Completa l'analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte I: lignina

Riepilogo

Biomassa vegetale è uno dei principali carbon-neutral risorsa rinnovabile che potrebbero essere utilizzati per la produzione di biocarburanti. Biomassa vegetale è costituita principalmente delle pareti delle cellule, un materiale composito chiamato strutturalmente complesso legnocellulosa. Qui si descrive un protocollo per un'analisi completa del contenuto e la composizione della lignina polifenoliche.

Abstract

La necessità di fonti rinnovabili, carbon neutral, e sostenibile di materie prime per l'industria e la società è diventata una delle questioni più pressanti per il 21 ° secolo. Questo ha riacceso interesse per l'uso di prodotti vegetali come materie prime industriali per la produzione di combustibili liquidi per il trasporto

Protocollo

1. Isolamento della parete cellulare

1. Grind circa 60-70mg di aria o liofilizzato materiale vegetale con 5,5 palle mm in acciaio inox in una ml 2 tappo della provetta Sarstedt vite utilizzando un iWall, un robot macinazione e dosaggio (30 s). L'alternativa non-robotica a basso throughput usando una procedura di mulini a palle (retschmill) è presentata nella Parte II, ^2.
2. Aggiungere 1,5 ml di etanolo al 70% acquosa al materiale terra erogato, e vortice accuratamente.
3. Centrifugare a 10.000 rpm per 10 minuti per far sedimentare il residuo insolubile alcool.
4. Aspirare o decantare il sopranatante.
5. Aggiungere 1,5 ml di cloroformio / metanolo (1:1 v / v) per il residuo del tubo e agitare accuratamente per risospendere il pellet.
6. Centrifugare a 10.000 rpm per 10 minuti e aspirare o decantare il sopranatante.
7. Risospendere il pellet in 500 ml di acetone.
8. Evaporare il solvente con una corrente d'aria a 35 ° C fino a secco.
   Se necessario campioni essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente fino al procedimento successivo.
9. Per avviare la rimozione di amido dal campione risospendere il pellet in 1,5 ml di sodio 0,1 M pH 5,0 tampone acetato.
10. Cap i tubi Sarstedt e calore per 20 min. a 80 ° C su una piastra riscaldante.
11. Raffreddare la sospensione sul ghiaccio.
12. Aggiungere i seguenti agenti al pellet: 35 ml di 0,01% di sodio azide (NaN3), 35 amilasi microlitri (50 mg / ml H ₂ O, da specie Bacillus, Sigma), 17 pullulanasi microlitri (17,8 unità da acidopullulyticus Bacillus; Sigma) . Chiudere la provetta e miscelare accuratamente.
13. La sospensione è incubata per una notte a 37 ° C nello shaker. Orientare i tubi in orizzontale aiutanti migliorato miscelazione.
14. Sospensione di calore a 100 ° C per 10 minuti su una piastra riscaldante di interrompere la digestione.
15. Centrifuga (10.000 rpm, 10 min) e scartare il surnatante contenente amido solubilizzato.
16. Lavare il rimanente a pellet per tre volte con l'aggiunta di 1,5 ml di acqua, vortex, centrifugazione e decantazione delle acque di lavaggio.
17. Risospendere il pellet in 500 ml di acetone.
18. Evaporare il solvente con una corrente d'aria a 35 ° C fino a secco. Potrebbe essere necessario anche per rompere il materiale nel tubo con una spatola per una migliore essiccazione.
    Il materiale essiccato presenta parete isolata cella (legnocellulosa). Se necessario campioni essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente fino al procedimento successivo.

2. Lignina Contenuto

Questo metodo si basa su un metodo riportato da Fukushima e Hatfield 3.

1. Pesare 1-1,5 mg di materiale preparato parete cellulare (vedi 1) in 2 ml matraccio lasciando un tubo vuoto di uno spazio vuoto.
2. lavare le pareti del tubo da 250 ml di acetone per raccogliere il materiale della parete cellulare nella parte inferiore del tubo, e far evaporare l'acetone molto delicato sotto il flusso d'aria.
3. Delicatamente aggiungere 100 ml di soluzione appena fatto bromuro di acetile (25% v / v bromuro di acetile in acido acetico glaciale) lungo le pareti del tubo per evitare schizzi.
4. Cap volumetrico matraccio e riscaldare a 50 ° C per 2 ore
5. Calore per un'altra ora con vortex ogni 15 minuti.
6. Raffreddare in ghiaccio a temperatura ambiente.
7. Aggiungere 400 ml di idrossido di sodio 2M e 70 ml di preparati al momento 0,5 M idrossilammina cloridrato. Vortex matracci tarati.
8. Riempire pallone tarato esattamente a 2,0 ml segno con acido acetico glaciale, il tappo e capovolgere più volte per mescolare.
9. Pipettare 200 ml di soluzione in un UV specifico 96 pozzetti e leggere in un lettore ELISA a 280 nm.
10. Determinare la percentuale di lignina bromuro di acetile solubile (% ABSL) utilizzando un adeguato coefficiente (pioppo = 18,21; Erbe = 17,75; Arabidopsis = 15,69) con la seguente formula:
    % ABSL Calc:
    
    Moltiplicazione delle ABSL% con 10 risultati in ug / mg unità della parete cellulare
    
    Aiuta a fare almeno 3 piatto legge in media l'assorbanza (abs) dal particolato può causare una lieve variazione nei valori di assorbenza. Nota: 0,539 centimetri rappresenta il cammino ottico, ma a seconda del piatto questo potrebbe aver bisogno di essere determinato.

3. Lignina Composizione

Questo metodo è adottato da un metodo di recente pubblicato da Robinson e Mansfield ^5.

1. Trasferire circa 2 mg di materiale della parete cellulare (vedi 1.) In una provetta di vetro con tappo a vite per thioacidolysis.
2. preparare con cura il 2,5% trifluoruro di boro dietil etherate (BF ^3), 10% ethanethiol (EtSH) soluzione. È necessario utilizzare un pallone riempito di gas azoto per spostare il volume perso in bottiglia diossano con azoto. Diossano è molto pericoloso, non prelevare campioni o apparecchiature fuori dal cofano. Volumi necessari per la preparazione della soluzione per campione: 175 microlitri diossano, 20 EtSH microlitri, 5 microlitri BF ^3.
3. Aggiungere 200 ml di EtSH, BF ^3, diossano soluzione ad ogni campione.
4. Purge spazio di testa flacone con gas azoto e tappo immediatamente.
5. Calore a 100 ° C per 4 ore con dolce mescolando ogni ora.
6. Reazione fine di raffreddamento in ghiaccio per 5 minuti.
7. Aggiungere 150 ml di bicarbonato di sodio 0.4M, vortice
8. Per la pulizia aggiungere 1 ml di acqua e 0,5 ml di acetato di etile, vortex e lasciare separare le fasi (acetato di etile in alto, l'acqua sul fondo).
9. Trasferire 150 ml di strato di acetato di etile in una provetta da 2 ml Sarstedt. Assicurarsi che l'acqua non viene trasferito.
10. Evaporare solvente da un concentratore d'aria.
11. Aggiungere 200 microlitri e far evaporare l'acetone (ripetere per un totale di due volte rimuovere l'acqua in eccesso).
12. Per la derivatizzazione TMS aggiungere 500 ml di acetato di etile, 20 ml di piridina, e 100 ml di N, O-bis (trimetilsilil) acetamide ad ogni provetta.
13. incubare per 2 ore a 25 ° C.
14. Trasferire 100 microlitri della reazione in un GC / MS fiala e aggiungere 100 ml di acetone.
15. Analizzare i campioni da GC dotato di un quadrupolo-spettrometro di massa o della ionizzazione di fiamma. Un sistema HP-5MS Agilent colonna è installato (30 mm x 0,25 mm X 0,25 spessore micron). Il gradiente di temperatura seguente viene utilizzato con un ritardo di 30 minuti e un solvente 1,1 ml / min Portata: tenere iniziale a 130 ° C per 3 minuti, un 3 ° C / min fino ad un rampa di 250 ° C e mantenere per 1 minuto; permettono equilibrio alla temperatura iniziale di 130 ° C.
16. Picchi sono identificati con tempi di ritenzione relativi con tetracosane standard interno (opzionale) o da ioni caratteristico spettro di massa di 299 m / z, 269 m / z, monomeri e 239 m / z di S, G e H, rispettivamente (vedi fig. 2). La composizione dei componenti lignina è quantificato impostando l'area totale dei picchi al 100%

4. Rappresentante Risultati

Un esempio di analisi muro è presentato in figura 2. In questo caso fusto di pioppo (legno) è stato analizzato mediante le varie procedure descritte nella sezione protocollo. Un esempio di cromatogramma la separazione della lignina componenti dopo thioacidolysis e TMS-derivatizzazione è mostrato. Chiaramente, l'abbondanza relativa di syringyl-(S), guaiacyl-(G), e p-hydroxyphenol-(H) unità può essere determinato. Il contenuto di lignina solubile bromuro di acetile si spiega da sé, ci si può aspettare tra i valori del 20-50% del peso a secco della parete. Si noti che il bromuro di acetile non solubilizzare tutti i presenti lignina nella parete, e che il grado di solubilizzazione può variare a seconda del materiale. Tuttavia, questo metodo è relativamente facile da realizzare e rapida e fornisce una eccellente approssimazione del contenuto di lignina in un materiale ligno-cellulosica.

Figura 1:. Panoramica di analisi lignocellulosici pareti cellulari (legnocellulosa) sono isolati dal greggio materiale vegetale essiccato. Il materiale della parete viene poi pesata in aliquote e suddiviso per i vari metodi. Materiale della parete è trattato con bromuro di acetile e la lignina solubilizzato quantificato spettroscopia UV. Per la determinazione della composizione lignina, materiale della parete è sottoposto a thioacidolysis. I composti fenolici solubilizzato subire derivatizzazione TMS e possono quindi essere separati e quantificati mediante analisi GC-MS. La composizione polisaccaride matrice e cristallino protocollo contenuto di cellulosa è discusso nella Parte II, ^2.

Figura 2:. Completa analisi lignocellulosici di legno di pioppo Cippato di pioppo (Populus tremoloides) sono stati sottoposti ai protocolli descritti.
Ligin composizione; H p-idrossifenil; G guaiacyl; S unità syringyl.

Discussione

I metodi descritti permettono una rapida valutazione quantitativa del contenuto di lignina e la composizione della biomassa vegetale lignocellulosiche. Utilizzando il robot iWall circa 350 campioni di terreno e può essere erogato al giorno. La velocità dei vari metodi analitici per persona varia. Utilizzando i protocolli descritti qui, a 30 campioni possono essere trattati per contenuto di lignina, e 15 per la composizione della lignina al giorno. A causa della natura quantitativa della materia prima ottimale dei dati raccolti, varietà o genotipi può essere valutata in termini di idoneità per la produzione di biocarburanti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydroxylamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	255580
Acetyl Bromide	Aldrich	135968
Ethanethiol	Sigma-Aldrich	E3708
Borontrifluoride diethyl etherate	Fluka	15719
N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide	Fluka	15241
Dioxane	Sigma-Aldrich	296309
Spectromax Plus 384	Molecular Devices	Plus384
GC-MS	Agilent Technologies	6890 GC/5975B MSD	(lignin composition)
5.5mm Stainless Steel Balls	Salem Ball Company	(N/A)
96 well plate heat spreader	Biocision	Coolsink 96F
Heating block	Techne	Dri-block DB-3D
Sample concentrator	Techne	FSC400D