Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

Riepilogo

In questo video, Nijole Jasinskiene dimostra la metodologia utilizzata per generare transgenici zanzare Aedes aegypti, che sono vettori per la febbre dengue. Le tecniche per la corretta preparazione di aghi microiniezione, disidratanti embrioni, e l'esecuzione di microiniezione sono dimostrati.

Abstract

In questo video, Nijole Jasinskiene dimostra la metodologia utilizzata per generare transgenici zanzare Aedes aegypti, che sono vettori per la febbre dengue. Le tecniche per la corretta preparazione di aghi microiniezione, disidratanti embrioni, e l'esecuzione di microiniezione sono dimostrati.

Protocollo

Preparazione in anticipo di microiniezione

1. Zanzare alimentazione del sangue: per iniezione da Lunedi a Venerdì femmine alimentare sul precedente Giovedi.
2. Preparare gli aghi di vetro utilizzando il programma di 3 o 2 (vedi Materiali).
3. Posa tubo per gli embrioni è fiala cultura Drosophila. Cotone idrofilo bagnato in fondo, con un disco di carta da filtro umida che lo ricopre.
4. Preparare antiscivolo in plastica di copertura da attaccare a doppio lato del nastro ad una estremità. Tagliare il nastro per coprire scivolare in modo che termina al bordo del vetrino.
5. Preparare l'olio per essiccazione (vedi Materiali)
6. Becher di 150 ml di plastica con un batuffolo di cotone umido nella parte inferiore, coperto con un disco di carta da filtro umida (80mm Whatman) per mantenere gli embrioni dopo l'iniezione.

Messa a punto di posa forzata

1. Raccogliere 6-10 sangue femmine alimentate con l'uso di un aspiratore e di trasferirli al flaconcino cultura Drosophila con cotone umido e carta da filtro.
2. Mettere le zanzare nuovamente dentro condizioni insectory al buio, e permettono di deporre le uova per 1h e 15min.
3. Lasciate che gli adulti volare nella gabbia e rimuovere il disco filtro di carta con gli embrioni.
4. Per allineare le uova, lo fanno in ambito dissezione. Utilizzando una pinza sottile n. 5 o un pennello fine, scegliere grigio al grigio-scure embrioni e sistemateli in linea su piazza di carta Whatman 3MM inzuppato d'acqua. Tutti gli embrioni devono essere con lo stesso orientamento, in quanto l'iniezione deve essere al polo posteriore. L'estremità anteriore dell'embrione è leggermente più larga della posteriore. Asciugare la carta da filtro con gli embrioni da pressatura a secco carta da filtro ad esso (le cose bagnate non si atterrà a nastro). Per trasferire le uova, invertire la diapositiva che contiene il nastro biadesivo e premere delicatamente contro le uova. L'estremità posteriore delle uova devono essere molto vicino al bordo del nastro biadesivo.
5. Essiccare gli embrioni di circa 1 min. a temperatura ambiente. Cominciano a fossetta un po 'come si asciugano.
6. Coprire embrioni essiccati con olio Halocarbon per prevenire l'essiccamento ulteriormente.

Microiniezione degli embrioni

1. L'aspetto più importante di iniezione buona è la qualità dell'ago (vedi Materiali).
2. Riempire un ago con la soluzione di DNA da iniettare utilizzando un microloader. Molto soluzione iniettabile poco è necessario: 1 a 2 microlitri.
3. Collegare l'ago al Transjector, che controlla il tempo di iniezione (Manu) e pressione (600), e la contropressione (250). Microiniezione viene eseguita utilizzando un microscopio con un palco in movimento (Leica) in x 10 ingrandimenti e micromanipolatore. Se necessario, una fase microscopio può essere sollevato preparare impilando vetrini da microscopio 4-5. Posizionare il vetrino porta la embrioni sul palco rialzato. Iniettare embrioni orizzontalmente per evitare la lacerazione dei endochorion; penetrazione dovrebbe essere al polo posteriore. Per l'iniezione, tengo l'ago fermo e spostare lo stadio del microscopio.
4. Iniettare 0,2-0,5 nl di soluzione, corrispondenti a circa il 1-5% del volume dell'embrione. Controllare il volume di iniezione regolando la pressione di iniezione e il tempo. La leggermente piegato, gli embrioni essiccato dovrebbero riprendere la turgida dopo l'iniezione aspetto.
5. Scegliere gli embrioni dal vetrino con una pinza sottile o un pennello fine, e metterli in un bicchiere di plastica con cotone umido e bagnato carta da filtro. Coprire bicchiere con la carta velina. Conservare in luogo con elastico intorno al cerchio e ritorno a condizioni insectary per 4 giorni.

Post-iniezione

1. Quattro giorni dopo, con attenzione embrione di carta posto, embrione rivolto verso il basso, l'acqua nella grande scatola di plastica con una piccola quantità di cibo. Gli embrioni schiudono in un periodo molto lungo: non buttare via la cultura fino ad almeno 4-5 settimane dopo l'iniezione.

Note

DNA per l'iniezione

Soluzione iniettabile DNA plasmidico è stato isolato utilizzando EndoFree kit plasmide. Costruire e mescolare Helper plasmide insieme in giusta concentrazione, precipitato con izopropanol. Il pellet è stato lavato con etanolo al 70% prima di risospendere nel buffer di iniezione. Prima dell'iniezione, il DNA pulito utilizzando Millex-GV colonna.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape