P2X2 Ligandla Gated Katyon Kanalları ile etkileşimde Proteinler tanımlamak için Proteomik

Özet

Biz, ATP-kapılı P2X2 reseptörlerinin tam uzunlukta C terminus bağlamak beyin proteinleri tespit etmek için basit bir protokol açıklar. Bu yaklaşımın uzantısı ve sistematik bir uygulama tüm p2x reseptörlerine p2x reseptör sinyal daha iyi anlaşılmasına yol açması bekleniyor.

Özet

Ligand kapılı iyon kanalları sinir sistemi ¹ sinaptik iletişim yatar. Memelilerde ligand kapılı kanallar üç aile vardır: CYS döngü, glutamat-kapılı ve p2x reseptör kanal ^2. Her iki durumda da verici bağlayıcı ionlar elektrokimyasal gradyanlar aşağı akan bir gözenek açılması yol açar. Birçok ligand kapılı kanallar da downstream kanal açma süresini aşamaz rolleri sinyalizasyon ⁵ (örneğin gen regülasyonu) kalsiyum iyonları ^{3, 4,} geçirgen. Böylece ligand kapılı kanallar gün birkaç milisaniye arasında değişen geniş bir zaman ölçekleri üzerinde sinyal. Ligand kapılı iyon kanalları kendilerini proteinler tarafından düzenlenir anlamak için gerekli olduğunu ve bu proteinlerin nasıl bu önemli rolleri dikkate alındığında sinyal ayar olabilir. Son çalışmalar, pek çok, hepsi değilse de, kanal protein sinyalizasyon ^kompleksleri 6 parçası olabilir ki öneririz . Bu yazıda, P2X2 reseptör sitozolik etki C-terminal yönlerine bağlayan proteinleri tespit etmek için nasıl.

P2x reseptörler ATP açılıp kapanan katyon kanalları ve yedi alt birimden (P2X1-P2X7) oluşur. P2x reseptörler eksitatör sinaptik iletim ve nörotransmiter sürüm ⁷ presinaptik kolaylaştırma arabuluculuk beyin, yaygın olarak ifade edilir. P2x reseptörleri heyecanlanır ve non-Uyarılabilir hücrelerinde bulundu ve nöronal sinyalizasyon, inflamasyon ve kardiyovasküler fonksiyon ⁸ kilit roller arabuluculuk. P2X2 reseptörler, sinir ^sistemi 9 bol ve bu çalışmanın odak vardır . Her p2x altbirim ekstraselüler bölge ⁷ ve hücre içi N ve C Termini (Şekil 1a) ⁷ ile ayrılmış iki membran kapsayan kesimleri (TM1 ve TM2) sahip olduğu düşünülmektedir. P2x alt birimden ¹⁰ (P2X1-P2X7), amino asit ^düzeyi 11% 30-50 dizisi homoloji göstermektedir . P2x reseptörleri iyonotropik reseptörler arasında basit stokiyometri sadece üç alt birimden içerir. P2X2 C-terminalindeki 120 amino asitler oluşur (Şekil 1b) ve P2X2 reseptör sinyal komplekslerinin parçası olabileceği hipotezini destekleyen birkaç protein yerleştirme konsensüs siteleri içerir. Ancak, çeşitli işlevleri P2X2 reseptörleri ⁹ C-terminalindeki atfedilmiş olmasına rağmen hiçbir çalışma moleküler ortakları açıklanan bu proteinin hücre içi tarafında tam uzunlukta C-terminalindeki üzerinden çift. Bu yöntem kağıt tam uzunlukta C-terminalindeki P2X2 reseptörleri ile etkileşen proteinleri tespit etmek için bir proteomik yaklaşım açıklar.

Protokol

DENEYSEL PROSEDÜRLER

(Şekil 2) deneysel işlemin kademeli bir şekilde aşağıda açıklanan dört bölümden oluşmaktadır.

Bölüm 1: P2X2 reseptörlerinin C-terminalindeki Subcloning ve ifadesi.

Biz onu bağlar beyin proteinleri tespit etmek için tam uzunlukta bakteriler P2X2 reseptörleri C-terminus dile getirdiler.

1. P2X2 reseptör (Şekil 1) C-terminalindeki pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) klonlanmış (kalıntıları 353-472) ve sıralama ile doğrulanmış, PCR ile amplifiye oldu.
2. Rekombinant plazmid E. dönüştü Rekombinant proteinler ifade coli (BL21).
3. Plazmid P2X2 CT-GST içeren bakteriler (E. coli BL21) Gliserol stoklarının steril bir pipet ucu ile kazınır ve uygun seçici marker (50 g / ml ampisilin) ​​ve 5 ml Luria-Bertani (LB) medya ekildi , 37 ° C'de orbital çalkalayıcı bir gece inkübe edildi.
4. Gecede büyüdü kültürleri 600 nm dalga boyunda optik yoğunluk ulaşana kadar uygun bir antibiyotik ile (50 mg / ml ampisilin) ​​250 ml LB medya içine aşılanmış ve 37 ° C'de 2-3 saat için 250 rpm'de orbital çalkalayıcı inkübe ~~ 0.6-0.7.
5. Kültür IPTG 1 mM ile tetiklenen ve daha fazla protein ekspresyonu için 3 saat için 37 ° C'de inkübe edildi.
6. 5000 g, kültür 4C (kültür 1ml ifade düzeyini analiz etmek için kaydedilir ve 'indüklenen' olarak etiketlenmiş) 15 dakika sonra ayrıldı. Süpernatant atılır ve pelet Tuzlu Tris-EDTA (STE) tamponu (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0) 20 ml yeniden süspanse edildi.
7. Süspansiyon, 50 ml şahin tüp içinde 15 dakika süreyle 5000 g ayrıldı. Süpernatant atılır ve yarı kuru pelet at-70C gecede donduruldu.
8. -70C pelet buz lizis tamponu (% 2 sarkosyl (w / v), 15 mg lizozim, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH7.5, 5 mM DTT ve tam proteaz inhibitörü tablet) 40 ml yeniden süspanse ve süspansiyon 30 dakika buz üzerinde inkübe edildi. Bu kuluçka sırasında, 3 ml Glutatyon-sepharose 4B boncuk Phosphate Buffer Saline (PBS) ve PBS tarafından 20 ml T-PBS (% 0.1 (v / v) PBS içinde tritonX-100) 20 ml ile yıkandı. Boncuk, 1 ml PBS içinde yeniden süspanse edildi.
9. Bakteriyel süspansiyon, sıvı nitrojen içinde 3 kez dondurma çözülmüş ve sonicated (1s kapalı / buz üzerinde 3 dakika süreyle 30 mikron) ve daha fazla,% 4 ile 30 dakika (v / v) triton X-100, 10 mM MgSO inkübe ₄ ve 2 mM ATP buz üzerinde.
10. Lizat (pelet ve 1 süpernatant ml sitoplazmada ve membranlar proteinlerin miktarda test etmek için SDS sayfa için kaydedilmiş bir örnek) atılır 4C ve pelet az 15 dakika süreyle 20000 g ayrıldı. Süpernatant 1 saat (veya gece) 4C için boncuklar ile inkübe edildi.
11. Boncuklar, 5 dakika boyunca 500 g bükülmüş ve supernatant (örnek bağlanmamış fraksiyonu kaydedilir) atılır. Boncuk T-PBS beş kez (yıkama yıkama kontrolleri için kaydedilmiş) ile yıkandı.
12. Boncuk sonra% 50 (w / v) bulamaç vermek için PBS içinde yeniden süspanse ve kullanana kadar 4C buzdolabında saklanır. Protein konsantrasyonu Bradford assay (üreticinin talimatlarına göre) tarafından tahmin edilmiştir.

Bölüm 2: tüm beyin lizatları hazırlanması

P2X2 reseptörleri beyin ⁸ bol ifade edilmesi bilinmektedir. Mevcut analizler, sıçan tüm beyin ilginçtir (Şekil 3) P2X2 reseptörleri ile etkileşen proteinleri tespit etmek için aradı.

1. Yetişkin sıçan beyin hasat (UCLA IAACUC onaylı protokole göre hayvanların ve NIH Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu göre kurban edildi) ve hemen buz PBS (3X) durulanır.
2. 10 ml (~ 5 kez hasat beyin ıslak ağırlık) buz lizis tamponu içeren 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM olmuş akyuvarlar Na ₃ VO _4, 1 mM PMSF leupeptin, 5 mg / ml,% 1 (v / v) NP-40, bir proteaz inhibitörü kokteyl tablet hasat beyin eklendi.
3. Beyin dokusu, homojen tutarlılık bir karışım elde edilene kadar, bir bardak Dounce homojenizatör ile buz homojenize edildi.
4. Hücre lizat kesintisiz hücreleri çıkarmak için 5 dakika 2000 g ayrıldı. Süpernatant sağlam organelleri ve membran agrega kaldırmak için 60 dakika süreyle 29000 g de tekrar toplanır ve bükülmüş oldu.
5. Santrifüj hemen sonra süpernatant temiz bir tüpe transfer edildi. Tüm beyin lizat protein konsantrasyonu Bradford assay ile ölçüldü (genellikle 15 mg / ml).
6. Lizat aliquoted ve-70C saklanır.

Bölüm 3: P2X2 C-kuyruk ilişkili proteinlerin İzolasyon

Tüm beyin lizatları P2X2 CT-GST bağlayıcı ortakları belirlemek için tahlil aşağı çekme CT-G ile yapıldıST yem olarak glutatyon sepharose 4B boncuklar üzerinde hareketsiz. Kontroller için, boncuk bağlı yalnız GST kullanılmıştır.

1. Beyin lizat 4C az 1 saat süreyle GST boncuk precleared oldu. Pelet atılır ve supernatant ileri analizler için kullanılmıştır.
2. GST ve P2X2 glutatyon sepharose 4 B boncuk bağlı CT-GST (10 mikrogram) Eşit miktarda lizis tamponu 4C dönme ile sıçan bütün beyin lizat precleared solubilised proteinlerin 100 g gece inkübe edildi.
3. Boncuk 5 dakika 1000 g bükülmüş ve supernatant atılmıştır.
4. Boncuk lizis tamponu ile bir kez yıkanır ve modifiye Laemli tampon kaynatılmış [4% (w / v) SDS,% 10 (v / v) 2-merkaptoetanol,% 2 (v / v) gliserol,% 0.004 (w / v) Bromophenol Mavi ve 0.125 M TrisCl pH 6.8] 5 dk.
5. Örnekleri 5 dakika ve% 10 SDS-PAGE (Şekil 4) ile ayrılmış süpernatant 5000 g spun. Jeller SYPRO Ruby protein leke jel (üreticinin talimatlarına göre) ve ultraviyole ışık altında görüntülendi ile boyandı. P2X2 CT ile ilişkili proteinler GST boş yem olarak kullanarak kurtarıldı ile karşılaştırıldı. Dört biyolojik (dört beyinleri ve dört bağımsız çekme çıkışlar) yapıldı çoğaltır.

Bölüm 4: proteinlerin belirlenmesi.

Jel elektroforezi ile ayrılmış Proteinler jel eksize ve kütle spektrometresi ¹² tarafından belirlenen Not: Bu süreç boyunca toz olmaması keratin kirliliği azaltmak için kritik öneme sahiptir. Deneyci her zaman, saç net ve eldiven maske takınız ve eldiven kullanılmadan ilgi jel bölgeye asla dokunmayın.

1. Aşağı P2X2 çekme kurtarıldı tüm görünür protein bantları, temiz bir jilet ile eksize ve doğranmış (Şekil 4). GST boş jel Sorumlu bölgelerde sokaktan aşağı çekin seviyesinin altında proteinlerin varlığını sigortalamak için bant boyama (GST boş yem için özel bantlar da eksize ve tespit edilmiştir) dikkate alınmaksızın aynı şekilde eksize edildi boyama hassasiyet cevapsız değildi.
2. Jel adet 200% 50 50 mM amonyum bikarbonat ul (v / v) asetonitril (ACN) ve RT 15 dakika vortekslenmiş tüpleri ile inkübe edildi. Bu yıkama adımı yineleyin.
3. Jel adet 200 ul asetonitril (shrink jel parçaları ve opak renkli olması gerektiğini) ekleyerek susuz.
4. Acetontrile kaldırılır ve jel parçaları yaklaşık 10 dakika süreyle speedvac kurutuldu.
5. Jel parçaları daha sonra parçaları batırmayın 30 ul taze hazırlanmış 10 mM DTT/10 mM Tris (2-karboksi-etil) yeterli hacim fosfin hidroklorür (TCEP) ile inkübe edildi. Bu 56C su banyosunda 30 dakika kaldı.
6. Sonraki DTT çözümü 100 ul 500% 50 asetonitril çözüm mM amonyum bikarbonat ve ammounium bikarbonat ile yıkanır jel dilimleri ile değiştirildi.
7. Yıkama solüsyonu aspire ve 200 ul asetonitril jeller kurutmak eklendi.
8. Asetonitril sonra kaldırılır ve 100 ul taze hazırlanmış 100 mM iodoacetamide çözümü serbest sülfidril alkylate eklendi. Bu adım, karanlıkta, oda sıcaklığında 25 dakika devam etti.
9. Iodoacetamide çözüm kaldırıldı ve vorteks sırasında jel adet 200 ul 2 dakika süreyle% 50 acetontrile (pH 8.0) 50 mM amonyum bikarbonat ile yıkandı. Bu yıkama adım tekrarlandı.
10. Yıkama çözeltisi çıkardıktan sonra, jel adet 200 ~ 10dk sonra speedvac tarafından kaldırıldı ul asetonitril ile inkübe edildi.
11. Bu aşamada jel parçaları tripsin sindirim için hazırız. Jel adet 30 ul tripsin çözüm (20 ng / mcL çalışma konsantrasyonu) inkübe ve iyi şişmiş jeller için 10 dakika boyunca buz üzerine yerleştirildi. Aşırı tripsin kaldırıldı ve 50 mM amonyum bikarbonat ile 30 ul ile kaplanmış, 37 ° C'de 12 ila 16 saat boyunca devam etmesine izin sindirim boyunca dalmış tutmak için jel partikülleri rehidrate edildi.
12. Beş ul% 5 (v / v) formik asit, tripsin ve tutuklama sindirim devre dışı bırakmak için eklenir.
13. Tüpler ~ 15 dk vortekslenmiş ve kısa bir süre sonra temiz ve etiketli 0.5 ml flakon nakledildi tüpün dibine sıvı getirmek için santrifüj edildi.
14. Sadece kısa santrifüj ile ayrılmış iki kez karıştırın, 10-15 dakika süreyle izledi kaplıydı böylece% 0.1% 50 asetonitril Sonraki 30 ul (v / v) formik asit jel parçaları eklendi. Bu adım, adımlar arasında asetonitril formik asit yerine, bir kez tekrarlandı.
15. Son sıvı tek bir flakon kaldırıldı ve tüm ekstraksiyon çözeltisi kombine edildi. Bu hacim speedvac ~ 30 uL azaldı. Örnek kütle spektrometresi ile ters faz nano-sıvı kromatografisi ve protein belirlenmesi için artık hazır olduğunu. Bu özel örnekte, bu adımı ThermoF bir Orbi-trap tandem kütle spektrometre yürütülmektedirisher (yüksek kütle doğruluğu, protein tayini için hızlı görev döngüsü ve genellikle sağlam bir işletim özellikleri için seçilen), diğer modeller ve üreticilerin araçların kolayca bu noktaya kadar açıklanan yaklaşım ile birleştiğinde olabilir rağmen.
16. Spektrometrik kitle analizleri için detayları ve kriterler kısaca sunulmuştur. Tüm peptidler ters faz nano-LC (Eksigent) ve peptidler, 3 ul / dk akış hızında C18 ters-faz sütun üzerine yüklenen ayrıldı. Mobil faz A% 0.1 formik asit ve su içinde% 2 ACN; mobil faz B,% 0.1 formik asit ve% 20 su ACN içinde oldu. Peptitler sütundan 220 nl / dk sonra 5 dakika boyunca% 95 B, 90 dakika boyunca% 50 B% 5 B doğrusal bir degrade kullanarak bir akış hızında yıkandı, ve nihayet 5 dakika boyunca sabit% 95 B tutmak . Spectra, MS tarar ve LTQ MS / MS taramaları için kullanılan Orbi-trap ile veri bağımlı modunda elde edildi. Peptitler Bioworks yazılım paketi entegre SEQUEST algoritmasını kullanarak sıçan IPI veritabanı v.3.53 karşı spektrumları arayarak tespit edildi. Her peptid aşağıdaki ölçütler karşılanmalıdır: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (3), ve DeltaCN> 0.1. Protein tanımlanması için kullanılan tüm spektrumları elle denetlenir ve proteinler iki peptidler daha az olduğu tespit edilir. Sadece proteinler GST boş çekme çıkışlar sırasında her dört P2X2 çekme çıkışlar ve yok şu mevcut ileriki analizler için kabul edildi.

Şekil 1. P2X2 reseptör altbirim şematik. A. karikatür P2X2 reseptör alt biriminin topoloji göstermektedir. N ve C Termini sitozolik bir etki oluşur. P2X2 reseptör (kırmızı) C-terminalindeki aşağı çekin tahlil için yem olarak kullanılır. Bu çalışmada kullanılan P2X2 reseptör C-terminalindeki B. Amino asit dizisi.

Şekil 2. Akış şeması ve zaman çizgisi ifade için kullanılan protokol, arıtma, aşağı çekme ve proteinlerin belirlenmesi zaman çizgisi ile protokol anahat göstermektedir. Yetişkin sıçan beyin lizat aşağı çekme deneyleri için kullanılmak hemen önce taze olarak hazırlanır.

Şekil 3. Sıçan beyin P2X2 C-terminalindeki ağ ikili proteomik analiz şematik gösterimi. GST GST boncuk bağlı protein ile kaynaşmış P2X2 reseptörlerinin C-terminalindeki testleri aşağı çekme için kullanılmıştır. Beyin lizat hazırlanmış ve proteinler immobilize rekombinant proteinleri ile inkübe edildi. Bağlanmamış fraksiyonu lizis tamponu ile yıkandı. Proteinler kütle spektrometresi ile tespit edilmiştir.

Şekil 4 P2X2 reseptörlerinin C-terminus bağlayıcı ortakların belirlenmesi. SYPRO boyanan jel C-terminalindeki GST (mavi kutu) ile kaynaşmış reseptörleri ile etkileşim varsayılan proteinlerin bir spektrum gösteren. Kontroller, yalnız GST tek başına (sarı kutu) ve glutatyon sepharose boncuk şeritleri de gösterilir. Oklar, daha fazla analiz için kütle spektrometresi ile eksize edildi benzersiz gruplarından örnekler göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

İyon kanalları büyük bir integral membran proteinleri sınıfı. Onlar kendi elektrokimyasal gradyanlar aşağı seçici plazma zarından iyonların hareketi izin su dolu gözeneklerin içerir. İyon kanalları kapısı açık ve kapalı devletler arasında. Yolluk adım p2x ligand kapılı iyon kanalları halinde vericileri (örneğin ATP) tarafından tetiklenir, ya da diğer proteinler ile etkileşimler tarafından düzenlenmiş olabilir. Son on p2x reseptörler ATP ¹³ bağlama nasıl anlayışımızı ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Reagent	JT Baker	9829-02
Acrylamide	Reagent	Bio-Rad	161-0156
Ampicillin	Reagent	VWR international	VW1507-01
Ammonium Bicarbonate	Reagent	Fluka	09830
Ammonium Persulphate (APS)	Reagent	Sigma-Aldrich	A3678
Adenosine Triphosphate (ATP)	Reagent	Sigma-Aldrich	A7699
Bradford reagent	Reagent	Bio-Rad	500-0006
Bromophenol blue	Reagent	Fisher Scientific	B-392
Commassie blue R-250	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-24972
Dithiotritol (DTT)	Reagent	EMD Millipore	3860
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Reagent	VWR international	VW1474-01
Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)	Reagent	Sigma-Aldrich	E8145
Formic acid	Reagent	EMD Millipore	11670-1
Glutathione Sepharose 4B beads	Reagent	GE Healthcare	17-5132-01
Hydrochloric acid (HCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	H1758
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Reagent	Sigma-Aldrich	15502
Iodoacetamide	Reagent	Sigma-Aldrich	I1149
Luria-Bertani (LB) Media	Reagent	EMD Millipore	1.00547.5007
Leupeptin	Reagent	Sigma-Aldrich	L8511
Lysozyme	Reagent	Sigma-Aldrich	62971
Magnesium Sulphate (MgSO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Chloride (NaCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium Flouride (NaF)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7920
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S6508
Nonidet P40	Reagent	Fluka	74385
Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)	Reagent	Sigma-Aldrich	P7626
Protease inhibitor tablet	Reagent	Sigma-Aldrich	S8820
Protein standard	Reagent	Bio-Rad	161-0305
Sarkosyl	Reagent	Acros Organics	61207
Screw top vial	Tool	Agilent Technologies	5182-0866
Sodium dodecyl sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	L4509
SYPRO® Ruby protein gel stain	Reagent	Bio-Rad	170-3125
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Reagent	Sigma-Aldrich	T9281
Tris base	Reagent	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T9284
Trypsin	Reagent	Promega Corp.	V5111
Tween 20	Reagent	Sigma-Aldrich	P5927
Water	Reagent	Burdick & Jackson	365-4
LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer	Tool	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Nano Liquid Chromatography System	Tool	Eksigent
B-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	M6250
Glycerol		EMD Millipore	GX0185-6