Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation

Resumo

Nós descrevemos um protocolo simples para identificar proteínas cerebrais que se ligam ao terminal de todo o comprimento C da ATP-gated P2X2 receptores. A extensão e aplicação sistemática desta abordagem para todos os receptores P2X deverá levar a uma melhor compreensão da sinalização do receptor P2X.

Resumo

Canais de íon-ligante gated subjacentes comunicação sináptica no sistema nervoso ^1. Nos mamíferos existem três famílias de ligante-gated canais: o laço cys, o glutamato-gated e os canais do receptor P2X ^2. Em cada caso de ligação do transmissor leva à abertura de um poro através do qual os íons fluem seus gradientes eletroquímicos. Muitos ligand-gated canais também são permeáveis ​​aos íons de cálcio ^{3, 4,} que têm a jusante de sinalização papéis ⁵ (por exemplo, regulação de genes) que podem exceder a duração da abertura do canal. Assim ligand-gated canais pode sinalizar em escalas de tempo amplo que vão desde alguns milissegundos até dias. Tendo em conta estes papéis importantes é necessário entender como ligante-gated canais iônicos em si são regulados por proteínas, e como essas proteínas podem sintonizar sinalização. Estudos recentes sugerem que muitos, senão todos, os canais podem ser parte de complexos de proteínas de sinalização ^6. Neste artigo vamos explicar como identificar as proteínas que se ligam aos aspectos C-terminal do domínio receptor P2X2 citosólica.

Receptores P2X são canais ATP-gated educação e composto por sete subunidades (P2X1-P2X7). Receptores P2X são amplamente expressa no cérebro, onde eles medeiam a transmissão sináptica excitatória e facilitação pré-sináptica da liberação de neurotransmissores ^7. Receptores P2X são encontrados em células excitáveis ​​e não excitáveis ​​e mediar papéis-chave na sinalização neuronal, inflamação e função cardiovascular ^8. P2X2 receptores são abundantes no sistema nervoso ⁹ e são o foco deste estudo. Cada subunidade P2X é pensado para dois segmentos possuem membrana estendida (TM1 e TM2) separados por uma região extracelular ⁷ e N intracelular e C termini (Fig 1a) ^7. Subunidades P2X ¹⁰ (P2X1-P2X7) mostram homologia de seqüência de 30-50% no nível de aminoácidos ^11. Receptores P2X conter somente três subunidades, que é o mais simples estequiometria entre os receptores ionotrópicos. O P2X2 C-terminal consiste de 120 aminoácidos (Fig 1b) e contém várias proteínas sites de consenso docking, apoiando a hipótese de que P2X2 receptor pode ser parte de complexos de sinalização. No entanto, embora várias funções foram atribuídas ao C-terminal de receptores P2X2 ⁹ nenhum estudo descreveu os parceiros molecular que o casal para o lado intracelular desta proteína através do comprimento total C-terminal. Neste trabalho métodos que descrevem uma abordagem proteômica para identificar as proteínas que interagem com o comprimento total C-terminal de P2X2 receptores.

Protocolo

Procedimentos experimentais

O procedimento experimental (Fig. 2) consiste em quatro partes que são descritas em uma maneira passo a passo abaixo.

Parte 1: subclonagem e expressão do C-terminal de P2X2 receptores.

Nós expressamos o comprimento total C-terminal de receptores P2X2 em bactérias para identificar as proteínas do cérebro para que ele se liga.

1. O C-terminal (resíduos 353-472) do receptor P2X2 (Fig. 1) foi amplificado por PCR, clonados em pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) e verificadas com o seqüenciamento.
2. O plasmídeo recombinante foi transformado em E. Coli (BL21) para a expressão de proteínas recombinantes.
3. Stocks de glicerol de bactérias (E. coli BL21) contendo o P2X2 CT-GST plasmídeo foram raspadas com uma ponteira de pipeta estéril e inoculadas em 5 ml de Luria-Bertani (LB) de mídia com marcador seletivo adequado (50 g / ml ampicilina) e incubadas durante a noite em um agitador orbital em 37C.
4. As culturas cresceram durante a noite foram inoculadas em 250 ml de mídia LB com um antibiótico adequado (50 mg / ml ampicilina) e incubados em agitador orbital a 250 rpm por 2-3 horas a 37C, até a densidade óptica a 600 nm chegou ~ 0,6-0,7.
5. A cultura foi induzida com 1 mM de IPTG e ainda incubados a 37 ° C por 3 horas para a expressão da proteína.
6. A cultura foi então centrifugada a 5000 g por 15 min a 4C (1 ml da cultura foi salvo para analisar o nível de expressão e rotulados como "induzida"). Sobrenadante foi descartado eo pellet foi ressuspendido em 20 ml de solução salina Tris-EDTA (STE) tampão (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0).
7. A suspensão foi centrifugada a 5000 g por 15 min em um tubo falcon 50 ml. O sobrenadante foi descartado eo pellet semi-seco foi congelado a-70C durante a noite.
8. A-70C pellet foi ressuspendido em 40 ml de tampão de lise de gelo frio (2% (w / v) sarkosyl, 15 mg de lisozima, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT e comprimido inibidor da protease completa) , ea suspensão foi incubada em gelo por 30 min. Durante esta incubação, 3 ml contas Glutationa-Sepharose 4B foram lavados com 20 ml de tampão fosfato salina (PBS) e 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) tritonX-100 em PBS), seguida por PBS. As contas foram ressuspendidos em 1 ml de PBS.
9. A suspensão bacteriana foi freeze-descongeladas três vezes em nitrogênio líquido e sonicado (1s on / off, 30 microns por 3 min no gelo) e incubadas por mais 30 minutos com 4% (v / v) de triton X-100, 10 mM MgSO ₄ e 2 mM ATP no gelo.
10. O lisado foi centrifugado a 20.000 g por 15 min a 4C e pellet foi descartado (a amostra de pellet e 1 ml do sobrenadante foi guardado para página SDS para testar as quantidades de proteínas no citoplasma e membranas). O sobrenadante foi incubado com as contas para 1 hr (ou noite) em 4C.
11. As contas eram girado em 500 g por 5 min eo sobrenadante foi descartado (amostra foi salvo para a fração não ligada). As pérolas foram lavadas cinco vezes com T-PBS (lavagens foram salvos para controles de lavagem).
12. As pérolas foram então ressuspendidas em PBS para dar 50% (w / v) O chorume e armazenados em geladeira a 4C até o uso. A concentração de proteína foi estimada pelo ensaio de Bradford (por instruções do fabricante).

Parte 2: Preparação do lisados ​​cérebro inteiro

P2X2 receptores são conhecidos por serem abundantemente expressa no cérebro ^8. Na análise presente, buscou-se identificar as proteínas que interagem com receptores P2X2 de lisados ​​rato todo cérebro (Fig. 3).

1. Cérebro de rato adulto foi colhida (animais foram sacrificados de acordo com um protocolo de UCLA IAACUC-aprovado e de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório) e imediatamente lavados gelada PBS (3X).
2. Para lisar as células 10 ml (~ 5 vezes o peso úmido do cérebro colhida) de gelo lise frio contendo 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na ₃ VO _4, 1 mM PMSF, 5 mg / ml de leupeptin, 1% (v / v) NP-40, e uma protease tablet cocktail inibidor foi adicionado ao cérebro colhida.
3. Tecido cerebral foi homogeneizado em gelo com um homogeneizador de Dounce vidro até uma mistura de consistência homogênea foi alcançado.
4. Lisado celular foi centrifugado a 2000 g por 5 minutos para remover as células ininterrupta. O sobrenadante foi coletado e girou novamente a 29.000 g por 60 minutos para remover organelas intactas e agregados membrana.
5. Imediatamente após a centrifugação o sobrenadante foi transferido para um tubo limpo. A concentração de proteína do cérebro inteiro lisado foi medida por ensaio de Bradford (normalmente ~ 15 mg / ml).
6. O lisado foi aliquotado e armazenado a-70C.

Parte 3: Isolamento de P2X2 C-tail proteínas associadas

Para identificar os parceiros de ligação de P2X2 CT-GST de lisados ​​cérebro inteiro, um pull down ensaio foi realizado usando CT-GST imobilizada em esferas de glutationa sepharose 4B como isca. Para controles, GST sozinho ligada a grânulos foi usado.

1. Cérebro lisado foi contas devem ser pré-GST para 1 hora a 4C. O pellet foi descartado eo sobrenadante foi usado para análises posteriores.
2. Quantidades iguais de GST e P2X2 CT-GST (10 mg) obrigado a glutationa sepharose 4 contas B foram incubadas durante a noite com 100 g de proteínas solubilizadas precleared de rato lisado cérebro inteiro, com rotação de 4C no tampão de lise.
3. Contas foram centrifugada a 1000 g por 5 min eo sobrenadante foi descartado.
4. As pérolas foram lavadas uma vez com o tampão de lise e cozido em modificadas Laemli buffer [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-mercaptoetanol, 2% (v / v) de glicerol, 0,004% (w / v) de azul de bromofenol e 0,125 M pH 6,8 TrisCl] por 5 min.
5. As amostras foram girados em 5000 g por 5 min eo sobrenadante separado por 10% SDS-PAGE (Fig. 4). Géis foram corados com SYPRO gel de proteínas de Ruby mancha (de acordo com as instruções do fabricante) e visualizado sob luz ultravioleta. P2X2 CT-proteínas associadas foram comparados com aqueles recuperados usando GST nulo como isca. Quatro réplicas biológicas foram realizadas (ou seja, quatro cérebros e quatro downs puxar independentes).

Parte 4: Identificação de proteínas.

Proteínas separadas por eletroforese em gel foram excisados ​​do gel e identificados por espectrometria de massa ^12. Nota: ausência de poeira ao longo do processo é fundamental para reduzir a contaminação de queratina. O experimentador deve usar uma máscara facial, rede de cabelo e luvas em todos os momentos e nunca toque na região gel de interesse sem o uso de luvas.

1. Todas as bandas de proteínas visíveis recuperou a força para baixo P2X2 foram excisadas com uma lâmina de barbear limpo e picado (Fig. 4). Regiões correspondentes do gel na GST nulo pull down lane também foram excisadas da mesma forma sem levar em conta a coloração da banda (bandas específicas para a isca GST nulo também foram retirados e identificados) para garantir que a presença de proteínas abaixo do nível da sensibilidade a marcação não foi desperdiçada.
2. As peças gel foram incubadas com 200 mL de bicarbonato de amônio 50 mM em 50% (v / v) acetonitrila (ACN) e os tubos agitadas por 15 min em temperatura ambiente. Repita este passo de lavagem.
3. As peças foram desidratadas gel pela adição de 200 mL de acetonitrila (peças gel deve encolher e tornar-se opaco na cor).
4. Acetontrile foi removido e as peças em um gel seco speedvac para ~ 10 min.
5. As peças gel foram incubadas com 30 mL do recém-preparada 10 mM mM Tris DTT/10 (2-carboxi-etílico) fosfina cloridrato (TCEP) de volume suficiente para mergulhar as peças. Isso foi deixado por 30 min em banho-maria 56C.
6. Em seguida a solução de DTT foi substituído por 100 l de bicarbonato de amônio 500 mM em solução de acetonitrila 50% e as fatias de gel lavado com bicarbonato ammounium.
7. A solução de lavagem foi aspirado e 200 mL de acetonitrila adicionado ao desidratar o gel.
8. Acetonitrila foi então removido e 100 l preparada solução a 100 iodoacetamida mM foi adicionado em alquilação sulfhydryls livre. Esta etapa começou há 25 min à temperatura ambiente no escuro.
9. Solução iodoacetamida foi removido e as peças gel foram lavadas com 200 mL de bicarbonato de amônio 50 mM em acetontrile 50% (pH 8,0) por 2 min, enquanto vórtex. Esta etapa de lavagem foi repetido.
10. Após a remoção da solução de lavagem, as peças gel foram incubadas com 200 mL de acetonitrila que foi retirado por speedvac por ~ 10min.
11. Nesta etapa as peças gel está pronto para a digestão de tripsina. Pedaços de gel foram incubadas em 30 mL de solução de tripsina (20 concentração ng / mL de trabalho) e colocado em gelo por 10 min para o gel de ser bem inchado. Tripsina excesso foi removido e reidratados partículas de gel revestida com 30 mL com 50 mM de bicarbonato de amónio para mantê-los imersos durante a digestão que foi autorizado a prosseguir por 12 a 16 horas a 37C.
12. Cinco mL de 5% (v / v) ácido fórmico é adicionado para desativar a digestão com tripsina e prisão.
13. Tubos foram agitadas para ~ 15 min e centrifugado brevemente para levar o líquido até o fundo do tubo, que foi então transferido para um frasco limpo e rotulado ml 0,5.
14. ML 30 próxima de 0,1% (v / v) de ácido fórmico em acetonitrila 50% foi adicionado em pedaços gel que eles eram apenas cobertos seguido por vórtex duas vezes por 10-15 min, separado por centrifugação breve. Este passo foi repetido uma vez, substituindo o ácido fórmico e acetonitrilo entre as etapas.
15. O líquido final foi removido e toda a solução de extração combinados em um único frasco. Este volume foi reduzido para ~ 30 uL na speedvac. A amostra foi agora pronto para cromatografia de fase reversa nano-líquidos e identificação de proteínas por espectrometria de massa. Neste exemplo específico, esta etapa é realizada em um espectrômetro de massa Orbi-trap conjunto de ThermoFIsher (escolhido pela sua precisão massa elevada, ciclo de trabalho rápido para detecção da proteína e, geralmente, características operacionais robustos), embora outros modelos e instrumentos de fabricantes poderiam facilmente ser conjugada com a abordagem descrita para este ponto.
16. Os detalhes e critérios para análises de espectrometria de massa são brevemente apresentados. Todos os peptídeos foram separados por fase reversa nano-LC (Eksigent) e peptídeos foram carregados em uma coluna de fase reversa C18 a uma vazão de 3 mL / min. A fase móvel foi de 0,1% de ácido fórmico e ACN 2% da água; B da fase móvel foi de 0,1% de ácido fórmico e 20% de água em ACN. Peptídeos foram eluídos da coluna a uma vazão de 220 nl / min utilizando um gradiente linear de 5% para B B 50% mais de 90 min, e depois a B 95% mais de 5 min, e, finalmente, manter B constante de 95% por 5 min . Espectros foram adquiridos em data-dependente com o modo de Orbi armadilha utilizada para scans MS e LTQ para MS / MS scans. Peptídeos foram identificados através de pesquisa os espectros no banco de dados de rato IPI v.3.53 usando o algoritmo SEQUEST integrado no pacote de software Bioworks. Cada peptídeo preencheram os seguintes critérios: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (2), ≥ 4 (+3), e DeltaCN> 0,1. Todos os espectros utilizados para identificação de proteínas foram inspecionadas manualmente e sem proteínas aceitos quando menos de dois peptídeos foram identificados. Proteínas presentes apenas seguir cada um dos quatro downs P2X2 puxar e ausentes durante downs GST nulo pull foram considerados para análises posteriores.

Figura 1. Representação esquemática de um receptor P2X2 subunidade. A. O desenho ilustra a topologia de uma subunidade do receptor P2X2. O domínio citosólico consiste em N e C termini. O C-terminal do receptor P2X2 (vermelho) foi usado como isca para puxar para baixo ensaio. B. seqüência de aminoácidos do receptor P2X2 C-terminal utilizado neste estudo.

Figura 2. Fluxograma e linha do tempo do protocolo utilizado para a expressão, purificação, puxar para baixo e identificação de proteínas. Mostramos o esboço do protocolo com a linha do tempo. Lisado de cérebro de rato adulto foi preparado fresco imediatamente antes do uso para a puxar para baixo os ensaios.

Figura 3. Representação esquemática da análise proteômica de binário P2X2 rede C-terminal no cérebro de ratos. O C-terminal de receptores P2X2 em fusão com GST proteína ligada a grânulos GST foi utilizada para puxar para baixo os ensaios. Lisado cérebro foi preparado e proteínas foram incubadas com as proteínas recombinantes imobilizado. Fracção livre foi lavado com o tampão de lise. Proteínas foram identificadas por espectrometria de massa.

Figura 4. Identificação dos parceiros de ligação do C-terminal de P2X2 receptores. Sypro gel corado mostrando um espectro de proteínas putativas que interagem com o C-terminal dos receptores de fusão com GST (caixa azul). Controles pistas para GST sozinho (caixa amarela) e glutationa sepharose contas sozinhos também são mostrados. As setas indicam exemplos de bandas de originais que foram excisadas para posterior análise por espectrometria de massa.

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Discussão

Canais iônicos são uma classe importante de proteínas da membrana integral. Eles contêm poros cheios de água que, seletivamente, permitir o movimento de íons para baixo suas gradientes eletroquímicos através da membrana plasmática. Ion portão canais entre os estados aberto e fechado. A etapa de propagação é desencadeada por transmissores (por exemplo, ATP) em caso de ligante P2X canais iônicos fechado, ou pode ser regulada por interações com outras proteínas. A última década testemunhou um aumento na ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Reagent	JT Baker	9829-02
Acrylamide	Reagent	Bio-Rad	161-0156
Ampicillin	Reagent	VWR international	VW1507-01
Ammonium Bicarbonate	Reagent	Fluka	09830
Ammonium Persulphate (APS)	Reagent	Sigma-Aldrich	A3678
Adenosine Triphosphate (ATP)	Reagent	Sigma-Aldrich	A7699
Bradford reagent	Reagent	Bio-Rad	500-0006
Bromophenol blue	Reagent	Fisher Scientific	B-392
Commassie blue R-250	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-24972
Dithiotritol (DTT)	Reagent	EMD Millipore	3860
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Reagent	VWR international	VW1474-01
Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)	Reagent	Sigma-Aldrich	E8145
Formic acid	Reagent	EMD Millipore	11670-1
Glutathione Sepharose 4B beads	Reagent	GE Healthcare	17-5132-01
Hydrochloric acid (HCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	H1758
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Reagent	Sigma-Aldrich	15502
Iodoacetamide	Reagent	Sigma-Aldrich	I1149
Luria-Bertani (LB) Media	Reagent	EMD Millipore	1.00547.5007
Leupeptin	Reagent	Sigma-Aldrich	L8511
Lysozyme	Reagent	Sigma-Aldrich	62971
Magnesium Sulphate (MgSO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Chloride (NaCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium Flouride (NaF)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7920
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S6508
Nonidet P40	Reagent	Fluka	74385
Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)	Reagent	Sigma-Aldrich	P7626
Protease inhibitor tablet	Reagent	Sigma-Aldrich	S8820
Protein standard	Reagent	Bio-Rad	161-0305
Sarkosyl	Reagent	Acros Organics	61207
Screw top vial	Tool	Agilent Technologies	5182-0866
Sodium dodecyl sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	L4509
SYPRO® Ruby protein gel stain	Reagent	Bio-Rad	170-3125
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Reagent	Sigma-Aldrich	T9281
Tris base	Reagent	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T9284
Trypsin	Reagent	Promega Corp.	V5111
Tween 20	Reagent	Sigma-Aldrich	P5927
Water	Reagent	Burdick & Jackson	365-4
LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer	Tool	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Nano Liquid Chromatography System	Tool	Eksigent
B-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	M6250
Glycerol		EMD Millipore	GX0185-6