Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

Resumo

Neste vídeo, Nijole Jasinskiene demonstra a metodologia utilizada para gerar transgênicos mosquitos Aedes aegypti, que são vetores da dengue. As técnicas para preparar corretamente agulhas microinjeção, os embriões desidratantes, e realizando microinjeção são demonstradas.

Resumo

Neste vídeo, Nijole Jasinskiene demonstra a metodologia utilizada para gerar transgênicos mosquitos Aedes aegypti, que são vetores da dengue. As técnicas para preparar corretamente agulhas microinjeção, os embriões desidratantes, e realizando microinjeção são demonstradas.

Protocolo

Preparação antes da microinjeção

1. Mosquitos alimentam de sangue: para injeção de segunda a sexta-feira fêmeas alimentam na quinta-feira anterior.
2. Prepare agulhas de vidro usando o programa de 3 ou 2 (ver Materiais).
3. Deitado de tubos para os embriões é Drosophila frasco de cultura. Algodão molhado no fundo, com um disco de papel de filtro molhado cobrindo-o.
4. Prepare lamínula de plástico furando a fita dupla face a um fim. Fita guarnição para cobrir deslizamento de modo que termina na borda da lamínula.
5. Prepare óleo para dessecação (veja Materiais)
6. 150 ml copo de plástico com um algodão molhado no fundo, coberta com um disco de papel de filtro molhado (80mm Whatman) para manter os embriões após a injeção.

Criação de imposição forçada

1. Coletar sangue 10/06 fêmeas alimentados com o uso de um aspirador e transferi-los para o frasco de cultura Drosophila, com algodão úmido e papel de filtro.
2. Coloque os mosquitos de volta para as condições insectory no escuro, e permitir a pôr ovos por 1h e 15min.
3. Vamos voar adultos na gaiola e retire o disco de papel filtro com embriões.
4. Para alinhar os ovos, fazê-lo sob margem de dissecação. Utilizando uma pinça fina No. 5 ou um pincel fino, pick cinza para cinza-escuras embriões e organizar em linha no quadrado de papel Whatman 3MM encharcado com água. Todos os embriões devem estar na mesma orientação, como a injeção tem que ser no pólo posterior. A extremidade anterior do embrião é ligeiramente mais largo que o posterior. Seque o papel de filtro com embriões pressionando papel de filtro seco para ele (coisas molhadas não vai ficar com fita). Para transferir os ovos, inverter o slide que contém a fita dupla face e pressione suavemente contra os ovos. A extremidade posterior dos ovos tem que ser muito perto da borda da fita dupla face.
5. Desidratar os embriões cerca de 1 min. à temperatura ambiente. Eles começam a ondulação ligeiramente à medida que seca.
6. Cobrir com óleo de embriões dessecados halocarbono prevenir o dessecamento mais.

Microinjeção de embriões

1. O aspecto mais importante da injeção de bom é a qualidade da agulha (ver Materiais).
2. Preencher uma agulha com a solução de DNA a ser injetado através de um microloader. Muito solução injectável pouco é necessário: 1 a 2 l.
3. Conecte a agulha para a Transjector, que controla o tempo de injeção (Manu) e pressão (600), ea contrapressão (250). Microinjeção é realizada utilizando um microscópio com um palco em movimento (Leica) na ampliação x 10 e micromanipulador. Se necessário, um estágio do microscópio pode ser levantada pelo empilhamento preparar lâminas de microscópio 4-5. Coloque a lamínula carregando os embriões em estágio elevado. Injetar embriões na horizontal para evitar rompimento do endochorion; penetração deve ser no pólo posterior. Injectável, eu continuo a agulha estacionário e move o estágio do microscópio.
4. Injetar 0,2-0,5 nl de solução, correspondente a cerca de 1-5% do volume do embrião. Controlar o volume de injeção, ajustando a pressão de injeção e do tempo. O ligeiramente inclinada, embriões dessecados devem recuperar a sua injeção seguintes turgid aparência.
5. Escolha embriões a partir da lamínula usando uma pinça fina ou um pincel fino, e colocá-los num copo de plástico com algodão úmido e papel de filtro molhado. Cobrir copo com papel de seda. Mantenha em local com faixa elástica ao redor da borda e retorno às condições de insetário por 4 dias.

Pós-injeção

1. Quatro dias depois, cuidadosamente papel embrião lugar, embrião voltada para baixo, sobre a água em caixa de plástico grande com uma pequena quantidade de alimentos. Embriões eclodem em um período muito longo: não jogar fora a cultura até, pelo menos, 4-5 semanas após a injecção.

Notas

DNA para injecção

Solução de DNA plasmidial para injeção foi isolado utilizando kit plasmídeo EndoFree. Construir e mix Helper plasmídeo juntos na concentração correta, precipitado com izopropanol. O pellet foi lavado com etanol 70% antes de ressuspender em tampão de injeção. Antes da injeção, usando DNA limpa Millex-GV coluna.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape