심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

요약

decellularized 조직에서 주사용 매트릭스 젤을 준비하고 밀고 myocardium에 주입을위한 방법 생체내에 설명되어 있습니다.

초록

이 프로토콜은 심근 조직 공학 응용 프로그램을위한 주사용 세포외 매트릭스 (ECM) 젤의 준비를 위해 방법을 제공합니다. 간단히, decellularized 조직은 동결 건조된 가공된, 효소 소화하고 생리 산도로 이동합니다. lyophilization은 작은 공장과 함께 좋은 분말로 지상 수있는 건조 ECM의 결과, 조직의 모든 수분을 제거합니다. 밀링 후, ECM 분말은 주사용 매트릭스를 형성하는 펩신과 소화 수 있습니다. 산도 7.4로 조정 후, 액체 매트릭스 자료는 myocardium에 주입 수 있습니다. 이전 특성화 assays의 결과 decellularized pericardial와 심근 조직에서 생산 매트릭스 젤은 다양한 단백질, 펩티드 및 glycosaminoglycans를 포함한 원시 ECM 구성 요소를 유지하는 것으로 나타났습니다. 조직 공학이 자료의 사용을 감안할 때, 생체내 특성화에 특히 유용합니다, 여기에, 왼쪽 심실로 교내 주사를 수행하기위한 방법 (LV) 무료 벽이있는 매트릭스 젤에 대한 호스트 응답을 분석하는 수단으로 제공됩니다 작은 동물 모델. 흉강에 대한 액세스가 격막을 통해 얻은이며 주사는 약간 LV 무료 벽 꼭대기 위에 이루어집니다. 생물 학적 파생된 발판이 주입하기 전에 비오틴 - 라벨로 시각하고 다음 기다려봐 퍼옥시데이즈 - 복합 neutravidin과 조직 섹션을 얼룩하고 diaminobenzidine (DAB) 얼룩을 통해 시각화 수 있습니다. 사출 지역의 분석도 histological과 immunohistochemical 얼룩과 함께 할 수 있습니다. 이런 방식으로, 이전에 검사 pericardial 및 심근 매트릭스 젤은 섬유, 다공성 네트워크를 형성하고 사출 지역 내의 혈관 형성을 촉진하기 위해 표시되었습니다.

프로토콜

1. 사전 처리 조직 준비

1. 이 프로토콜을 사용하기 전에, 하나는 이미 선택의 조직을 decellularized 있어야합니다. 이 예를 들어, 신선한 돼지의 인간 심장막 샘플 deionized (DI) 물과 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)에 hypotonic 및 hypertonic rinses를 사용 decellularized 있습니다.
2. 특히, 최초 30 분 DI 물에 돼지의 심낭을 씻고, 다음 인산염의 1% SDS에서 지속적으로 저어 호수 (PBS)는 5시간 DI 워터 린스 다음, 24 시간 동안 버퍼. 인간 pericardia 경우, 먼저 하루 DI 린스 다음, 60~65시간 위해 PBS에 1퍼센트 SDS에서 지속적으로 저어 후, 30 분 디 물에 헹굼. 그들의 최종 해결책 '에서 모든 생명체를 제거하고 DI 물 ^1을 실행 아래에서 다시 린스.
3. decellularization를 확인하려면, 10 월 동결 매체에 고정 신선한, 작은 조각을 제거 및 10 μm의 조직 섹션에게 histological 분석을 통해 시험을 위해 샘플을 통해 모든 100 μm의을뿐 이전에 ^{34-36을보고했다.}
4. 핵의 부재에 대한 조직 검사 hematoxylin 및 eosin (H & E) 얼룩을 사용합니다. 하나는 또한 H & E 결과를 확인하기 위해 DNA에 대한 형광 Hoescht 33,342 얼룩 (1.0 μg / ML) 사용할 수 있습니다, 짧게, 섹션을 수정 rehydrate하고 물에 씻어 10 분 얼룩 후 잘 씻어 어둠 속에 저장합니다. 또는, 하나는 샘플의 전체 DNA 내용을 계량하기 위해 설계되었습니다 Qiagen DNeasy의 혈액 및 조직 키트, 같은 키트를 사용할 수 있습니다.

2. 주사용 ECM의 준비

1. Lyophilization
   1. 적절한 준비 후, 액체 질소 또는 -80 ° C.에 저장하여 decellularized 샘플을 동결 완전히 건조까지 샘플을 Lyophilize. 시스템 및 샘플의 수분에 따라이은 12 72 시간 동안의 어디서든 걸릴 수 있습니다.
2. 밀링
   1. 일단 완전히 건조 빌리 미니 밀은 좋은 분말로 건조 ECM을 분쇄하는 데 사용됩니다. 귀하의 목적에 적합한 체 크기를 선택,, 여기 40 게이지 메쉬가 사용됩니다. 샘플의 대다수는 필터를 통해왔다되면, 가공된 ECM 가루와 함께 수집 병을 제거하십시오. 단지 작은 샘플이있다면, 예제의 나머지는 다양한 방법에있는 공장에서 추출 수 있으며, 여기 Q - 팁을은 공장의 정지 블레이드 뒤에 붙어 ECM을 제거하는 데 사용됩니다.
   2. 항상 공장 깨끗하고 파편 무료되어 있는지 확인합니다. 공장과 샘플 모두 완전히 건조되었는지 확인하는 것도 중요합니다, 남아있는 습기가 성공적으로 밀링 방지, 함께 집계 및 클럼프에 ECM을 일으킬 것입니다. ECM은 공기에서 습기를 데리러 수 있으며 그래서 공장에 lyophilizer 직접 이동해야합니다.
3. 소화
   1. 주사용 ECM을 형성하려면, 분말 펩신을 소화합니다. 다음 프로토콜은 외, Freyetes에서 바뀌었습니다. (2).
   2. 그것이 생체내 주입되며 오염 합병증을 일으킬 수 있으므로, 가능한 멸균 제품으로 유지하는 것이 중요합니다. 따라서, 멸균 튜브를 사용하고 숟가락의 무게를 사용하기 전에 모든 솔루션을 필터링합니다. 밀링 후 소화하기 전에 lyophilization 단계는 또한 불임을 유지하는 데 도움이됩니다.
   3. 적절한 섬광의 약병에 ECM 분말의 원하는 금액을 나가는거야. 1 ML보다 작은 총 볼륨의 경우, 그것은 당신이 2 ML의 약병을 사용하는 것이 좋습니다 그리고 큰 볼륨, 20 ML의 유리병. 이것은 효과적으로 휘몰아 유리병의 바닥에 충분한 액체있다는 것을 보장합니다.
   4. 섬광의 약병에 펩신의 원하는 금액을 나가는거야. 펩신 1 MG / ML의 농도에 있습니다 그러한 0.1 M HCL을 추가합니다. 이것은 펩신 솔루션을 vortexing하여 감소된 수있는 사용하기 전에 펩신이 완전히 (없음 입자) 해산되어 있는지 확인하십시오.
   5. ECM 10 MG / ML의 농도에되도록 ECM 가루와 함께 섬광 약병에 펩신 / HCL 솔루션을 추가합니다.
   6. 주기적으로 무게는 숟가락이나 주걱으로 유리병의 측면을 근근이 살아가고, 60-65시간에 대한 지속적인 솔루션을 저어.
4. 산도 조정
   1. 이 단계는 생리적 산도에 액체 매트릭스 자료를 가져 더욱 ECM을 cleaving에서 유지, 펩신을 inactivate로 수행됩니다. 다시 Millipore 물로 만든 필터 솔루션을 사용해야합니다.
   2. 1 M NaOH 1 / 10 원래 볼륨으로 추가됩니다. 이 시점에서 산도를 테스트하고 원하는 PH (7.4)가 도달되는 NaOH 또는 HCL 소량의 (2-10 μl)을 추가합니다. 중화에 대한 추가하거나 산도 테스트 제거된 모든 소량을 확인합니다. 일단 솔루션이 무력화되어, 10X PBS의 최종 볼륨 (1 / 9 현재 볼륨) 10분의 1로 추가할 수 있습니다. 주사용 ECM의 농도를 결정하고 원하는 최종 공동 도달하는 1X PBS를 추가ncentration, 여기를 6 MG / ML.
   3. 주사용 ECM의 특성은 SDS - PAGE, Blyscan Colorimetric 개그 분석, 그리고 질량 분광 분석법을 통해 할 수 있습니다.
   4. 이 시점에서, 매트릭스 재료는 심근 조직 공학을위한 발판을 형성 생체내 주입 수 있습니다.
5. 비오틴 - 라벨링
   1. ECM은 주입 ECM 쉽게 시각화를위한 사출하기 전에 비오틴 태그 수 있습니다.
   2. 비오틴의 10mM 솔루션을 준비하고 0.3mg/mg의 비율로 주사용 ECM을 추가할 수 있습니다. ECM은 주사에 원하는 농도에 있어야합니다. MG / ML 6 농도에 주입하면, ECM 1 ML 40 μL 비오틴을 추가합니다. 이전 주사로, 적어도 1 시간 동안 얼음에 비오틴 - ECM 솔루션을 유지.
6. 모든 처리 단계는 실온에서 수행할 수 있습니다. 겔화에서 주사용 행렬을 유지하려면, 산도 조절 단계는 얼음에서 할 수 있습니다.

3. 심근 주입

1. 사출 준비
   1. 여성의 쥐 (225~250g)가 여기에 사용하는 경우, 산도 7.4 주사용 ECM의 75 μL 주사는 0.1 ML 주사기 30 게이지 바늘로 밀고로 준비되었습니다. 남성 쥐 (3백75-4백그램)를 사용했을 경우, 90 μL을 주입 수 있습니다.
   2. 모든 수술 소모품 전에 수술로 멸균 처리 해야해, 우리가 필요한 모든 도구가 포함되어 있습니다 autoclaved 외과 팩을 사용합니다.
2. 수술 당일, 할런 스프 라그 - 돌리 쥐가 5 % isoflurane을 사용 anesthetized입니다 검이경을 사용 intubated, 다음 절차를 통해 isoflurane 2.5 %로 유지.
3. 건조하고 머리를 방지하기 위해 동물의 눈에 인공 눈물 연고를 추가합니다. 수술하는 동안 보습을위한 Lactated 링거스 솔루션 3 ML을 관리할 수 있습니다. 이것은 낮은 복부 지역에 피하 주사를 통해 수행되어야합니다.
4. 팔다리 아래 수술 테이블에 부드럽게 테이프에 위로 향한 위치에 동물을 배치합니다. 복부 사전 문질러에 진공 무료로 머리에 머리카락을 제거하는 면도기를 사용하십시오.
5. zyphoid 프로세스에서 복부의 하단 오른쪽에 대각선을 따라 2 % lidocaine 작은 주사 (약 50 μL 각)의 시리즈를 확인합니다. 그렇다면 중간에서 시작 밖으로 이동 betadine로 세 번 씻어. 70 % 에탄올로 반복합니다. 미리 만들어진 원형 창문 외과 드레이프를 사용하여 동물을 커버, 필요한 경우, 타월 클램프로 고정하십시오.
6. 번호 10 메스가 xyphoid 프로세스에서 복부의 하단 오른쪽에 3-4센티미터 절개를 사용합니다. xyphoid 프로세스를 찾아 오른쪽에있는 근육을 통해 수직으로 밑에 절개하다, 오른쪽에있는 큰 그릇을 피하기 위해주의하고. 일단 근육을 통해 해부 있고, 다이어프램을 노출, 근육을 통해 옆으로자를 가위를 사용합니다. 간장을 피하기 위해주의하십시오.
7. zyphoid 과정을 통해 3-0 Vicrile 봉합의 36 인치 길이 hemostats 한 켤레, 드라이브 바늘을 사용하고 중간을 통해 치료를 가져옵니다. 테이프가 함께 봉합의 종료와 기본적으로 zyphoid을 올려서 및 피임기구를 노출 위에 동물 뒤에 지점 것을 수정. 3-0 Vicrile 봉합사의 또 다른 36 인치 길이로 xyphoid 프로세스에 가장 가까운 근육을 통해 주사 바늘을 유도하고, 다시 완전히 수술 구멍을 노출, 수술 테이블의 오른쪽에있는 다른 지점으로 끝을 이겨낼 및 수정.
8. 이 시점에서, 당신은 횡경막을 통해 마음을 볼 수 있어야합니다. 쥐 치아 microforceps의 작은 쌍을 사용하면, 다이아 프램의 중심을 잡으면 당신을 향한 그것을 꺼내와 무딘 가위로 아주 작은 절개를합니다. 그것은 폐 파고 방지하기 위해 매우 무딘 가위를 사용하는 매우 중요합니다. 이 구멍이 만들어되면 폐 당신이 마음을 시각화하기 위해 횡경막을 통해 수직으로 2~3센티미터 절개를 만들 수 있도록 철회합니다.
9. 방식의 폐가를 밀어 구멍의 왼쪽에있는 3 인치 Q - 제보를 넣습니다. 장소에 면봉을 넣었을 확보하기 위해 타월 클램프를 사용합니다. pericardial 색을 찾을 수 있도록하는 방법의 우측 폐를 이동하는 다른 Q - 제보를 사용하십시오. microforceps 한 쌍의 대형 톱니 모양의 집게 한 쌍을 사용하여 심장의 꼭대기를 노출, pericardial 색을 통해 눈물. 동물이 이전에 경색의 절차를 거쳐이있다면, 심낭 이미 결석합니다.
10. 쥐의 치아 microforceps있는 마음의 꼭대기를 잡고 꼭대기에서 액체 매트릭스 소재 길을 3 분의 1까지 주입. epicardial 표면에 바늘 병렬를 삽입하고 왼쪽에있는 바늘의 beveled 가장자리로 주입. 위대한 심장 정맥을 방지해야합니다. 바늘을 제거하기 전에 몇 초 정도 기다리십시오. 당신이 주사의 사이트에있는 조직의 미백이 나타납니다.
11. 구멍에서 혈액을 정리하고 우측 폐를 들고 있던 수건 클램프 및 Q - 제보를 제거합니다. 곡선 microhemostats와 쥐를 사용하여치아가 횡경막을 닫습니다 microforceps. 초기 매듭을 확인 후 지속적인 치료와 테이퍼 바늘로 피임기구를 닫습니다 톱니 모양의 집게와 microhemostats을 사용합니다. 완전히 닫기 전에, PE160 흡입 튜브를 삽입하고 봉합이 강화므로 흉강을 철수 10 ML의 주사기를 사용합니다.
12. 적절하게 대피하고 폐쇄하면 횡경막이 오목해야합니다. 볼록 다이어프램은 캐비티에 아직 공기가 있음을 나타냅니다.
13. 이 시점에서 isoflurane는 1 %로 거절 수 있습니다.
14. 캐비티가 열려 들고 모두 3-0 Vicrile 봉합을 가져가라. Q - 팁 또는 멸균 거즈로 멀리 초과 닦아, 수화 근육에 멸균 물을 사용하십시오. 간헐 봉합과 근육 레이어를 닫습니다 3-0 봉합사의 새 길이를 사용합니다.
15. 이 시점에서, isoflurane을 해제할 수 있습니다.
16. 클린 무균 물과 피부를 닫습 사용 스테이플 공간. 스테이 플스가 공부를 방해한다면, 5-0 프롤린 봉합사도 사용할 수 있습니다. 이 경우, 간헐적인 봉합으로 피부를 닫습니다 반대로 절단 (RC) 바늘을 사용합니다. 두 경우 모두 폐쇄 절개를 통해 수술 접착제를 현장.
17. 트리플 항생제 연고와 절개 사이트를 적셔하는 Q - 팁을 사용하십시오.
18. 동물이 100 % 산소 아래에 복구할 수 있습니다.
19. 동물 환풍기 주변 호흡을 시작하면, 기관 튜브를 제거합니다.
20. 동물 흉골되면 0.05 MG / buprenorphine 하이드로 클로라이드의 kg의 피하 주사를 관리하고 살균 수건 그들의 홈 케이지에게 돌아갑니다.
21. 동물 사후 수술 관찰과 치료를 받게해야합니다.
22. 관심의 시간 지점에서, 동물은 euthanized되고 마음이 분석을 위해 삭제되었습니다. 짧은 축 크로스 섹션이 촬영되며 총 조직 분석을위한 hematoxylin 및 eosin (H & E) 물들일 수 있습니다. 짧은 시간 지점에서 주입 지역 interstitially 확산 가진 분홍색, 섬유 네트워크로 나타납니다. 나중에 시간이 지점에서, 하나는 세포의 유입과 2~3주 후 주입 모체의 최종 저하를 준수합니다. ECM을 주입하기 전에 비오틴로 표시된 경우, 그것은 HRP - 복합 streptavidin과 비오틴을 얼룩하여보다 직접적으로 시각하실 수 있습니다. Immunohistochemical 얼룩은 여기 슬라이드가 Alexafluor 보조와 내피 세포와 fluoresces 녹색 및 안티 - 부드러운 근육 굴지 항체에 바인딩 FITC - 복합 isolectin 공동 묻은 있었고, 사출 지역의 특정 셀 또는 구조를 식별하는 데 사용할 수 있습니다 빨간색으로 SMCs보고 항체.

4. 대표 결과

이런식으로 준비 매트릭스 재료의 이전 특성은 macromolecules의 다양한 유지 보여주었다. 특히, 여러 섬유 단백질과 glycoproteins은 질량 분석계 (표 1)를 통해 확인되었습니다. 이 프로토콜에 따라 처리 매트릭스 자료 macromolecules의 복잡한 배열을 포함하지 더 이상 찾을 수있다면, 그것은 고용 decellularization 프로토콜이 너무 거친 것을 수 있습니다. 일단 완전히 동결 건조된, 마른 pericardial ECM은 매우 뻣뻣한, 구겨진 종이처럼 보인다. 다른 조직 유형은 땅콩을 포장 유사합니다. 잘 가공된 경우, ECM은 체를 넘어 져야하고 하단에있는 항아리에 수집합니다. 수분 샘플 거기에 남아있다면, ECM 함께 덩어리를하고 밀링 챔버에 달라 붙 는게 좀 그렇지. 소화 후, ECM 솔루션은 밀키 보이는 색상과 입자의 완전히 자유로워 져야한다. 또한 HCL 혼자보다 약간 더 점성 것입니다. ECM이 잘 소화되지 않는 경우 여전히 병을 큰 입자가있을 것입니다, 또한, ECM은 솔루션의 밖으로 중단될 수 있습니다. 산도 조정 후,이 용액에 눈에 띄는 변화가없는, 그리고 ECM 아직​​도 흐림, 균질 액체이다. 그것이 젤 시작하면, 점도가 증가하고 이것은 주사기로 자료를 세우도록 어렵거나 불가 능할 것이다. 이런 문제가 발생하면, 미리 차게 솔루션으로, 얼음에 산도 조정 단계를 수행합니다. 주사가 준비되고 나면, 사용까지 얼음에 있습니다. 주입이 성공하면, 바늘 끝 주변 지역 whitens과 작은 볼러스가 표시됩니다. 이것이 관찰되지 않으면 주사는 챔버로 대신 벽에 갈 수 있습니다. 주사 후 동물을 suturing 때, 피임주의 폐쇄가 가장 중요한 단계입니다. 제대로하면, 횡경막은 폐에 대해 꽉되며, 오목 나타납니다. 폐 안에 남아있는 공기가있다면, 횡경막은 볼록 유지, 또는 밖으로 풍선 영역을 것입니다. 초기 시점 (4 시간 후 주사 30 분)에서 분사 지역의 조직학을 조사하면, 하나는 이것이 재조 립 매트릭스 재료 후 사출 (그림 2)입니다 세포를 찾아볼 수있는 핑크, 섬유 영역을 볼 수 . 네트워크는 종종 interstitially 펼쳐지는 많은 부분에 걸쳐 나타날 수 있습니다. 포스매트릭스 젤만이 매우 작은 영역을 보는 였는데 설명은 주사의 일부가 교내 목표를 놓치고 중 LV 챔버에 주입 또는 분사 위치를 밖으로 유출 되었기 때문입니다. 또한, 겔화 시간에 따라 중간 확산은 다를 수 있습니다.

그림 1. Polyacrylamide 젤 전기 영동 (PAGE) 결과입니다. (A) 분자 무게 기준. solubilized 인간 (C)와 돼지의 (D) pericardial ECM (7 MG / ML)에 비해 (B) 쥐 꼬리 콜라겐 유형 I (2.5 MG / ML). 콜라겐의 존재뿐만 아니라 다른 여러 가지 단백질과 pericardial 매트릭스 샘플에서 펩티드를 적어 둡니다.

표 1. ECM 구성 요소는 질량 분광로 확인.

그림 2 심근 주사 :. 생체내의 겔화 인치 H & E는 인간 (A)와 돼지의의 얼룩 (B) 45 분 후에 생체내에 gelled이 pericardial 매트릭스 주사. 화살표는 매트릭스 위치, myocardium보다 묻은 가벼운 핑크색을 나타냅니다. 스케일 바 500 μm의 수 있습니다.

그림 3. 혈관 세포 침투. 주입된 인​​간 (AC)과 이주에서 돼지의 (DF) 매트릭스 젤의 선박에 대한 형광 얼룩. 평활근 세포는 빨간색 (B, E)로 분류하는 동안 내피 세포, 그린 (A, D)로 분류됩니다. 병합된 이미지는 C로 표시되며 F. 스케일 바는 100 μm의집니다. 흰색 점선은 H & 인근 구역의 E 분석에 의해 결정 매트릭스 분사 영역을 나타냅니다.

그림 4. 매트릭스 사출 지역 내의 세포를 줄기. Hoescht는 핵에 대한 얼룩 (파란색)과 C - 키트 (녹색)은 (A) 인간과 돼지의 (B) 매트릭스 사출 지역에서 줄기 세포를 식별합니다. 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다.

토론

이 방법은 심근 조직 공학을위한 생물학 파생, 주사용 공사장 공중 발판의 생성을 허용합니다. 이 방법은 처음 제조를 위해 개발되었고 심근 매트릭스 젤 및 pericardial 매트릭스 젤과 함께 제시의 생체내 시험에서이 프로토콜은 다른 조직과 함께 사용하기 위해 적응 수 있지만, 조직이 적절하게 decellularized 수를 제공했습니다. Decellularization이 수행하고 매트릭스 젤의 DNA의 존재가 원치 않는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents:
Pepsin	Sigma-Aldrich	p6887-1G	Lyophilized
Biotin	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidin-HRP	Thomas Scientific	21130
Equipment:
Wiley Mini Mill	Thomas Scientific	3383L10
Labconco Lyophilizer	Labconco Corp.	7670520
Surgical supplies:
Betadine	Purdue Products L.P.	67618-154-16
Lactated Ringers Solution	MWI Veterinary Supply	003966
KY Jelly	MWI Veterinary Supply	28658
Lidocaine, 2%	MWI Veterinary Supply	17767
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Artificial tear ointment	Fisher Scientific	NC9860843
Triple antibiotic ointment	Fisher Scientific	19082795
Isoflurane	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
Otoscope	MWI Veterinary Supply	008699
Stop cock	MWI Veterinary Supply	006245
3-0 Vicrile suture	MWI Veterinary Supply	J327H
5-0 Proline suture	MWI Veterinary Supply	s-1173
Reverse cutting (RC) needle	Ethicon Inc.	8684G
Microhemostats	Fine Science Tools	13013-14
Rat tooth microforceps	Fine Science Tools	11084-07
No. 10 scalpel	Fine Science Tools	10110-01
Blunt scissors	Fine Science Tools	14108-09
Sharp, curved scissors	Fine Science Tools	14085-08
Large, serrated forceps	Fine Science Tools	1106-12
PE160 suction tubing	BD Biosciences	427430
Clippers	MWI Veterinary Supply	21608
Skin staples/stapler	Ethicon Inc.	PRR35
General supplies:
Stir plates
0.1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70% Ethanol
0.1 mL syringes
10 mL syringe
Q-tips
Surgical glue
Surgical drape
Towel clamps
Small hand-held vacuum