Всеобъемлющее Композиционные Анализ стен растительной клетки (лигноцеллюлозной биомассы) Часть I: Лигнин

Резюме

Растительной биомассы является одним из основных углеродно-нейтральным возобновляемым ресурсом, который может быть использован для производства биотоплива. Растительной биомассы в основном состоит из клеточных стенок, структурно-сложных композитных материалов называют lignocellulosics. Здесь мы опишем протокол для всестороннего анализа содержания и состава полифенольных лигнина.

Аннотация

Необходимость возобновляемых, нейтральным уровнем эмиссии углерода и устойчивого сырья для промышленности и общества стала одной из самых актуальных вопросов для 21-го века. Это возродило интерес к использованию растительных продуктах, как промышленное сырье для производства жидкого топлива для транспорта

протокол

1. Изоляция клеточной стенки

1. Grind примерно 60-70мг воздушного или сублимированные растительного сырья с 5,5 мм из нержавеющей стальных шариков в 2 мл Sarstedt винтовой крышкой трубки использованием iWall, измельчения и дозирования робота (30 с). Альтернативных не-робота низкой пропускной процедуры с использованием шаровой мельницы (retschmill) представлен в части II ^2.
2. Добавить 1,5 мл 70% водного раствора этанола в землю обойтись материала, и вихрь тщательно.
3. Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 10 мин для осаждения спиртом нерастворимого остатка.
4. Аспирацию или переливать супернатант.
5. Добавить 1,5 мл хлороформ / метанол (1:1 об / об) решение остатков и тщательно встряхнуть трубку для ресуспендирования гранул.
6. Центрифуга на 10000 оборотов в минуту в течение 10 мин и аспирата или переливать супернатант.
7. Ресуспендируют осадок в 500 мкл ацетона.
8. Evaporate растворитель с потоком воздуха при 35 ° С до полного высыхания.
   При необходимости высушенные образцы могут храниться при комнатной температуре до дальнейшей обработки.
9. Для начала удаления крахмала из образца ресуспендируют осадок в 1,5 мл 0,1 М буферного раствора ацетата натрия рН 5,0.
10. Cap Sarstedt труб и огне в течение 20 мин. при 80 ° С в нагревательном блоке.
11. Прохладный подвески на льду.
12. Добавьте следующие агенты гранул: 35 мкл 0,01% азида натрия (NaN3), 35 мкл амилазы (50 мкг / мл H ₂ O; из видов Bacillus, Sigma), 17 мкл pullulanase (17,8 единиц из Bacillus acidopullulyticus; Sigma) . Крышка трубки и вихревые тщательно.
13. Подвеска инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С в шейкере. Ориентируемся трубы горизонтально помощники улучшение перемешивания.
14. Тепло подвески при 100 ° С в течение 10 мин в нагревательный блок прекратить пищеварение.
15. Центрифуга (10.000 оборотов в минуту, 10 мин) и отбросить супернатант, содержащий солюбилизированного крахмала.
16. Вымойте оставшиеся гранулы в три раза, добавляя 1,5 мл воды, вортексе, центрифугирования, а перефасовки промывных вод.
17. Ресуспендируют осадок в 500 мкл ацетона.
18. Evaporate растворитель с потоком воздуха при 35 ° С до полного высыхания. Это может быть необходимо также, чтобы разбить материал в пробирке с помощью шпателя для лучшей сушки.
    Высушенный материал представляет изолированных клеточных стенок (lignocellulosics). При необходимости высушенные образцы могут храниться при комнатной температуре до дальнейшей обработки.

2. Содержание лигнина

Этот метод основан на методе сообщили по Фукусима и Хэтфилд 3.

1. Взвесьте 1 - 1,5 мг подготовленный материал клеточной стенки (см. 1) в 2 мл мерную колбу, оставляя одну трубку пустой пустой.
2. промыть стенки трубы с 250 мкл ацетона собирать материал клеточной стенки в нижней части трубки, и испаряются ацетона очень нежный под потоком воздуха.
3. Аккуратно добавить 100 мкл свежеприготовленный раствор ацетил бромид (25% об. / ацетил метила в ледяной уксусной кислоты), вдоль стенок трубы для предотвращения разбрызгивания.
4. Cap мерную колбу и тепла при температуре 50 ° С в течение 2 часов
5. Тепло для дополнительного часа с вортексе каждые 15 минут.
6. Прохладный на лед до комнатной температуры.
7. Добавить 400 мкл 2М ​​гидроксида натрия и 70 мкл свежеприготовленного 0,5 М гидрохлорида гидроксиламина. Vortex мерные колбы.
8. Заполнение мерную колбу точно 2,0 мл знак ледяной уксусной кислотой, кепка и инвертировать в несколько раз перемешать.
9. Внесите 200 мкл раствора в УФ конкретных 96 ячейках и читать в ИФА на 280 нм.
10. Определить процент ацетил бромид растворимого лигнина (% ABSL) с использованием соответствующего коэффициента (Тополь = 18,21; Травы = 17,75; Arabidopsis = 15,69) со следующей формулой:
    % ABSL Calc:
    
    Умножение% ABSL по 10 результатов в мкг / мг единицу клеточной стенки
    
    Это помогает сделать по крайней мере 3 пластины читает средний абсорбции (ABS), так как частицы могут вызвать небольшие изменения в значения абсорбции. Примечание: 0,539 см представляет длина пути, но в зависимости от пластины этого, возможно, потребуется определить.

3. Лигнин Состав

Этот метод заимствован из последних метода опубликована Робинсон и Мэнсфилд ^5.

1. Передача около 2 мг клеточного материала стен (см. 1.) На винт ограничен стеклянной трубкой для thioacidolysis.
2. тщательно подготовить 2,5% трифторид бора диэтиловый эфирата (BF ^3), 10% ethanethiol (EtSH) решение. Вы должны использовать шар, наполненный азотом для вытеснения потеряли объем в диоксане бутылку с азотом. Диоксан очень опасными, не брать пробы или оборудования из капота. Объемы, необходимые для приготовления раствора на образец: 175 мкл диоксана, 20 мкл EtSH; 5 мкл BF ^3.
3. Добавить 200 мкл EtSH, BF ^3, диоксан решение каждого образца.
4. Чистки флакон свободном пространстве с азотом и шапку немедленно.
5. Тепло при 100 ° С в течение 4 часов с нежным смешивания каждый час.
6. Конец реакции при охлаждении на льду в течение 5 минут.
7. Добавить 150 мкл 0,4 М раствором бикарбоната натрия, вихрь
8. Для очистки добавить 1 мл воды и 0,5 мл этилацетата, вихревые и пусть фазы отдельных (этилацетат сверху, вода на дно).
9. Передача 150 мкл Этилацетатный слой в 2 трубки мл Sarstedt. Убедитесь, что вода не передается.
10. Evaporate растворителя концентратор с воздухом.
11. Добавить 200 мкл ацетона и испаряются (повтор на общую сумму в два раза удалить лишнюю воду).
12. Для производных TMS добавить 500 мкл этилацетата, 20 мкл пиридина и 100 мкл N, O-бис (триметилсилил) ацетамида в каждую пробирку.
13. инкубировать в течение 2 часов при 25 ° C.
14. Передача 100 мкл реакции в ГХ / МС флакон и добавьте 100 мкл ацетона.
15. Анализ образцов GC оборудован квадрупольного масс-спектрометра или детектором ионизации пламени. Agilent HP-5MS колонка установлена ​​(30 мм х 0,25 мм х 0,25 мкм толщины пленки). Следующие градиента температуры используется с 30 мин растворитель задержки и 1,1 мл / мин расход: Начальная держать при температуре 130 ° С в течение 3 мин; 3 ° С / мин рампы 250 ° C и удерживайте в течение 1 мин; позволяют равновесия для начальной температуры 130 ° C.
16. Пики обозначены относительных времен удерживания использованием tetracosane внутреннего стандарта (опция) или характерный масс-спектре ионов 299 т / г, 269 м / г, и 239 т / г для S, G, H и мономеров, соответственно (см. рис. 2). Состав лигнина компоненты можно измерить с помощью установки общей площадью пика до 100%

4. Представитель Результаты

Пример анализа стены представлена ​​на рисунке 2. В этом случае стволовые тополь (дерево) были проанализированы различные процедуры, изложенные в протоколе разделе. Пример хроматограммы разделения лигнина компонентов после thioacidolysis и ТМС-производных показана. Очевидно, что относительное обилие syringyl-(S), guaiacyl-(G), и р-hydroxyphenol-(H) единиц может быть определена. Содержание ацетил бромид растворимый лигнин говорит само за себя, можно ожидать, значения между 20-50% от сухого веса стены. Следует отметить, что ацетил бромид не растворить все лигнин присутствует в стену, и что степень растворения может изменяться в зависимости от материала. Однако этот метод является относительно легко осуществить и быстрым, и дает отличное приближение содержания лигнина в лигноцеллюлозных материала.

Рисунок 1:. Обзор лигноцеллюлозных анализ Клеточные стенки (lignocellulosics) выделяют из сырого высушенного материала растений. Материал стен, то взвешенный на аликвоты и подразделяется на различные анализы. Материал стен обрабатывают ацетил метила и растворяются лигнина количественно с помощью УФ-спектроскопии. Для определения состава лигнина, стеновой материал подвергается thioacidolysis. Солюбилизированного фенольные проходят ТМС производных и могут быть разделены и количественно с помощью ГХ-МС анализа. Состав матрицы полисахаридов и кристаллических протокол содержанием целлюлозы, обсуждается в Части II ^2.

Рисунок 2:. Всеобъемлющее лигноцеллюлозных анализ древесины тополя Щепа от тополь (Populus tremoloides) были подвергнуты описаны протоколы.
Ligin состава; Н р-гидроксифенил, G guaiacyl, S syringyl единиц.

Обсуждение

Описанные методы позволяют быстро количественной оценки содержания лигнина и состав лигноцеллюлозных биомассы растений. Использование робота iWall около 350 образцов могут быть отшлифованы и разливать в день. Пропускная способность различных аналитических методов на человека меняется. Использование протоколов, описанных здесь, 30 образцов могут быть обработаны для содержания лигнина и 15 для лигнина состава в день. Из-за количественного характера данных оптимальных культур сырья, разновидности или генотипов может быть оценен с точки зрения их пригодности для производства биотоплива.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydroxylamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	255580
Acetyl Bromide	Aldrich	135968
Ethanethiol	Sigma-Aldrich	E3708
Borontrifluoride diethyl etherate	Fluka	15719
N,O,-Bis(trimethylsilyl) acetimide	Fluka	15241
Dioxane	Sigma-Aldrich	296309
Spectromax Plus 384	Molecular Devices	Plus384
GC-MS	Agilent Technologies	6890 GC/5975B MSD	(lignin composition)
5.5mm Stainless Steel Balls	Salem Ball Company	(N/A)
96 well plate heat spreader	Biocision	Coolsink 96F
Heating block	Techne	Dri-block DB-3D
Sample concentrator	Techne	FSC400D