Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

Özet

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve polifenolik lignin bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol açıklar.

Özet

Yenilenebilir, karbon nötr, sanayi ve toplum için sürdürülebilir hammadde ihtiyacını 21. yüzyıl için en önemli sorunlardan biri haline gelmiştir. Bu ulaşım için sıvı yakıtların üretimi için endüstriyel hammadde olarak bitkisel ürünlerin kullanımı ilgi başlattı.

Protokol

1. Hücre Duvarı İzolasyon

1. IWall kullanarak bir 2 ml Sarstedt vidalı kapaklı tüp 5.5 mm paslanmaz çelik bilya hava dondurmak veya kurutulmuş bitki materyali yaklaşık 60-70mg Grind, öğütme ve dağıtım robot (30 s). Bölüm II ² bilyalı değirmen (retschmill) kullanarak alternatif olmayan robot düşük verimlilik prosedürü sunulmaktadır.
2. 1.5 ml% 70 sulu etanol reçete zemin malzemesi, ve iyice vorteks ekleyin.
3. 10.000 rpm'de 10 dakika pelet için alkol çözünmeyen kalıntı santrifüjleyin.
4. Süpernatantı aspire veya süzün.
5. Kalıntı kloroform / metanol (1:1 v / v) solüsyonu 1.5 ml ekleyin ve pelet tekrar süspansiyon tüpü iyice sallayın.
6. 10,000 rpm ve 10 dakika süpernatant aspirat veya süzün santrifüjleyin.
7. 500 ul aseton içinde süspanse edin pelet.
8. Kuruyana kadar hava akımı 35 ° C ile solvent buharlaşır.
   Gerekli kurutulmuş örnekleri daha fazla işlem kadar oda sıcaklığında saklanabilir.
9. Örnek nişasta kaldırılması başlatmak için 1.5 ml 0.1 M sodyum asetat tamponu pH 5.0 pelet tekrar süspansiyon.
10. 20 dakika Sarstedt boru ve ısı Cap. 80 ° C ısıtma bloğu.
11. Süspansiyon buz üzerinde soğutun.
12. Pelet için aşağıdaki maddeler:% 0.01 sodyum azid (NaN3) 35 ul 35 ul amilaz (50 mg / ml H ₂ O; Bacillus türleri, Sigma); 17 ul pullulanase (Bacillus acidopullulyticus 17,8 birimleri; Sigma) . Ve iyice vorteks tüp kap.
13. Süspansiyon 37 gece boyunca inkübe ° C çalkalayıcı. Tüpler yönlendirmek yatay yardımcıları karışım geliştirdi.
14. Isı süspansiyon 100 ° C sindirim sonlandırmak için bir ısıtma bloğu 10 dk.
15. Santrifüj (10.000 rpm, 10 dakika) ve supernatant içeren çözünür nişasta atın.
16. 1.5 ml su ekleyerek vorteks, santrifüj ve çamaşır suyu şişeden kalan pelet üç kez yıkayın.
17. 500 ul aseton içinde süspanse edin pelet.
18. Kuruyana kadar hava akımı 35 ° C ile solvent buharlaşır. Daha iyi kurutma için bir spatula ile tüp içindeki malzemeyi kırmak için de gerekli olabilir.
    Kurumuş malzeme izole hücre duvarı (lignocellulosics) sunar. Gerekli kurutulmuş örnekleri daha fazla işlem kadar oda sıcaklığında saklanabilir.

2. Lignin İçerik

Bu yöntem Fukushima ve Hatfield 3 tarafından bildirilen yöntem dayanmaktadır.

1. 1 - 1.5 mg (1) hazırlanan hücre duvar malzemesi için boş bir tüp boş bir kalkan 2 ml.lik ölçülü balona tartılır.
2. tüp duvarları tüpün alt hücre duvarı malzeme toplamak için 250 ul aseton ile temizleyin, durulayın ve aseton çok hafif hava akımı altında buharlaşması.
3. Yavaşça sıçramasını önlemek için tüp duvarları boyunca taze yapılmış asetil bromür çözüm 100 ul ekleyin (% 25 v / v buzul asetik asit asetil bromür).
4. Cap hacimsel 50 balon ve ısı ° C 2 saat için
5. Her 15 dakikada bir vorteks ile ek saat için ısıtın.
6. Oda sıcaklığına kadar buz üzerinde soğutun.
7. 2M sodyum hidroksit ve 0.5 M hidroksilamin hidroklorür taze hazırlanmış 70 ul 400 ul ekleyin. Vortex hacimsel şişeler.
8. Buzul asetik asit, şapka ile tam 2.0 ml işareti ölçülü balona kadar doldurun ve karıştırmak için birkaç kez ters.
9. Pipet 200 UV özel 96 plaka çözüm ul ve 280nm ELISA okuyucu okumak.
10. (; Otlar = 17.75; Kavak Arabidopsis = 18,21 = 15,69) uygun bir katsayı ile asetil bromür çözünür lignin (% ABSL) oranını belirlemek için aşağıdaki formül ile :
    % ABSL Kireçlenme:
    
    10 sonuç ug / mg hücre duvar ünitesi ile% ABSL çarpımı
    
    Bu parçacık absorbans değerleri, küçük bir değişime neden olabilir bu yana absorbans (abs) ortalaması en az 3 plaka okuma yapmak için yardımcı olur. Not: 0,539 cm yollu temsil eder, ama plaka bağlı olarak bu tespit edilmesi gerekebilir.

3. Lignin Kompozisyon

Bu yöntem, Robinson ve Mansfield ⁵ tarafından yayınlanan yeni bir yöntem benimsenmiştir.

1. Hücre duvar malzemesi yaklaşık 2 mg (1). Thioacidolysis için vidalı kapaklı cam tüp içine aktarın.
2. % 2.5 bor trifluoride dietil etherate (BF ^3),% 10 ethanethiol (EtSH) çözümü, dikkatle hazırlayın. Dioksan şişe nitrojen ile kayıp ses yerinden azot gazı ile dolu bir balon kullanmanız gerekir. Dioksan çok tehlikeli, kaput numune veya ekipman yapmayız. 20 ul EtSH; 5 ul BF ³ 175 ul dioksan: Hacimler örnek başına çözümün hazırlanması için gerekli.
3. EtSH, BF ^3, her bir örnek dioksan çözüm 200 ul ekleyin .
4. Hemen azot gazı ve kapak Temizle flakon headspace.
5. Isı 100 ° C nazik karıştırma her saat ile 4 saat.
6. 5 dakika boyunca buz üzerinde soğutma sonu reaksiyon.
7. 150 ul 0.4M sodyum bikarbonat, girdap
8. Temiz su 1 ml ve 0.5 ml etil asetat, girdap ve aşamaları ayrı izin (alt üst, su üzerinde etil asetat).
9. 2 ml Sarstedt tüp içine etil asetat tabaka 150 ul aktarın. Hiç su transfer olduğundan emin olun.
10. Hava ile konsantratör çözücü buharlaşır.
11. (Iki kez olmak üzere toplam için tekrar aşırı su çıkarmak) 200 ul aseton ekleyin ve buharlaşır.
12. TMS türevlendirme için 500 ul, etil asetat, piridin 20 ul ve 100 ul N, O-bis (trimethylsilyl) her tüp asetamid ekleyin.
13. 2 saat boyunca inkübe 25 ° C
14. GC / MS şişenin içine reaksiyon 100 ul aktarın ve 100 ul aseton ekleyin.
15. Quadrupole kütle spektrometresi veya alev iyonizasyon dedektörü ile donanımlı GC örnekleri analiz edin. Bir Agilent HP-5MS sütun (X 0.25 mm X 0.25 mikron film kalınlığı 30 mm) monte edilir. Aşağıdaki sıcaklık gradienti 30 dakika solvent gecikme ve bir 1.1 ml / dak akış hızı ile birlikte kullanılır: 130 İlk tutun ° C için 3 dk; 3 ° 250 - C / dak rampa ° C ve 1 dakika boyunca tutun; izin 130 ° C başlangıç ​​sıcaklığı için dengeleme
16. Peaks tetracosane internal standart (isteğe bağlı) kullanarak göreceli tutma süreleri veya 299 karakteristik tayf iyonları tarafından tespit m / z, 269 m / z ve 239 m / z S, G ve H monomerler, sırasıyla (bkz. Şekil. 2). Lignin bileşenleri kompozisyon toplam pik alanı% 100 ayarı ile sayısal

4. Temsilcisi Sonuçlar

Bir duvar analizi bir örnek Şekil 2'de sunulmuştur. Bu durumda kavak kök (ağaç) protokol bölümünde belirtilen çeşitli işlemler analiz edildi. Kromatogram thioacidolysis sonra lignin bileşenlerinin ayrılması ve TMS-türevlendirme bir örnek gösterilmiştir. Açıkçası, göreceli bolluk syringyl-(S), guaiacyl-(G), ve p-hydroxyphenol (H) birimleri tespit edilebilir. Asetil bromür çözünür lignin içeriği kendi kendini açıklayıcı, bir duvar kuru ağırlığının% 20-50 arasında değerler bekleyebilirsiniz. Bir o asetil bromür duvardaki lignin mevcut çözünür ve çözünürleştirme derecesi malzemeye bağlı olarak değişebilir değildir dikkat etmelisiniz. Ancak, bu yöntem nispeten yürütmek kolay ve hızlı ve lignin içeriği mükemmel bir yaklaşım, lignocellulosic bir malzeme verir.

Şekil 1: lignocellulosic analiz Genel Bakış Hücre duvarları (lignocellulosics) ham kurutulmuş bitki materyali izole edilmiştir. Duvar malzemesi, sonra alikotları içine ağırlıklı ve çeşitli deneyleri için bölünmüştür. Asetil bromür ve UV spektroskopisi ile nicel çözündüğünü lignin duvar malzemesi ile tedavi edilir. Lignin kompozisyonunun belirlenmesi için, duvar malzemesi thioacidolysis tabi tutulur. Çözünür fenolik TMS türevlendirme geçmesi ve daha sonra ayrılmış ve GC-MS analizi ile sayısal olabilir. Bölüm II ² matris polisakkarit kompozisyon ve kristalin selüloz içeriği protokolü tartışılmıştır.

Şekil 2: kavak (Populus tremoloides) kavak ahşap Kapsamlı lignocellulosic analiz Ahşap cips açıklanan protokollere tabi tutuldu.
Ligin kompozisyon, H p-hidroksifenil, G guaiacyl S syringyl birimleri.

Tartışmalar

Açıklanan yöntemlerden lignin içeriği ve lignocellulosic bitki biyokütle bileşimi hızlı bir sayısal değerlendirme sağlar. IWall robot kullanarak yaklaşık 350 örnek zemin ve ücreti günlük reçete edilmesi. Kişi başına düşen çeşitli analitik yöntemlerin hacmi değişir. Protokolleri Burada anlatılan, lignin içeriği için 30 örnek işlenmiş ve lignin Hergün kompozisyon için 15 olabilir. Nicel veri en uygun hammadde bitkileri doğası nedeniyle, çeşitli veya genotipler, biyoyakıt üretimi için kendi uygunluk açısından değerlendirilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydroxylamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	255580
Acetyl Bromide	Aldrich	135968
Ethanethiol	Sigma-Aldrich	E3708
Borontrifluoride diethyl etherate	Fluka	15719
N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide	Fluka	15241
Dioxane	Sigma-Aldrich	296309
Spectromax Plus 384	Molecular Devices	Plus384
GC-MS	Agilent Technologies	6890 GC/5975B MSD	(lignin composition)
5.5mm Stainless Steel Balls	Salem Ball Company	(N/A)
96 well plate heat spreader	Biocision	Coolsink 96F
Heating block	Techne	Dri-block DB-3D
Sample concentrator	Techne	FSC400D