Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Özet

Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.

Özet

Biyolojik bir işlevi modüle etmek için kullanılan birçok ilaç ve diğer küçük moleküller bilayeri / çözüm arayüzü ve böylece adsorbe çift katlı lipid özelliklerini değiştirebilir amfifiler. Membran proteinlerin hidrofobik etkileşimler enerjik ev sahibi bilayeri birleştiğinde, çünkü bu önemlidir. Çift katlı özelliklerinde değişiklikler dolayısıyla protein fonksiyonu ve "off-hedef" ilaç etkileri için olası bir mekanizma modüle amfifiler için dolaylı bir yol sağlar membran protein fonksiyonu, değiştirirler. Daha önce ^3,12 probları gibi lineer gramicidin kanallarını kullanarak, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri saptamak için bir elektrofizyolojik tahlil geliştirdik . Gramicidin kanalları transbilayer dimerization iletken olmayan iki alt birimden oluşan mini-proteinleri. Onlar, çift katlı lipid özellikleri izleme değişiklikler için güçlü probları bilayeri kapsayan proteinler tarafından algılanan yapar membran çevre, değişimlere duyarlıdır. Şimdi probları aynı kanallarını kullanarak çift katlı özelliklerinde değişiklik tespit için bir floresan tahlil göstermektedir. Tahlil gramicidin kanallar aracılığıyla quencher giriş nedeniyle fluorofor yüklü büyük unilamellar veziküller floresan su verme zamanı ders ölçme dayanmaktadır. Biz floresan göstergesi / söndürücü çifti 8-aminonaphthalene-1 ,3,6-trisulfonate (KARINCALARIN) / Tl ⁺ diğer floresan su verme deneyleri ^5,13 başarıyla kullanılmaktadır. Tl ⁺ yavaş yavaş ⁸ çift katlı lipid nüfuz ama gramicidin kanallar ^1,14 yürütülmesi yoluyla kolayca geçer. Bu yöntem, mekanistik çalışmalar ve bilayeri rahatsızlık vermesini, ve potansiyel "off-hedef", efektler için küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için ölçeklenebilir ve uygun. Biz bu yöntemi kullanarak sonuçları önceki elektrofizyolojik sonuçları ¹² ile iyi bir anlaşma olduğunu bulabilirsiniz.

Protokol

1. KARINCALARIN-dolu Lipozomlar oluşturun

1. 1 gün, çözücü organik gelen lipidler çıkarın.
2. Lipid dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
3. 25 mg / ml 0,6 ml (1,2 dierucoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin), 25 ml yuvarlak alt balona kloroform çözüm lipid ekleyin.
4. Kloroform buharlaştırılır ve ince bir beyaz film lipid kat balonun tüm alt yarısı kadar, azot altında kurutma sırasında sürekli şişeyi döndürmek.
5. Kuru geceleme vakum altında bir Desikatörde.

1. 2 gün, veziküller hayata geçirilecektir fluorofor örnek hazırlamak.
2. 100 mM NaNO _3, 25 mM KARINCALARIN (Na tuzu), 10 mM HEPES rehidrate. HNO ₃ veya NaOH pH 7.0 'ye ayarlamak için kullanın. Her KARINCALARIN molekülü olmak üzere toplam 150 mM, 2 Na ⁺ [Na ^+]. 10 mM lipid süspansiyonu elde etmek için 1.671 mL elektrolit ekleyin.
3. Iyice Parafilm ve vorteks süspansiyon.
4. Folyo ile ışıktan örnek korumak ve gece boyunca oda sıcaklığında yaş sağlar.

1. 3. Gün, büyük unilamellar veziküller ve vezikül dışındaki tüm fluorofor kaldırmak.
2. 1 dakika için düşük güç sonikatör sonikasyon.
3. Donma-çözülme örnek 5-6 kez, 5 dakika ve 5 dakika ılık (~ 50 ° C) su ile kuru buz her zaman.
4. Bir Avanti mini-ekstruder kullanarak lipid süspansiyon Extrude. 0.1 mikron polikarbonat filtre ve filtre destekler (Detaylar için ekstruder manuel bakınız) ile mini-extruder ayarlayın. Süspansiyon ters şırınga biter gibi 21 kez ileri ve geri süspansiyon Extrude. Birden çok toplu uzatılır, her zaman aynı şırıngayı örnekleri yüklemek için hatırlıyorum. Ekstrüzyon sırasında bulutlu ilk lipid süspansiyon (hala KARINCALARIN fluorofor nedeniyle sarı olacaktır) neredeyse şeffaf olması gerektiğini. Ekstrüzyon aniden daha kolay olur ve daha az basınç, filtre ile hareket ettirmek için gerekli ise, filtre rüptüre olabilir ve değiştirilmesi gerekir.
5. Gravite protokolünü kullanarak bir PD-10 tuzsuzlaştırma sütun üzerinde ekstrüde süspansiyon çalışan dış KARINCALARIN çıkarın. 20-30 ml Na-tampon sütun dengelenmesi (140 mM NaNO _3, 10 mM HEPES, pH 7.0, HNO ₃ veya NaOH pH ayarlamak için kullanmayı unutmayın). 1.5 mL ekstrüde lipid süspansiyon sütun ekleyin ve 1 ml Na-tampon ekleyerek toplam hacmi 2.5 mL örnek getir içeri sızmasına izin verin. Tampon tam sütuna kurulmuştur ve hiçbir şey sızıntı sonra, Na-tampon 3 mL lipozomlar Zehir ve elde edilen numune toplamak. Dolu sonuçlanan KARINCALARIN stok solüsyonu 4-5 mM lipidler içerir ve saydam sütlü beyaz görünmesini LUV. Örnek folyo ile ışıktan koruyun.
6. 13 stok çözelti hemen kullanılmalıdır değilse, mağaza ° C 7 gün en fazla. Uyarı: dondurmak veya aşağıdaki lipid çözüm, sıvı kristal faz geçiş sıcaklığı (~ 12 ° C), bu veziküller bütünlüğünü yok edecek ve fluorofor sızıntı olarak serin.

2. Mix Floresan solüsyonu

1. 24 saat önce, lipozomlar sulandırmak ve gramicidin ile inkübe (13 ° C). Lipid veziküller 'iç ve dış mono tabakaları arasında gramicidin Denge, uzun bir inkübasyon gerektiren yavaş bir süreçtir.
2. Iyice vorteks luvs yoğunluğu> 1 g / mL stok çözelti LUV KARINCALARIN dolu ve bu nedenle tortu çözümler.
3. Mix KARINCALARIN dolu Na-tampon stok 01:20 LUV. Örnek bütünlüğü geliştirmek için tek bir cam şişe içinde birlikte deneyler bir gün kullanmak için tüm lipozomlar karıştırın.
4. Lipozomlar 3 / 4 ayrı ve 260 nM gramicidin DMSO önceden seyreltilmiş (500 mg / ml) ekleyin.
5. Için kalan 1 / 4, tüm örneklerde solvent konsantrasyonunu sabit tutmak için DMSO aynı hacimde (gramicidin olmadan) ekleyin.

3. Floresan Enstrüman ayarlama

1. Sıcaklık kontrolü ile floresan su verme hızını ölçmek için bir Uygulamalı Photophysics SX.20 durdu akış spectrofluorometer kullanın.
2. Aletleri, ısınma için izin bir saat önceden açın. Bileşenleri şunlardır: bilgisayar, elektronik kontrol ünitesi, su banyosu (soğutucu ve ısıtıcı), lamba güç kaynağı ve nitrojen tankı.
3. Pro-Data SX yazılımı kullanarak kayıt koşullarına kadar ayarlayın.
4. Uyarma 1 / 1 için monokromatör dalgaboyu 352 nm ve yarık genişliği diyafram ayarlayın.
5. Λ = 455 nm emisyon kaydetmek için high-pass filtre kullanın.
6. Kayıt sırasında azot basıncı korumak için araç sağlar ve böylece ilk birkaç milisaniye içinde basınç salınımları (kayıt eserler) önler "Basınç Tut" ayarı kullanın.
7. "Ti Setibana 5000 puan "1 s ve".
8. Tekrar kutusunu kullanın ve tekrar sayısını ayarlamak, normalde sırasıyla 9 ve 13 tampon ve söndürücü çalışır tekrarlar kullanmak.
9. Su banyosu sıcaklığı 25 ° C sıcaklık SX yazılım izlenmelidir.
10. , Her zaman enstrüman, bir örnek çalışır, her iki şırınga 60 mcL karışımları, yani 120 mcL sürücü birimini ayarlayın. Bu enstrümantal kurulumu ile, 120 mcL hacmi ≈ 1.2 ms ölü bir zaman verir.
11. KARINCALARIN-lipozom Kullanıcı çıkışı için 8 civarında floresan dedektör üzerinde yüksek gerilim (kazanç) ayarlayın. Deneysel standart bir karışım için kazanç 400-420 V. Bazı ilaçlar, floresan, floresan sinyal doyurabilecek böyle. Bu durumlarda, kazanç / gerilim azaltılmalıdır.
12. Her zaman doğru şırınga sol şırınga ve tampon / söndürücü floresan örnek yükleyin. Iyice vorteks emin olun yüklemeden önce tüm örnekleri içeren lipozomlar ve zaman ile luvs şırınga yerleşmek unutmayın.

4. Deneme yapmak

1. Ile birlikte Na-tampon veya Tl-quencher (50 mM, _TlNO 3 94 mM _NaNO 3, 10 mM, pH 7.0 Hepes) ya spectrofluorometer içine solvent veya bileşik ve yük ya KARINCALARIN yüklü luvs bir örnek hazırlayın.
2. 1,5 mL seyreltilmiş kullanın, ya da gramicidin olmadan, çözüm KARINCALARIN-LUV önceki gün hazırladı.
3. Istenilen konsantrasyonda bileşik veya kontrolleri için çözücü ekleyin. Solvent konsantrasyonu, tüm örnekleri arasında en az ve sabit tutun. Konsantrasyonları istenilen doz-yanıt aralığı elde etmek için herhangi bir yeni (bilinmeyen) bileşik ile ayarlanması gerekir. 10 dakika 25 ° C'de karanlıkta.
4. Vortex örnek LUV ve sol şırınganın içine yüklemek. Na-tampon veya Tl-quencher doğru şırınga içine yükleyin.
5. Şırıngalar ve ileri geri iterek iyice Her iki örnekte hava kabarcıkları.
6. Vanaları kapatmadan önce her iki şırınga eşit yüklendiğinden emin olun. Kayıt odasına ulaşmadan önce Eşitsiz yükleme çözümleri ön karıştırma neden olacaktır.
7. İlk örnek için, Na-tampon ile floresan kayıt 4 kez tekrarlayın, gerektiği gibi yüksek gerilim (kazanç), ve 5 kez tekrarlayın.
8. Na-tamponu ile kalan örnekleri, kayıt 9 tekrarlar.
9. Na-tampon Tl giderici ve kayıt 13 tekrarlar ile değiştirin.
10. Su ile durulayın ve bir sonraki örneği ile devam edin. Solvent ile hiçbir gramicidin ve maksimum bileşik konsantrasyonu ile gramicidin ve gramicidin ve solvent hem biz örnekleri kullanmak kontrolleri gibi.

5. Analiz Veri

1. Sonuçları analiz bilgisayara aktarın. MATLAB tüm verileri analiz etmek için okuyun. Her bir örnek için, bu karıştırma eserler içeren her durumda ilk dört hariç tüm tampon ve söndürücü tekrarlar okuyun. Önceki karışım tamamen durdu akış boru temizlemek için biraz daha az dört görüntüleri alır bir sürücü hacmi 120 mcL varsayarsak.
2. Tüm numuneler için tampon tekrarlar çok benzer olmalıdır. Floresan sinyali, bileşik konsantrasyonuna bağlı olarak belirgin bir değişim varsa, o zaman bileşik kendisi floresan olabilir ve bu ekstra floresan sinyal ilk örnekleri normalleştirilmesi önce çıkarmak için gerekli olabilir.
3. Elle izlerini üzerinden gitmek ve "kötü" tekrarlar kaldırmak: karıştırma eser ve / veya kabarcıklar nedeniyle multi-exponentiality, ani ya da sapmalar içeren tekrarlar.
4. Normale söndürücü tekrarlar, her örnek için tampon tekrarlar ortalama başlangıç ​​değeri. Bir grafik görüntüleme için tüm örnekler ortalamalara birleştirin.
5. İzleri yok gramicidin kaydedilen tüm benzer olması ve neredeyse hiç floresan su verme; Tl, kaçak yavaş ⁺ vezikül çift katlı 8 ile floresan sinyal nedeniyle yavaş bir azalma olabilir. Önemli su verme hiçbir gramicidin ve hiçbir değiştirici ile örnek gösterir, sonra veziküller bozulmuştur ve daha fazla kullanılmamalıdır. Hiçbir gramicidin ama değiştirici ile numunelerin önemli su verme göstermesi durumunda, o değiştirici veziküller bilayeri fluorofor veya söndürücü bilayeri çapraz olanak veren böyle bir ölçüde bozulacaktır.
6. Bileşik çift katlı lipid özelliklerini değiştirir, gramicidin kanallar tarafından algılanan, floresan süre içerisinde gözle görülür bir şekilde değişmiş olacak.
7. Her örnek için, gergin bir üstel örneğin ⁴⁾ bireysel tekrarlar normalize floresan su verme eğrisinin ilk 2-100 ms ve hızı için uygun olup ⁴2 ms olarak hesaplanmıştır. Verilen bir örnek için tüm bireysel tekrarlar ortalamaları ve standart sapmaları hesaplanır.
8. Son olarak, göreceli değişim gramicidin ve değiştirici yoktur en yakın zamanda kontrol örneği normalleştirilmesi quench oranı belirler.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1: floresan quench tabanlı testin şartları çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri belirlemek için sol Top: Bir zoom-in iç ve dış NaNO ₃ artı TlNO ₃ artı NaNO ₃ KARINCALARIN tek bir lipid vezikül. Sağ üst: söndürücü ve 87, 260 ve 780 nM gramicidin önceden katkılı, içki, içki olmadan (yukarıdan aşağıya) KARINCALARIN dolu veziküller kullanarak kaydedilen floresan sinyali. Alt: durdu akış karıştırma haznesinin şematik.

Şekil 2: deney düzeneği açıklama başvurulan çeşitli paneller gösteren Pro-Veri SX yazılımı çekilen bir ekran.

Şekil 3: Na-tampon ile KARINCALARIN yüklü luvs floresan sinyal birden fazla tekrar tespitler karıştırma eserler içeren ilk dört tekrarlar her zaman dışlanır . Karıştırma hücre örnek şırınga bağlayan boru belirli bir hacmi var, bu nedenle ilk birkaç tekrarlar önce tüpün içinde ne olduğunu bize bir okuma verecektir: su tekrar 1 ve 2, 3 için tekrar su ve örnek bazı kombinasyonu kalan tekrarlar için tekrar 4, ve sadece bir örnek daha çok örnek.

Şekil 4: Na-tampon ve Tl-quencher KARINCALARIN yüklü luvs floresan sinyal Çoklu tekrar tespitler ilk dört tekrarlar, her iki şart da kaldırıldı . Ayrıca, Tl-söndürücü ölçümler için, eserler, büyük olasılıkla hava kabarcıkları nedeniyle kaldırılacak 8 ihtiyaçlarını tekrarlayın.

Şekil 5: KARINCALARIN floresan su verme zamanı ders kapsaisin Etkisi (Cap) (A) 1 bitti Normalize floresan sinyal, gri noktalar tüm tekrarlar (n> 5 durum başına) sonuçlarını gösterir; kırmızı çizgiler ortalama ifade tekrarlar. (B) ilk 100 ms, gri noktalar, her durum için tek bir tekrar sonuçları ifade etmektedir; kırmızı çizgiler üstel uyan (2 - 100 ms) gerilir bu tekrarlar. Kesikli mavi çizgi, 2 ms işareti, su verme oranı belirlenen süreyi ifade eder. A ve B üst iz Tl yokluğunda sonuçlarını gösterir ^+; sonraki iki izleri Tl, gA yokluğunda sonuçları ⁺ ± kap, dört alt izleri 260 nM gA ve Tl ^+, nerede sonuçları numaraları mcM [kap] ifade etmektedir. Gerilmiş üstel oranı tarafından belirlenir 0, 10, 30 ve 90 mcM kap, su verme oranları 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 ve 247 ± 27 (ortalama ± SD, n> 8) sırasıyla.

Tartışmalar

Biz, ilaç ve diğer küçük amfifiler bilayeri değiştirme potansiyeli belirlemek için hızlı bir floresan bazlı analiz göstermiştir. Bilayeri özelliklerini değiştirmek Bileşikler nonspesifik dolaylı bir şekilde membran protein işlevini değiştirmek için, muhtemelen "off-hedef" ilaç etkileri katkıda muhtemeldir. Bilayeri kapsayan proteinler tarafından algılanan çift katlı özelliklerinde değişiklik ¹² probları olarak tahlil gramicidin kanalları güç patlatır. Floresans t...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicidin	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
Mini-Extruder kit	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
PD-10 Desalting column	Sigma-Aldrich	54805