istoni del nucleo a definire loci genomici nel cervello post-mortem. Qui vi presentiamo una versione semplificata nativo immunoprecipitazione della cromatina (NChIP) protocollo per surgelati (mai-fisso) campioni del cervello umano. A partire dalla digestione micrococcal nucleasi omogenati di cervello, NChIP seguita da qPCR può essere completata entro tre giorni. La metodologia qui presentata dovrebbe essere utile a chiarire i meccanismi epigenetici dell'espressione genica in condizioni normali e malate del cervello umano.

Protocollo

Procedimento:

1 ^° Giorno

1. Omogeneizzare 50-500 mg di surgelati post-mortem del tessuto grigio questione con Douncing tampone.

! ATTENZIONE - tessuti umani devono essere maneggiati con cura in condizioni di sicurezza rigorose. Pertanto deve essere trattato a BSL-2 o superiore standard di sicurezza.

1. Prendere in precedenza sezionato, post-mortem del cervello da -80 ° C, li dounce del volume cerebrale di tampone 5X Douncing, e il luogo in tubo di 2,0 ml microcentrifuga. Abbinato campione e le coppie di controllo vengono elaborati contemporaneamente.

2. Micrococcal nucleasi (MN) digestione

1. Aggiungi 5U/mL di Micrococcal nucleasi al campione e mescolare all'interno della soluzione pipettando su e giù prima dell'immissione sul ghiaccio.
   * FASE CRITICA - E 'importante fare questo passo in fretta dato che MN ha la capacità di agire anche a 4 ° C.
2. Incubare i campioni per 7 minuti a 37 ° C.
3. Dopo l'incubazione 7 minuti, aggiungere 0.5M EDTA a una concentrazione di 10 mM per interrompere l'attività MNase.

3. Hypotonisation

1. I campioni in una provetta da 15 ml falco. Aggiungere 10 volte il volume del campione di 0,2 mm EDTA, 1 / 2000 volume del campione di benzamidine 0,2 M e il volume del campione 1 / 1000 di phenylmethanesulphonylfluoride 0.1M (PMSF). Gli ultimi due composti sono usati come inibitori della proteasi.
   * FASE CRITICA - E 'importante mantenere i campioni su ghiaccio per tutti questi passaggi.
2. Incubare campione per 1 ora, mentre vortex ogni 10 minuti.
3. Al termine della incubazione un'ora, aggiungere il volume del campione 1 / 2000 della 3M DTT, un altro inibitore della proteasi.
4. Campione vortice ancora una volta e centrifugare a 3175 RCF per 10 minuti a 4 ° C.
   * STEP OPTIONAL - Precleansing con proteine ​​G agarosio.
   1. Prendere surnatante e mettere in tubo di nuovo 15 ml falco.
   2. Aggiungere 500 ml di proteina G agarosio.
   3. Ruota a temperatura ambiente per 30 min.
   4. Centrifugare a 4000 rpm per 10 minuti a 4 ° C.
5. Distribuire in modo che surnatante 500 microlitri sono utilizzati come controllo di ingresso (che contiene solo DNA genomico), e il resto è diviso in due provette contenenti 1600 ml di ciascun campione - che sono per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) campioni.
6. Il controllo d'ingresso è posto a -80 ° CO / N fino a quando un ulteriore uso.
7. Per i campioni di ChIP - aggiungere volume 1:10 di 10XFSB e 4μg di anticorpi, poi vortice i campioni e farli ruotare a 4 ° C per una notte.
   ! ATTENZIONE - Importo e la diluizione di anticorpi può richiedere di ottimizzazione.

2 ^° Giorno

! ATTENZIONE! - Inizio 2 ^° giorno dal lavaggio delle proteine ​​G agarosio che verrà utilizzato per isolare il DNA nucleosomal. Dal perline agarosio sono molto sensibili, è necessario tagliare la testa delle punte quando pipettaggio qualsiasi soluzione contenente microsfere di agarosio.

1. Probing proteina G Beads agarosio al DNA

1. Aggiungere 1,6 mL 1XFSB a 245 microlitri proteina G-agarosio (sufficiente per 4 tubi) in una provetta 2 mL (anello).
2. Separare la soluzione in due 2 mL e ogni ricarica fino a 1,6 ml con 1X FSB.
3. Ruota a temperatura ambiente per 30 secondi e centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec.
4. Eliminare il surnatante con un aspirapolvere.
5. Aggiungere 1,6 ml 1X FSB ancora una volta. Ruotare i campioni per 30 secondi, quindi si centrifuga a 0,1 RCF per 30 sec.
6. Rimuovere il surnatante ancora una volta, e combinare entrambi i tubi con 1,5 ml 1XFSB.
7. Aggiungere 15 microlitri sonicato DNA dello sperma di salmone (10mg/ml).
   ! ATTENZIONE - Questo passo dovrebbe, in linea di principio, ridurre il legame non specifico del immunoprecipitato ai talloni. Tuttavia, questo potrebbe anche portare a falsi positivi per alcune delle (umano) sequenze di DNA.
8. Ruota a temperatura ambiente per 30 minuti, poi centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec.
9. Rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 ml di 1XFSB.
10. Aggiungere 90 ml di perline agarosio in ogni campione ChIP. Ruota a 4 ° C per 1 ora.
11. Aggiungere 1 ml di 1XFSB nelle restanti perline agarosio per servire come controllo negativo e ruotare a 4 ° C per 1 ora.
12. Dopo le ore di incubazione lungo, centrifugare i campioni e di controllo negativo a 0,1 RCF per 30 sec. Scartare il surnatante.

2. Lavaggio delle Perle

! ATTENZIONE! - Buffer di lavaggio deve essere conservato a 4 ° C fino al momento dell'uso, e devono essere utilizzate solo se sono meno di un mese.

1. Aggiungere 1 ml di ogni soluzione di lavaggio ai talloni, ruotare per 3 minuti a temperatura ambiente.
2. Centrifugare a 0,1 RCF per 30 sec.
3. Gettare il surnatante tramite aspirazione.

Ogni soluzione di lavaggio *

- Basso sale tampone di lavaggio

- Alta sale tampone di lavaggio

- Soluzione di cloruro di litio - solo ruotare a temperatura ambiente per 1 minuto!

- Tampone TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Eluizione

* FASE CRITICA - Fai Buffer fresca eluizione per ogni esperimento il giorno in cui deve essere utilizzato.

1. Aggiungere 250 ml di tampone di eluizione appena preparati a ogni campione.
2. Ruotare per 15 minuti a RT, poi centrifugare a 0,4 RCF per 1 min.
3. Salvare il surnatante in una provetta da microcentrifuga 2,0 ml (Loop).
4. Aggiungere 250 ml di tampone di eluizione per ogni campione e vortice a mano per pochi secondi. Poi, i campioni vortex per 15 minuti su un mulitvortexer.
5. Centrifugare a 16 RCF rpm per 4 minuti e salvare surnatante nello stesso tubo di 2,0 mL (Loop).

4. Digerire proteine

1. Aggiungere 10 microlitri EDTA 0.5M, 25 microlitri 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml di proteinasi K (1 / 200 del campione) per ogni campione ChIP.
2. Per ogni controllo in ingresso, aggiungere tampone di lisi per la digestione proteinasi K (1 / 10 di tampone campione) e 10mg/ml proteinasi K (1 / 200 di tampone del campione).
3. Incubare di ingresso e di campioni di chip a 52 ° C per almeno 3 ore.

5. Fenolo / cloroformio estrazione

! ATTENZIONE - Esperimento che richiedono fenolo / cloroformio deve essere effettuata sotto il cofano. Usare guanti di nitrile quando si maneggia fenolo / cloroformio.

1. Dopo l'incubazione 3 ore, si aggiunge il 500 microlitri fenolo-cloroformio per ogni campione.
2. Vortex tutti i campioni per alcuni secondi, poi centrifugare a 13 giri RCF per 5 min.
3. A questo punto, due fasi sarà presente e ci interessa il contenuto della fase superiore. Estrarre la fase superiore e metterla in una provetta 2 mL.
4. Aggiungere una miscela di 2μL di glicogeno e 50μL di acetato di sodio 3M per ogni campione con 1,375 ml di etanolo al 100%.
5. Vortex tutti i campioni vigorosamente. Metterli in -80 ° C durante la notte.

3 ^° giorno

1. Rimuovere campioni forma -80 ° C e metterli in ghiaccio per loro di disgelo.
2. Centrifugare a 15 RCF per 10 minuti a 4 ° C.
3. Rimuovere con cura sopranatante senza far muovere il sedimento sul fondo della provetta.
4. Aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 75% per ogni campione, poi capovolgere 4-6 volte.
5. Centrifugare a 18 RCF per 5 minuti a 4 ° C.
6. Rimuovere il surnatante una volta di più e consentire il pellet di aria secca.
7. Sciogliere pellet essiccato in 50 ml di 4mm Tris-HCl, pH8 e conservare a -80 ° C fino a quando un ulteriore uso.

Discussione

Il protocollo qui descritto è particolarmente utile per i ricercatori interessati ad firme metilazione dell'istone e / o il DNA del cervello umano, perché questi segni cromatina può essere meno soggetti a post-mortem artefatti rispetto ad altri tipi di modifiche, tra cui (gli istoni) acetilazione e fosforilazione ^{1, 2.} Il cervello post-mortem è riconducibile allo studio di mono-nucleosomal preparati; il DNA rimane in gran parte collegata al istoni core, almeno negli esemplari con intervalli autolisi rappresentante (il tem...

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