Miyokard Doku Mühendisliği Biyolojik Türetilmiş Enjektabl Malzeme imalatı

Özet

Enjektabl bir matris jel decellularized doku hazırlanması ve sıçan miyokardın içine enjekte Yöntemleri In vivo Tarif.

Özet

Bu protokol, miyokard doku mühendisliği uygulamaları için bir enjektabl ekstrasellüler matriks (ECM) jel hazırlanması için yöntemler sağlar. Kısaca, decellularized doku, liyofilize öğütülmüş, enzimatik sindirilir ve sonra fizyolojik pH getirdi. Liyofilizasyon küçük bir değirmen ile ince bir toz haline zemin kuru ECM sonuçlanan doku tüm su içeriği kaldırır. Freze sonra, ECM tozu enjektabl bir matris pepsin ile sindirilir. PH 7.4 düzeltmeler yapıldıktan sonra, sıvı matris malzemesi miyokard içine enjekte edilebilir. Önceki karakterizasyonu testlerinin sonuçları decellularized perikardiyal ve miyokardiyal doku üretilen matris jeller, çeşitli proteinler, peptidler ve glikozaminoglikanlar dahil olmak üzere, yerli ECM bileşenleri, korumak olduğunu göstermiştir. Doku mühendisliği için bu malzemenin kullanımı göz önüne alındığında, in vivo karakterizasyonu, özellikle yararlıdır; burada, sol ventrikül içine intramural bir enjeksiyon yapmak için bir yöntem (LV) serbest duvarında matris jel konak cevabı analiz aracı olarak sunulmuştur küçük bir hayvan modeli. Diyafram göğüs boşluğuna erişim yoluyla kazanılan ve enjeksiyon, hafif sol ventrikül serbest duvarında apeks yukarıda yapılır. Biyolojik olarak elde edilen iskele, enjeksiyondan önce biotin etiketleme görüntülenebilmekte ve sonra bir at turp peroksidaz-konjuge neutravidin diaminobenzidin (DAB) boyama ile boyama ve doku kesitlerinde görselleştirme. Histolojik ve immünohistokimyasal boyama ile enjeksiyon bölgesi analizi de yapılabilir. Bu şekilde, daha önce incelenmiş perikardiyal ve miyokardiyal matris jeller, lifli, gözenekli ağlar formu damar oluşumu ve enjeksiyon bölgesi içinde teşvik etmek gösterildi.

Protokol

1. Ön işleme Doku hazırlanması

1. Bu protokol kullanmadan önce, biri zaten seçim doku decellularized sahip olmalıdır. Bu örnek için, hipotonik ve hipertonik durular deiyonize (DI) su ve sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanarak taze domuz ve insan perikard örnekleri decellularized.
2. Özellikle, ilk 30 dakika için domuz perikard DI suyla yıkayın, daha sonra% 1'lik SDS fosfat sürekli karıştırın salin (PBS), 5 saat DI suyla durulama, 24 saat boyunca tamponlu. Insan pericardia, ilk kez bir gecede DI durulama ardından, 60-65 saat süreyle PBS içinde% 1 SDS sürekli karıştırın, sonra 30 dakika boyunca DI suyla durulayın. Nihai çözüm tüm örnekler çıkarın ve DI su ¹ altında tekrar yıkayın.
3. Decellularization doğrulamak için, Ekim dondurma orta dondurma taze, küçük bir parça çıkarmak ve 10 mikron doku kesitlerinde boyunca her 100 mikron histolojik analizi ile inceleme için örnek almak, daha önce ^34-36 bildirdi.
4. Hematoksilen ve eosin (H & E) lekeleri çekirdeğinin olmaması için doku incelemek için kullanın. Bir de H & E sonuçları doğrulamak için DNA'nın bir floresan Hoescht 33.342 leke (1.0 mcg / mL) kullanmak olabilir; kısaca bölümleri düzeltmek rehidrate ve su ile durulayın, 10 dakika boyunca leke, ve sonra iyi durulayın ve karanlıkta saklayın. Alternatif olarak, bir örnek toplam DNA içeriği ölçmek için tasarlanmış olan Qiagen DNeasy Kan ve Doku kiti, kit gibi kullanabilirsiniz.

2. Enjektabl ECM hazırlanması

1. Liyofilizasyon
   1. Uygun ön hazırlıktan sonra, sıvı nitrojen ya da -80 ° C'de saklayarak decellularized örnekleri dondurma Tamamen kuruyana kadar örnekleri Lyophilize. Sistemi ve su içeriği örneklerinin bağlı olarak, bu yerden 12 ila 72 saat arasında sürebilir.
2. Frezeleme
   1. Bir kere tamamen kuru bir Wiley Mini Mill ince bir toz haline kuru ECM öğütmek için kullanılır. Amaçlarınız için uygun elek boyutunu seçin, burada, 40 gauge örgü kullanılır. Örnek çoğunluğu filtre aracılığıyla geldi sonra, öğütülmüş ECM toz toplama kavanozu çıkarmak. Sadece küçük bir örnek varsa, numunenin geri kalanı çeşitli şekillerde değirmen ayıklanır; burada, bir Q-tip değirmen sabit bıçakları arkasına takılıp ECM kaldırmak için kullanılır.
   2. Her zaman değirmen temiz ve enkaz serbest olduğundan emin olun. Değirmen ve örnek tamamen kuru olduğundan emin olmak için de önemlidir; Kalan nemi başarılı freze önlemede bir araya gelme agrega ve ECM neden olacaktır. ECM havadaki nem pick up ve değirmen lyophilizer doğrudan gitmek gerekir.
3. Sindirim
   1. Enjektabl ECM oluşturmak için, toz pepsin sindirilir. Aşağıdaki protokol ve ark, Freyetes güncellenmiştir. (2).
   2. In vivo olarak enjekte edilir ve kirlenme komplikasyonlara neden olabilir, mümkün olduğu kadar steril bir ürün olarak korumak için önemlidir. Bu nedenle, steril flakon kullanımı ve kaşık tartmak ve kullanmadan önce tüm çözümleri filtre. Freze sonra ve sindirim önce liyofilizasyon adım da kısırlık korumaya yardımcı olacaktır.
   3. ECM tozu istenilen miktarda, uygun bir sintilasyon şişenin içine tartılır. Daha küçük toplam hacim 1 ml, 2 ml flakon kullanımı önerilir ve daha büyük miktarlar için, 20 ml flakon Bu, etkili bir şekilde karıştırmak için flakonun alt yeterince sıvı olduğunu sağlar.
   4. Pepsin istenilen miktarda bir parıldamanın şişenin içine tartılır. Pepsin 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyon olduğu gibi 0.1 M HCl ekleyin. Pepsin çözüm vorteks hızlandırdı olabilir kullanmadan önce pepsin tamamen çözülür (partiküller) emin olun.
   5. ECM 10 mg / ml konsantrasyonda böylece ECM tozu ile sintilasyon flakon pepsin / HCl çözeltisi ekleyin.
   6. Ağırlığında bir kaşık veya spatula ile periyodik flakonun tarafı aşağı kazıma, 60-65 saat boyunca sürekli çözüm karıştırın.
4. pH Ayarı
   1. Bu adım, fizyolojik pH sıvı matris malzemesi getirmek ve daha fazla ECM yarma tutarak, pepsin inaktive etmek için yapılır. Yine, Millipore su ile yapılan süzülmüş çözümler kullandığınızdan emin olun.
   2. 1 M NaOH 1 / 10 orijinal ses eklenir. Bu noktada pH Test ve istenilen pH (7.4) ulaşmış olduğu NaOH veya HCl gibi az miktarda (2-10 ul) ekleyin. Nötralizasyon için eklenen ya da pH testi için çıkarılan tüm küçük miktarlarda takip edin. Sonra çözüm nötralize olmuştur, 10x PBS son hacmi (1 / 9 geçerli ses) 1 / 10 'u ekleyin. Enjektabl ECM konsantrasyonu belirlemek ve daha sonra istenilen son işbirliği ulaşmak için 1x PBS eklemekncentration, burada 6 mg / ml.
   3. Enjektabl ECM Karakterizasyonu SDS-PAGE Blyscan Kolorimetrik GAG Testi, ve kütle spektroskopisi ile yapılabilir.
   4. Bu noktada, matris malzemesi in vivo olarak miyokard doku mühendisliği için bir iskele oluşturacak şekilde enjekte edilir.
5. Biotin-etiketleme
   1. ECM enjekte ECM daha kolay görsellik için enjeksiyon önce biotin ile etiketlenmiş olabilir.
   2. Biotin bir 10mM çözüm hazırlayın ve 0.3mg/mg bir oranında enjektabl ECM ekleyin. ECM enjeksiyon için istenilen konsantrasyonda olmalıdır. 6 mg / ml konsantrasyonda enjekte ise, ECM 1 ml başına 40 mcL Biotin ekleyin. Enjeksiyonu öncesinde, en az 1 saat buz biotin-ECM çözümü tutmak.
6. Tüm işlem adımları, oda sıcaklığında yapılabilir. Jelleşme enjektabl matris tutmak için, pH ayarı adım, buz üzerinde yapılabilir.

3. Miyokard Enjeksiyonlar

1. Enjeksiyon hazırlık
   1. Burada kullanılan dişi sıçan (225-250 g), pH 7.4 enjektabl ECM 75 mcL enjeksiyonları 0,1 ml şırınga 30 gösterge iğne uçlu olarak hazırlanmıştır. Erkek sıçanlar (375-400 g) kullanılmış olsaydı, 90 mcL enjekte olabilir.
   2. Tüm cerrahi malzemeleri, cerrahi öncesi sterilize edilmelidir; burada tüm gerekli araçları içeren bir otoklavlanmış cerrahi paketi kullanabilirsiniz.
2. Ameliyat günü, bir Harlan Sprague-Dawley sıçan% 5 izofluran kullanarak anestezi otoskop kullanılarak entübe ve daha sonra işlem boyunca% 2.5 izofluran muhafaza.
3. Kuruluk ve saç karşı korumak için suni gözyaşı merhemi hayvanın gözleri ekleyin. Ameliyat sırasında hidrasyon için 3 mL Laktatlı Ringers çözüm yönetme. Bu alt karın bölgesinde subkütan enjeksiyon yoluyla yapılmalıdır.
4. Hayvan uzuvları aşağı cerrahi tablo ve hafifçe bant yatar pozisyonda yerleştirin. Karın ve ovma için önce vakum ücretsiz saç saç kaldırmak için kesme makineleri kullanın.
5. Zyphoid süreci karnın sağ alt tarafta köşegen boyunca lidokain% 2 küçük enjeksiyonlar (yaklaşık 50 mcL her) bir dizi olun. Sonra ortasında başlayan ve dışa doğru hareket, betadin ile üç kez fırçalayın. % 70 etanol ile tekrarlayın. Kapak önceden yapılmış yuvarlak bir pencere ile bir cerrahi örtü kullanarak hayvan; gerekirse, havlu kelepçeler ile güvenli.
6. No 10 neşter xiphoid süreci karnın sağ alt taraftan 3-4 cm'lik kesi yapmak. Xiphoid sürecini bulun ve sağ kas dikey olarak aşağı teşrih, sağda büyük damar önlemek için dikkatli olmak. Kas disseke, diyafram açığa, kas ile yanal kesmek için makas kullanmak. Karaciğer önlemek için dikkatli olun.
7. Zyphoid süreci boyunca 3-0 Vicrile sütür 36 inç uzunluğunda ve hemostat bir çift, sürücü bir iğne kullanma ve yarım yoluyla sütür çekin. Teyp dikiş birlikte sona erer ve aslında zyphoid yukarı kaldırarak ve diyafram açığa hayvan üstünde ve arkasında bir noktaya kadar bunu düzeltmek. 3-0 Vicrile dikiş başka bir 36 inç uzunluğu ile, bir iğne xiphoid süreci yakın kas sürücü ve, yine, tam cerrahi kavite açıklamanızı, cerrahi tablonun sağ başka bir noktaya sonlarına doğru çekin ve düzeltmek.
8. Bu noktada, diyafram ile kalp görmek gerekir. Küçük bir sıçan diş microforceps çifti, diyafram merkezi kapmak, kendinize doğru çekin ve künt makas ile çok küçük bir kesi yapmak. Akciğerlere alay önlemek için çok künt makas kullanmak son derece önemlidir. Bu delik yapıldıktan sonra, akciğerler, kalp görselleştirmek için diyafram üzerinden dikey 2-3 cm'lik bir kesi yapmak için izin, geri çekilecektir.
9. Boşluğunun sol yol akciğerlerden dışarı itmek için bir 3-inç S-ucu yerleştirin. Q-ucu yerinde sabitlemek için havlu kelepçe kullanın. Perikardiyal kese bulmak için yolun sağ akciğer dışarı taşımak için başka bir Q-tip kullanın. Microforceps bir çift ve bir çift büyük dişli forseps kullanarak, kalp apeksi açığa perikardiyal kese ile gözyaşı. Hayvanın daha önce enfarktüs prosedürüne tabi varsa, perikard zaten yok olacaktır.
10. Sıçan diş microforceps kalbin apeks alın ve apeks sıvı matris malzemesi üçüncü bir yol enjekte. Epikardiyal yüzeyine paralel iğne takın ve sol iğne kesik kenar ile enjekte. Büyük kalp damar önlemek için emin olun. Iğne çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin. Enjeksiyon yerinde doku bir beyazlatma göreceksiniz.
11. Temizlik boşluğunda kan ve sağ akciğer tutuyordu havlu kelepçe ve Q-tip kaldırmak. Kavisli microhemostats ve sıçan kullanın.diş diyafram kapatmak için microforceps. Bir ilk düğüm yapın ve sonra sürekli bir dikiş ve konik bir iğne ile diyafram kapatmak için tırtıklı forseps ve microhemostats kullanın. Tamamen kapatmadan önce, PE160 emme boru takın ve dikiş sıkılır gibi göğüs boşluğuna tahliye için 10 ml şırınga kullanın.
12. Düzgün bir şekilde boşaltıldı ve kapandığı zaman, diyafram iç bükey olmalıdır. Bir konveks diyafram boşluğunda hala hava olduğunu gösterir.
13. Bu noktada% 1 izofluran açılabilir.
14. Boşluğuna açık tutarak hem 3-0 Vicrile sütür dışarı atın. Q-tip veya steril gazlı bez ile silerek fazla kas hidrat steril su kullanın. Aralıklı sütürler ile kas tabakası kapatmak için yeni bir 3-0 dikiş uzunluğu kullanın.
15. Bu noktada, izofluran kapalı olabilir.
16. Temizlik steril su ve cilt kapatmak için kullanılması zımba alan. Zımba çalışmaya engel olacak ise, 5-0 prolin dikiş de kullanılabilir. Bu durumda, aralıklı sütürler ile deriye yakın bir ters kesme (RC) iğne kullanınız. Her iki durumda da, kapalı kesi üzerinden cerrahi yapıştırıcı nokta.
17. Kesi yeri üçlü bir antibiyotik merhem sürersin bir Q-ucu kullanın.
18. % 100 oksijen altında hayvan kurtarmak için izin verin.
19. Hayvanlar ventilatör geçici bir nefes almaya başladığında, trakea tüp çıkarın.
20. Hayvanlar sternal sonra, 0,05 mg / kg buprenorfin hidroklorür bir subkütan enjeksiyon yönetmek ve steril bir havlu onları evlerine kafesine geri dönmek.
21. Hayvanlar, post-operatif gözlem ve bakım almalıdır.
22. Ilgi zaman noktalarında, hayvanların ötenazi ve kalpleri analiz için kaldırılmıştır. Kısa eksen kesitleri alınır ve brüt doku analizi için hematoksilen ve eosin (H & E) ile boyandı. Kısa zaman noktalarında, enjekte edilen bölgede interstisyel yayıldı pembe bir fibröz bir ağ olarak görünecektir. Daha sonraki zaman noktalarında, tek bir hücre akını ve 2 ila 3 hafta sonra enjekte edilen matris nihai bir bozulma gözlemlemek olacaktır. ECM enjekte önce biotin ile etiketlenmiş ise, HRP-konjuge streptavidin biotin boyama ile daha doğrudan görüntülenmiştir olabilir. Immünohistokimyasal boyama slaytları burada bir Alexafluor ikincil endotel hücreleri ve fluoresces yeşil ve bir anti-düz kas aktin antikor bağlanır FITC-konjuge isolectin ile birlikte lekeli olan, enjeksiyon bölgesinde belirli hücreleri veya yapıların tanımlamak için kullanılır. kırmızı SMC'lere raporlar antikor.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Bu şekilde hazırlanan matris malzemelerin Önceki karakterizasyonu makromoleküllerin çeşitli tutma gösterdi. Özellikle, birden fazla lifli proteinler ve glikoproteinler kütle spektrometresi (Tablo 1) ile tespit edildi. Bu protokole göre işleme matris malzemeleri makromoleküllerin karmaşık bir dizi içeren artık tespit edilirse, istihdam decellularization protokolü çok sert olabilir. Bir kez tam liyofilize, kurutulmuş perikardiyal ECM, çok sert, buruşuk kağıt gibi görünüyor. Diğer doku tiplerinin fıstık paketleme benziyor. Eğer iyi öğütülmüş, ECM elekten düşmeli ve altındaki kavanoza toplanabilir. ECM, nem örnek bırakılırsa, bir araya gelme ve freze odasında yapışmış olsun. Sindirim sonra, ECM çözümü sütlü bir renk ve görünür partiküller tamamen ücretsiz olmalıdır. Aynı zamanda HCl sadece biraz daha viskoz olacaktır. ECM sindirimi değilse, flakon büyük parçacık hala orada; alternatif olarak, ECM çözümü çökebilir. PH ayarlaması sonra, gözle görülür hiçbir değişiklik çözüm ve ECM hala bulutlu, homojen bir sıvıdır. Jel başlarsa, viskozite artacak ve malzeme bir şırınga içine çekmek için zor ya da imkansız olacaktır. Bu durumda, önceden soğutulmuş çözümleri ile, buz üzerinde pH ayarlaması adım gerçekleştirin. Enjeksiyonları hazırlanmıştır sonra, kullanılıncaya kadar buz üzerinde saklayın. Enjeksiyon başarılı olursa, iğne ucu çevresindeki bölgede beyazlatır ve küçük bir bolus görülebilir. Eğer bu görülmez, enjeksiyon yerine duvara doğru odasına gitmiş olabilir. Enjeksiyonundan sonra hayvan dikilmesi, diyafram dikkatli kapanış en önemli adımdır. Doğru yapılırsa, diyafram, akciğerler karşı sıkı olacak ve içbükey görünecektir. Akciğerler içinde kalan herhangi bir hava varsa, diyaframın konveks kalır, ya da balonları bir alana sahip olacak. Erken bir zaman noktası (4 saat enjeksiyon sonrası 30 dakika) enjeksiyon bölgenin histoloji incelerken, bir yeniden birleştirilen matris malzemesi, enjeksiyon sonrası (Şekil 2) hücrelerinden yoksun bir pembe, lifli alan görmelisiniz . Ağ genellikle interstisyel yayılır ve birçok bölüm boyunca mevcut olabilir. Bir possmatris jel sadece çok küçük bir alanda görmek için ible açıklama enjeksiyon bir kısmı intramural hedef cevapsız ve ya LV odasına enjekte veya enjeksiyon yerini dışarı sızdırılmış. Buna ek olarak, interstisyel yayılması, jelleşme süresi bağlı olarak değişebilir.

Şekil 1 Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) sonuçları. (A) Molekül ağırlığı standart. (B) (C) çözünür insan ve domuz (D) perikardiyal ECM (7 mg / ml) ile karşılaştırıldığında Sıçan kuyruğu Kollajen Tip I (2.5 mg / ml). Kollajen varlığı yanı sıra diğer birçok protein ve perikardiyal matris örnekleri peptidler unutmayın.

Tablo 1: ECM bileşenlerini kütle spektroskopisi ile belirlenmiştir.

Şekil 2: Miyokard enjeksiyonları in vivo jelleşme. H & E insan (A) ve domuz leke (B) perikardiyal matris enjeksiyonları in vivo 45 dakika sonra jel var. Oklar matris konumu, lekeli açık pembe miyokard daha göstermektedir. Ölçek çubuğu 500 mm.

Şekil 3. Vasküler hücre infiltrasyonu. Enjekte insan (AC) ve iki hafta domuz (DF) matris jeller gemiler için Floresan lekeleri. Endotel hücreleri, düz kas hücrelerinin kırmızı (B, E) etiketli ise, yeşil (A, D) olarak etiketlenir. Birleştirilen görüntülerin gösterildiği gibi C ve F. Ölçek çubuğu 100 mikron. H & E analizi yakındaki bir bölümü tarafından belirlenen matris enjeksiyon alanında, beyaz noktalı çizgiler gösterir.

Şekil 4 matris enjeksiyon bölgesi içinde hücreler Kök. Hoescht çekirdekleri leke (mavi) ve c-kit (yeşil), insan ve domuz (A) (B) matris enjeksiyon bölgelerinde kök hücreleri tanımlayan. Ölçek çubuğu 50 mm.

Tartışmalar

Bu yöntem miyokardiyal doku mühendisliği için biyolojik olarak türetilmiş, enjektabl iskeleleri üretimi sağlar. Bu yöntemlerin ilk imalatı için geliştirilmiştir ve miyokard matris perikardiyal matris jel ile burada sunulan jel ve in vivo testler, bu protokolü, herhangi bir doku ile kullanım için adapte edilebilir olmasına rağmen, dokuya uygun decellularized olabilir. Decellularization yapılır ve matris jel DNA varlığı istenmeyen bir immün yanıt neden olabilir, bu yöntemlerin kullanılm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
Pepsin	Sigma-Aldrich	p6887-1G	Lyophilized
Biotin	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidin-HRP	Thomas Scientific	21130
Equipment:
Wiley Mini Mill	Thomas Scientific	3383L10
Labconco Lyophilizer	Labconco Corp.	7670520
Surgical supplies:
Betadine	Purdue Products L.P.	67618-154-16
Lactated Ringers Solution	MWI Veterinary Supply	003966
KY Jelly	MWI Veterinary Supply	28658
Lidocaine, 2%	MWI Veterinary Supply	17767
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Artificial tear ointment	Fisher Scientific	NC9860843
Triple antibiotic ointment	Fisher Scientific	19082795
Isoflurane	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
Otoscope	MWI Veterinary Supply	008699
Stop cock	MWI Veterinary Supply	006245
3-0 Vicrile suture	MWI Veterinary Supply	J327H
5-0 Proline suture	MWI Veterinary Supply	s-1173
Reverse cutting (RC) needle	Ethicon Inc.	8684G
Microhemostats	Fine Science Tools	13013-14
Rat tooth microforceps	Fine Science Tools	11084-07
No. 10 scalpel	Fine Science Tools	10110-01
Blunt scissors	Fine Science Tools	14108-09
Sharp, curved scissors	Fine Science Tools	14085-08
Large, serrated forceps	Fine Science Tools	1106-12
PE160 suction tubing	BD Biosciences	427430
Clippers	MWI Veterinary Supply	21608
Skin staples/stapler	Ethicon Inc.	PRR35
General supplies:
Stir plates
0.1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70% Ethanol
0.1 mL syringes
10 mL syringe
Q-tips
Surgical glue
Surgical drape
Towel clamps
Small hand-held vacuum