Proteomics, um Proteine ​​interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.

Zusammenfassung

Liganden-gesteuerte Ionenkanäle unterliegen synaptischen Kommunikation im Nervensystem ^1. Bei Säugetieren gibt es drei Familien von Liganden-gesteuerte Kanäle: die Cys-Schleife, die Glutamat-gesteuerten und der P2X-Rezeptor-Kanäle ^2. In jedem Fall bindend des Senders führt zur Öffnung einer Pore, durch die Ionen fließen ihres elektrochemischen Gradienten. Viele Liganden-gesteuerte Kanäle sind auch durchlässig für Kalzium-Ionen ^{3, 4,} die stromabwärts Signalisierung haben Rollen ⁵ (zB Gen-Regulation), dass die Dauer der Kanalöffnung überschreiten darf. So Liganden-gesteuerte Kanäle können über weite Zeitskalen von wenigen Millisekunden bis Tagen Signal. Angesichts dieser wichtigen Rolle ist es notwendig zu verstehen, wie Liganden-gesteuerte Ionenkanäle sich durch Proteine ​​reguliert werden, und wie diese Proteine ​​können tune-Signalisierung. Neuere Studien legen nahe, dass viele, wenn nicht alle Kanäle kann ein Teil des Proteins Signalkomplexe ⁶ sein. In diesem Artikel erklären wir, wie die Proteine, die an der C-terminalen Aspekte des P2X2-Rezeptors cytosolischen Domäne binden zu identifizieren.

P2X-Rezeptoren sind ATP-gated Kationen-Kanäle und bestehen aus sieben Untereinheiten (P2X1-P2X7). P2X-Rezeptoren sind weit verbreitet im Gehirn, wo sie vermitteln exzitatorischen synaptischen Transmission und präsynaptischen Erleichterung der Neurotransmitter Release ⁷ zum Ausdruck gebracht. P2X-Rezeptoren sind in erregbaren und nicht-erregbaren Zellen gefunden und vermitteln wichtige Rollen in neuronalen Signalübertragung, Entzündungen und Herz-Kreislauf-Funktion ^8. P2X2-Rezeptoren sind reichlich im Nervensystem ⁹ und stehen im Mittelpunkt dieser Studie. Jeder P2X-Untereinheit wird angenommen, dass zwei Membran überspannt Segmente (TM1 und TM2) durch einen extrazellulären Bereich ⁷ und intrazelluläre N-und C-Terminus (Abb. 1a) ⁷ getrennt zu besitzen. P2X-Untereinheiten ¹⁰ (P2X1-P2X7) zeigen 30-50% Sequenzhomologie auf Aminosäure-Ebene ^11. P2X-Rezeptoren enthalten nur drei Untereinheiten, die den einfachsten Stöchiometrie unter ionotropen Rezeptoren ist. Der P2X2-C-Terminus besteht aus 120 Aminosäuren (Abb. 1b) und enthält mehrere Protein-Docking-Konsens Standorten unterstützen die Hypothese, dass P2X2-Rezeptors kann Teil Signalkomplexe werden. Doch obwohl mehrere Funktionen, die C-Terminus von P2X2-Rezeptoren ⁹ zugeschrieben haben keine Studie hat die molekulare Partner beschrieben, dass einige der intrazellulären Seite des Proteins über die volle Länge C-Terminus. In diesem Verfahren Papier beschreiben wir eine Proteom-Ansatz, um die Proteine, die mit der vollen Länge C-Terminus von P2X2-Rezeptoren interagieren zu identifizieren.

Protokoll

Experimentelle Verfahren

Das experimentelle Verfahren (Abb. 2) besteht aus vier Teilen, die in einer stufenweisen Weise beschrieben werden.

Teil 1: Subklonierung und Expression der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren.

Wir haben die volle Länge C-Terminus von P2X2-Rezeptoren in Bakterien auf das Gehirn Proteine, an die es bindet identifizieren ausgedrückt.

1. Der C-Terminus (Aminosäuren 353-472) des P2X2-Rezeptors (Abb. 1) wurde durch PCR amplifiziert, kloniert in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) und verifiziert mit Sequenzierung.
2. Das rekombinante Plasmid wurde in E. verwandelt Coli (BL21) für die Expression von rekombinanten Proteinen.
3. Glycerol Aktien von Bakterien (E. coli BL21) mit dem P2X2 CT-GST-Plasmid wurden mit einer sterilen Pipettenspitze abgekratzt und geimpft in 5 ml Luria-Bertani (LB)-Medium mit geeigneten selektiven Marker (50 g / ml Ampicillin) und über Nacht in einem Schüttler bei 37 ° C inkubiert.
4. Die Kulturen angebaut wurden über Nacht in 250 ml LB-Medium mit einem geeigneten Antibiotikum (50 ug / ml Ampicillin) inokuliert und in einem Schüttler bei 250 rpm für 2-3 Stunden bei 37 ° C, bis die optische Dichte bei 600 nm erreicht ~ 0,6-0,7.
5. Die Kultur wurde mit 1 mM IPTG induziert und weiter bei 37 ° C für 3 Stunden für die Proteinexpression inkubiert.
6. Die Kultur wurde dann bei 5000 g für 15 min bei 4C (1 ml Kultur wurde für die Analyse der Expression gespeichert und gekennzeichnet als "induzierte") ausgegliedert. Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 20 ml Saline Tris-EDTA (STE)-Puffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0) resuspendiert.
7. Die Suspension wurde bei 5000 g für 15 min in einem 50 ml Falcon-Röhrchen geschleudert. Der Überstand wurde verworfen und die halbtrockene Pellet wurde in gefrorenem Zustand bei-70C über Nacht.
8. Die 70C-Pellet wurde in 40 ml eiskaltem Lysepuffer (2% (w / v) Sarkosyl, 15 mg Lysozym, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT und vollständige Protease-Inhibitor-Tablette) resuspendiert , und die Suspension auf Eis für 30 min inkubiert. Während dieser Inkubation wurden 3 ml Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen mit 20 ml Phosphatpuffer Saline (PBS) und 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) TritonX-100 in PBS) von PBS gewaschen. Die Perlen wurden in 1 ml PBS resuspendiert.
9. Die Bakteriensuspension wurde 3 mal in flüssigem Stickstoff eingefroren und aufgetaut und beschallt (1s on / off, 30 Mikron für 3 min auf Eis) und weitere 30 min mit 4% (v / v) Triton X-100, 10 mM MgSO inkubiert ₄ und 2 mM ATP auf Eis.
10. Das Lysat wurde bei 20000 g für 15 min bei 4C und Pellet gesponnen wurde verworfen (eine Probe aus Pellets und 1 ml Überstand wurde für die SDS-Seite gespeichert, die Mengen der Proteine ​​im Cytosol und Membranen-Test). Der Überstand wurde mit den Beads für 1 h (oder über Nacht) bei 4C inkubiert.
11. Die Perlen wurden bei 500 g für 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen (Probe wurde für ungebundene Fraktion gespeichert). Die Perlen wurden mit T-PBS fünfmal (Waschungen wurden für Wasch-Steuerelemente gespeichert) gewaschen.
12. Die Perlen wurden dann in PBS resuspendiert zu geben 50% (w / v) Suspension und in Kühlschrank bei 4 ° C bis zur Verwendung. Die Proteinkonzentration wurde nach Bradford (pro Herstellerangaben) geschätzt.

Teil 2: Herstellung des gesamten Gehirns Lysaten

P2X2-Rezeptoren sind dafür bekannt, reichlich im Gehirn ⁸ ausgedrückt werden. In der vorliegenden Analyse haben wir versucht, die Proteine ​​interagieren mit P2X2-Rezeptoren aus Ratte ganze Gehirn-Lysaten (Abb. 3) zu identifizieren.

1. Adult Rattenhirn wurde geerntet (Tiere wurden nach einem UCLA IAACUC-genehmigten Protokoll und nach den NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren geopfert) und gespült sofort eiskaltem PBS (3X).
2. Um die Zellen zu lysieren 10 ml (~ 5-fache der Nassgewicht geerntet Gehirn) eiskaltem Lysepuffer mit 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na ₃ VO _4, 1 mM PMSF, 5 ug / ml Leupeptin, wurde 1% (v / v) NP-40, und ein Protease-Inhibitor Cocktail Tabletten, die geerntet Gehirn aufgenommen.
3. Hirngewebe wurde auf Eis mit einem Glas-Homogenisator homogenisiert Dounce, bis eine Mischung aus homogene Konsistenz erreicht wurde.
4. Zelllysat wurde bei 2000 g für 5 Minuten zentrifugiert, um die ungebrochene Zellen zu entfernen. Der Überstand wurde gesammelt und drehte wieder bei 29000 g für 60 Minuten auf intakte Organellen und Membran Aggregate zu entfernen.
5. Unmittelbar nach Zentrifugation wurde der Überstand in ein sauberes Röhrchen übertragen. Die Proteinkonzentration des gesamten Gehirns Lysat wurde durch Bradford-Assay gemessen (in der Regel ~ 15 mg / ml).
6. Das Lysat wurde aliquotiert und bei-70C.

Teil 3: Isolierung von P2X2 C-tail-assoziierten Proteinen

Zur Identifizierung der Bindungspartner von P2X2 CT-GST aus ganzen Gehirn-Lysaten, ein Pull-down-Assay wurde unter Verwendung von CT-G durchgeführtST an Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen als Köder immobilisiert. Für Kontrollen wurde GST allein verpflichtet, Perlen verwendet.

1. Brain-Lysat wurde mit GST Perlen für 1 Stunde bei 4C vorgereinigt. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand wurde für weitere Analysen verwendet.
2. Gleiche Mengen von GST und P2X2 CT-GST (10 ug) gebunden an Glutathion-Sepharose 4 B Kügelchen wurden über Nacht mit 100 g vorgereinigt solubilisierten Proteine ​​aus Ratte ganze Gehirn Lysat inkubiert, mit der Rotation bei 4 ° C im Lysepuffer.
3. Beads wurden bei 1000 g für 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen.
4. Die Perlen wurden einmal mit Lysepuffer gewaschen und gekocht in modifizierter Laemli buffer [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-Mercaptoethanol, 2% (v / v) Glycerin, 0,004% (w / v) Bromphenolblau und 0,125 M TrisCl pH 6,8] für 5 min.
5. Die Proben wurden bei 5000 g für 5 min und der Überstand durch 10% SDS-PAGE (Abb. 4) getrennt gesponnen. Die Gele wurden mit SYPRO Ruby Proteingel Fleck (nach den Anweisungen des Herstellers) und visualisiert unter UV-Licht gefärbt. P2X2 CT-assoziierte Proteine ​​wurden mit denen wieder mit GST-null als Köder verglichen. Vier biologischen Replikaten durchgeführt wurden (dh vier Köpfe und vier unabhängigen Pull-Downs).

Teil 4: Identifizierung von Proteinen.

Proteine, die durch Gelelektrophorese aufgetrennt wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels Massenspektrometrie identifiziert ¹² Hinweis:. Abwesenheit von Staub während des gesamten Prozesses ist entscheidend für Keratin Verschmutzung zu reduzieren. Der Versuchsleiter sollte ein Mundschutz getragen werden, Haarnetz und Handschuhe zu allen Zeiten und berühren Sie niemals die Gel-region of interest, ohne die Verwendung von Handschuhen.

1. Alle sichtbaren Proteinbanden aus dem P2X2-Pulldown wieder wurden mit einer Rasierklinge herausgeschnitten und in Würfel geschnitten (Abb. 4). Entsprechenden Regionen des Gels in der GST-null bis Fahrspur ziehen waren auch in der gleichen Weise, ohne Rücksicht auf Band-Färbung (Bands spezifisch für die GST-null Köder wurden ausgeschnitten und identifiziert), um die Anwesenheit von Proteinen unter dem Niveau des versichern herausgeschnitten Färbung Empfindlichkeit war nicht zu übersehen.
2. Die Gelstücke wurden mit 200 ul 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat in 50% (v / v) Acetonitril (ACN) und die Rohre für 15 min bei RT inkubiert gevortext. Wiederholen Sie diesen Waschschritt.
3. Die Gelstücke wurden entwässert durch Zugabe von 200 ul Acetonitril (Gelstücke sollten schrumpfen und undurchsichtig in Farbe).
4. Acetonitril wurde entfernt und die Gelstücke getrocknet in einer Speedvac für ~ 10 min.
5. Die Gelstücke wurden dann mit 30 ul der frisch zubereiteten 10 mM DTT/10 mM Tris (2-Carboxy-ethyl) phosphan-Hydrochlorid (TCEP) mit ausreichendem Volumen inkubiert, um die Stücke zu vertiefen. Dies wurde für 30 min bei 56C Wasserbad links.
6. Als nächstes wird die DTT-Lösung wurde mit 100 ul 500 mM Ammoniumhydrogencarbonat in 50% Acetonitril-Lösung und das Gel Scheiben mit ammounium Bicarbonat gewaschen ersetzt.
7. Die Waschlösung wurde abgesaugt und 200 pl Acetonitril hinzugefügt, um die Gele zu entwässern.
8. Acetonitril wurde dann entfernt, und 100 ul frisch zubereiteten 100 mM iodoacetamide Lösung wurde hinzugefügt, um freie Sulfhydryle alkylieren. Dieser Schritt ging für 25 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
9. Iodacetamid Lösung wurde entfernt und die Gelstücke wurden mit 200 ul 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat in 50% Acetonitril (pH 8,0) für 2 min gewaschen, während Vortexen. Dieser Waschschritt wurde wiederholt.
10. Nach dem Entfernen der Waschlösung wurden die Gelstücke mit 200 ul Acetonitril, die dann von Speedvac für ~ 10min entfernt wurde, inkubiert.
11. Bei diesem Schritt die Gelstücke sind bereit für Trypsinverdauung. Gel Stücke wurden in 30 ul Trypsin-Lösung (20 ng / ul Arbeitskonzentration) inkubiert und auf Eis für 10 min für die Gele auch geschwollen sein. Überschüssiges Trypsin wurde entfernt und rehydriert Gelpartikel mit 30 ul mit 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat überlagert, um sie während der Verdauung, die erlaubt, für 12 bis 16 Stunden bei 37 ° C vor eingetaucht wurde.
12. Fünf ul von 5% (v / v) Ameisensäure zugesetzt, um das Trypsin und Verhaftung Verdauung zu deaktivieren.
13. Die Röhrchen wurden für ~ 15 min gevortext und kurz zentrifugiert, um die Flüssigkeit auf den Boden der Röhre, die dann zu einer sauberen und beschriftet 0,5 ml Röhrchen überführt zu bringen.
14. In den nächsten 30 ul 0,1% (v / v) Ameisensäure in 50% Acetonitril wurde Gelstückchen hinzugefügt, so waren sie nur durch Vortexen zweimal für 10-15 min, getrennt durch kurze Zentrifugation bedeckt gefolgt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt, anstelle der Ameisensäure-Acetonitril zwischen den Schritten.
15. Die endgültige Flüssigkeit wurde entfernt und alle Extraktionslösung kombiniert in einer einzigen Flasche. Dieses Volumen wurde auf ~ 30 UL in den Speedvac reduziert. Die Probe wurde nun für Reverse-Phase-nano-Flüssig-Chromatographie und Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie. In diesem konkreten Beispiel wird dieser Schritt auf einer Orbi-Trap-Tandem-Massenspektrometer von ThermoF durchgeführtFinisher (gewählt für seine hohe Masse Genauigkeit, schnelle Einschaltdauer für Protein-Erkennung und generell robust Betriebssystem-Funktionen), obwohl auch andere Modelle und Hersteller "Instrumente leicht konnte mit dem beschriebenen Ansatz zu diesem Punkt gekoppelt werden.
16. Die Einzelheiten und Kriterien für die massenspektrometrischen Analysen werden nun kurz vorgestellt. Alle Peptide wurden durch Umkehrphasen-nano-LC (Eksigent) und Peptide wurden auf einer C18 Reverse-Phase-Säule mit einer Flussrate von 3 ml / min geladen getrennt. Mobile Phase A bestand aus 0,1% Ameisensäure und 2% ACN in Wasser; mobile Phase B lag bei 0,1% Ameisensäure und 20% Wasser in ACN. Die Peptide wurden aus der Säule mit einer Flussrate von 220 nl / min mit einem linearen Gradienten von 5% B auf 50% B über 90 min, dann auf 95% B über 5 min eluiert und schließlich konstant zu halten 95% B für 5 min . Die Spektren wurden in Daten-abhängigen Modus mit der Orbi-Falle für MS-Scans und LTQ für MS / MS-Scans verwendet erworben. Die Peptide wurden durch die Suche der Spektren gegen die Ratte IPI Datenbank v.3.53 mit dem SEQUEST Algorithmus in die Bioworks Software-Paket integriert identifiziert. Jedes Peptid die folgenden Kriterien erfüllte: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (+3) und DeltaCN> 0,1. Alle Spektren für Protein-Identifizierung verwendet wurden manuell geprüft und keine Proteine ​​angenommen, wenn weniger als zwei Peptide identifiziert wurden. Nur Proteine ​​nach jeder der vier P2X2 Pull-Downs und abwesend während GST-null Pull-Downs, wurden für weitere Analysen berücksichtigt.

Abbildung 1. Schematische Darstellung eines P2X2-Rezeptor-Untereinheit. A. Die Karikatur zeigt die Topologie eines P2X2-Rezeptor-Untereinheit. Die cytosolische Domäne besteht aus N-und C-Termini. Der C-Terminus von P2X2-Rezeptors (rot) wurde als Köder für Pull-down-Assay verwendet. B. Aminosäuresequenz des P2X2-Rezeptors C-Terminus in dieser Studie verwendet.

Abbildung 2. Flussdiagramm und Zeitachse des Protokolls für die Expression verwendet, Reinigung, Pull-down-und die Identifizierung von Proteinen. Wir zeigen den Umriss des Protokolls mit der Zeitleiste. Adult Rattenhirn Lysat wurde unmittelbar vor Gebrauch herzustellen für den Pull-down-Assays frisch.

Abbildung 3. Schematische Darstellung der binären Proteomanalyse von P2X2-C-Terminus-Netzwerk im Gehirn der Ratte. Der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren mit GST-Protein gebunden GST Perlen geschmolzen wurde für Pull-down-Assays verwendet. Brain-Lysat wurde vorbereitet und Proteine ​​wurden mit den immobilisierten rekombinanten Proteinen inkubiert. Unbound Fraktion wurde mit dem Lysepuffer gewaschen. Die Proteine ​​wurden durch Massenspektrometrie identifiziert.

Abbildung 4. Identifizierung der Bindungspartner der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren. Sypro gefärbten Gel zeigt ein Spektrum von vermeintlichen Proteinen, die mit dem C-Terminus von Rezeptoren mit GST (blauer Kasten) fusioniert zu interagieren. Steuert Fahrspuren für GST alleine (gelber Kasten) und Glutathion-Sepharose-Kügelchen allein sind ebenfalls dargestellt. Die Pfeile zeigen Beispiele der einzigartigen Bands, die für die weitere Analyse durch Massenspektrometrie wurden herausgeschnitten.

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Diskussion

Ionenkanäle sind eine wichtige Klasse von integralen Membranproteinen. Sie enthalten Wasser gefüllten Poren, die selektiv erlauben die Bewegung der Ionen bis ihre elektrochemischen Gradienten über die Plasmamembran. Ionenkanäle Tor zwischen offenen und geschlossenen Zuständen. Die Gating Schritt wird durch Sender (z. B. ATP) im Falle von P2X-Liganden gesteuerte Ionenkanäle ausgelöst, oder es kann durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen reguliert werden. Das letzte Jahrzehnt hat eine Erhöhung der unser Verst...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Reagent	JT Baker	9829-02
Acrylamide	Reagent	Bio-Rad	161-0156
Ampicillin	Reagent	VWR international	VW1507-01
Ammonium Bicarbonate	Reagent	Fluka	09830
Ammonium Persulphate (APS)	Reagent	Sigma-Aldrich	A3678
Adenosine Triphosphate (ATP)	Reagent	Sigma-Aldrich	A7699
Bradford reagent	Reagent	Bio-Rad	500-0006
Bromophenol blue	Reagent	Fisher Scientific	B-392
Commassie blue R-250	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-24972
Dithiotritol (DTT)	Reagent	EMD Millipore	3860
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Reagent	VWR international	VW1474-01
Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)	Reagent	Sigma-Aldrich	E8145
Formic acid	Reagent	EMD Millipore	11670-1
Glutathione Sepharose 4B beads	Reagent	GE Healthcare	17-5132-01
Hydrochloric acid (HCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	H1758
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Reagent	Sigma-Aldrich	15502
Iodoacetamide	Reagent	Sigma-Aldrich	I1149
Luria-Bertani (LB) Media	Reagent	EMD Millipore	1.00547.5007
Leupeptin	Reagent	Sigma-Aldrich	L8511
Lysozyme	Reagent	Sigma-Aldrich	62971
Magnesium Sulphate (MgSO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Chloride (NaCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium Flouride (NaF)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7920
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S6508
Nonidet P40	Reagent	Fluka	74385
Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)	Reagent	Sigma-Aldrich	P7626
Protease inhibitor tablet	Reagent	Sigma-Aldrich	S8820
Protein standard	Reagent	Bio-Rad	161-0305
Sarkosyl	Reagent	Acros Organics	61207
Screw top vial	Tool	Agilent Technologies	5182-0866
Sodium dodecyl sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	L4509
SYPRO® Ruby protein gel stain	Reagent	Bio-Rad	170-3125
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Reagent	Sigma-Aldrich	T9281
Tris base	Reagent	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T9284
Trypsin	Reagent	Promega Corp.	V5111
Tween 20	Reagent	Sigma-Aldrich	P5927
Water	Reagent	Burdick & Jackson	365-4
LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer	Tool	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Nano Liquid Chromatography System	Tool	Eksigent
B-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	M6250
Glycerol		EMD Millipore	GX0185-6