Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

Özet

Bu video, Nijole Jasinskiene Dang humması için vektörler transgenik Aedes aegypti sivrisinek, üretmek için kullanılan yöntem gösteriyor. Doğru, mikroenjeksiyon iğneler hazırlanması embriyolar dessicating ve mikroenjeksiyon teknikleri gösterilmektedir.

Özet

Bu video, Nijole Jasinskiene Dang humması için vektörler transgenik Aedes aegypti sivrisinek, üretmek için kullanılan yöntem gösteriyor. Doğru, mikroenjeksiyon iğneler hazırlanması embriyolar dessicating ve mikroenjeksiyon teknikleri gösterilmektedir.

Protokol

Mikroenjeksiyon, önceden hazırlık

1. Kan linki sivrisinek: Pazartesi, önceki Perşembe günü Cuma linki kadın enjeksiyon için.
2. Programı 3 veya 2 (Malzeme) cam iğneler kullanarak hazırlayın.
3. Embriyoları için tüp Döşeme Drosophila kültür flakon. Kapsayan filtre kağıdı ıslak bir disk ile alt Islak pamuk.
4. Bir ucunda çift taraflı bant yapıştırma, plastik kapak kayma hazırlayın. Trim kaset kapağı için, kapak kayma kenarında biter, böylece kayma.
5. Kuruma petrol hazırlayın (Malzeme)
6. Enjeksiyondan sonra embriyolar tutmak, ıslak filtre kağıdı (80mm whatman) disk ile kaplı altındaki ıslak pamuk, 150 ml plastik beher.

Zorla döşeme ayarlayın

1. Bir aspiratör kullanımı ile 6-10 kan beslenen kadınlarda toplayın ve ıslak pamuk ve filtre kağıdı ile Drosophila kültür flakon aktarabilirsiniz.
2. Karanlıkta insectory koşullar sivrisinek koyun ve 1s 15dk için yumurtalarını bırakmak için izin verir.
3. Yetişkin kafes içine sinek ve embriyolar ile filtre kağıdı diski çıkarın.
4. Diseksiyon kapsamı altında, yumurta yapmak sıraya için. Ince forseps No 5 ya da ince bir fırça kullanarak, gri-koyu renkli embriyolar gri almak ve su ile ıslatılmış 3MM whatman kağıt kare doğrultusunda düzenlemek. Enjeksiyon arka kutupta yer gibi, tüm embriyolar, aynı yönde olmalıdır. Embriyo anterior posterior biraz daha geniş. (Islak şeyler teybe girmiyor) kuru filtre kağıdı basarak embriyolar ile filtre kağıdı kurulayın. Yumurta transferi çift taraflı bant içeren slayt ters yumurta karşı hafifçe bastırın. Yumurta arka ucunda çift taraflı bant kenarına çok yakın olması.
5. 1 dakika hakkında embriyolar ile kurutun. oda sıcaklığında. Onlar kuru biraz Köşelerini başlar.
6. Kurutulmuş embriyolar daha fazla kuruma önlemek için Halokarbon yağ ile kaplayın.

Embriyolar, Mikroenjeksiyon

1. En önemli özelliği iyi bir enjeksiyon (Malzeme) iğne kalitesidir.
2. Bir iğne, bir Microloader kullanılarak enjekte edilir DNA solüsyonu ile doldurun. Çok az enjeksiyon çözüme ihtiyaç vardır: 1 - 2 ul.
3. Iğne, enjeksiyon süresi (Manu) ve basınç (600) kontrol Transjector, backpressure (250) bağlayın. Mikroenjeksiyon x 10 büyütme ve mikromanipülatör hareketli bir sahne (Leica) bir mikroskop kullanılarak yapılır. Gerekirse, yükseltilmiş mikroskop aşamada 4-5 mikroskop lamı istifleme hazırlamak olabilir. Yükseltilmiş sahneye taşıyan embriyolar kapak kayma yerleştirin. Endochorion yırtılmasını önlemek için yatay embriyolar enjekte edilir; penetrasyon arka kutupta yer almalıdır. Enjeksiyon için iğne sabit tutmak ve mikroskop aşamasına taşımak.
4. Embriyo hacminin yaklaşık% 1-5 karşılık gelen bir çözüm, 0.2-0.5 nl enjekte edilir. , Enjeksiyon basıncı ve saatini ayarlayarak enjeksiyon hacmi kontrol edin. Hafifçe eğdi, kurutulmuş embriyolar şiş görünümü aşağıdaki enjeksiyon yeniden gerekir.
5. Ince forseps veya ince bir fırça kullanarak kapağı kayma embriyolar Pick ve ıslak pamuk ve ıslak filtre kağıdı ile plastik bir beher koyun. Beher kağıt mendil ile örtün. Çevresinde elastik bant ile bir yerde tutun ve 4 gün boyunca insectary koşullar dönmek.

Enjeksiyon sonrası

1. Dört gün sonra, büyük plastik kutu yiyecek küçük bir miktar su dikkatle embriyo kağıt, aşağı embriyo tarafı,. Embriyolar çok uzun bir süre içinde yumurtadan çıkar: enjeksiyon sonrası en az 4-5 hafta kadar kültür dışarı atmayın.

Notlar

Enjeksiyon için DNA

Enjeksiyon için Plazmid DNA çözüm EndoFree plazmid kiti kullanılarak izole edilmiştir. Construct ve doğru konsantrasyon birlikte Yardımcısı plazmid karışımı, izopropanol hızlandırdı. Pelet enjeksiyon tampon resuspending önce% 70 etanol ile yıkandı. Enjeksiyon, önce Millex-GV sütun kullanarak temiz DNA.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape