Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Özet

Bu video protokolü yetişkin fare periventriküler bölge nöral kök hücreler oluşturmak ve genişletmek için neurosphere assay yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar.

Özet

Yetişkin fare beyin varsayılan sinir kök hücrelerinin (NSC'lerde) izolasyonu ve genişleme ilk neurosphere assay (NSA) olarak bilinen kimyasal olarak tanımlanmış serum serbest kültür sistemi istihdam Reynolds ve Weiss tarafından 1992 yılında tarif edilmiştir. Bu testte, farklılaşmış hücre tiplerinin çoğunluğu kültür birkaç gün içinde ölürler ama küçük bir nüfus büyüme faktörü duyarlı öncü hücreler aktif proliferasyonu epidermal büyüme faktörü (EGF) ve / temel fibroblastik büyüme faktörü (bFGF) varlığında tabi. Bu hücreler nöral kök hücre havuzu genişletmek için pasajlandı olabilir neurospheres adlı farklılaşmamış hücreler, koloniler oluşturur. Ayrıca, hücrelerin, merkezi sinir sistemi, yani nöronlar, astrositler ve oligodendrosit üç ana hücre tipleri üreten ayırt etmek için uyarılan olabilir. Bu testte, in vitro çalışmalar ve aynı zamanda tedavi amaçlı kullanılan olabilir farklılaşmamış MSS öncüleri, tutarlı bir, yenilenebilir kaynak sağlamak için paha biçilmez bir araç sağlar .

Bu video NSC'lerde yetişkin fare periventriküler bölge oluşturmak ve genişletmek için NSA yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar. Bu prosedür, NSA yetişkin fare, periventriküler bölgede mikro diseksiyon, doku hazırlanması ve kültür beyin hasat içerir. Hasat doku ilk kez tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve nihayet NSA kaplama kimyasal MGK orta tripsin-EDTA ve daha sonra mekanik olarak ayrışmış kullanılarak sindirilir. Kültür 7-10 gün sonra ortaya çıkan birincil neurospheres altkültürün gelecek deneyler için gerekli olan hücrelerin miktarı ulaşmak için hazırız.

Protokol

Bölüm 1: Temel diseksiyon geçmeden önce kurmak:

1. Uygun tam MGK orta hacmi, 09:01 oranında NeuroCult MGK Bazal Orta ve NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler sırasıyla karıştırılarak hazırlanır. MGK orta literatürde yayınlanan MGK besi kompozisyonu dayalı laboratuar yapılabilir ¹. Laboratuvar orta yapmak çok deneyim yoksa, piyasada bulunan orta kalitesi (NeuroCult durumunda, Kök Hücre teknolojileri olan) satılmaktadır NSC'lerde büyüme için önce kontrol edilmiştir kullanmanızı öneririz.
2. Orta, 37 ° C su banyosunda kadar ısıtılır.
Soğuk Hepes-tamponlu asgari temel orta (HEM), diseksiyon ve yıkama amacı için hazırlanmıştır. Alternatif olarak, antibiyotik takviyesi ile MGK bazal orta de bu amaç için kullanılan olabilir. 30-40 ml beyin toplama için steril 50 ml tüpler içine sürülür.
3. Birkaç 10cm plastik Petri yemekler sırasında beyinleri diseksiyon ve disseke doku tutmak için bir 10cm steril cam petri kabı tutmak için ihtiyaç vardır.
4. Beyin (büyük makası, küçük sivri makas, büyük forseps, küçük kavisli bir forseps, ve küçük bir spatula) veya doku diseksiyonu (küçük forseps, kıvrımlı ince forseps, neşter) kaldırmak için gerekli cerrahi aletler, cam boncuk sterilizatör kullanılarak sterilize edilir 250 ° C veya diğer mevcut otoklav yöntemleri.
5. Diseksiyon mikroskobu,% 70 alkol ile sildi ve PC2 kaput içinde kurulur.

Bölüm 2: Hasat yetişkin fare beyin ve mikro diseksiyon:

1. 2-4 yetişkin (5-8 haftalık) farelerde% 3-4 izofluran veya pentobarbital-periton içi enjeksiyon yoluyla kullanarak bir kurumsal onaylanmış hayvan protokolü göre anestezi (120 mg / kg).
2. Servikal dislokasyon hayvanın acı ve sıkıntı zarar vermez emin olmak için yapılır.
3. Anestezi fare karnı emici bir kağıt mendil serilir ve kafa alan sterilize etmek için% 70 etanol ile durulanır.
4. Büyük makas sadece servikal spinal kord bölgenin üstüne hayvan başını kesmek için kullanılır.
5. Küçük sivri makas medyan rostral kaudal-kesme yapmak ve kafatası açığa çıkarmak için kullanılır.
6. Foramen magnum bir giriş noktası olarak kullanarak, uzunlamasına kesilmiş sagital sütür boyunca kafatası yoluyla yapılır ve iki yan keser, yan duvarları kavşak ve kafatası tabanında yapılır. Dikkat, küçük kesikler ve bıçakların açısı sağlayarak, mümkün olduğunca sığ altta yatan bir beyin hasarı alınmalıdır.
7. Her yarımkürede üzerinde kafatası kavradı ve daha sonra küçük bir ıslak spatula kullanarak, beynin maruz kavisli bir forseps kullanarak dışa soyulmuş, beyin HEM içeren 50 ml'lik tüp içine topladım.
8. Bu tüm beyinlerin hasat edilene kadar işlem tekrarlanır.
9. Beyinleri PC2 kaput aktarılır ve soğuk steril HEM kan ve saç gibi olası kirleri çıkarmak için yeterli hacmi ile üç kez yıkanır. Beyinleri daha sonra HEM içeren bir 10cm Petri kabı aktarılır.
10. Önbeyin periventriküler bölge disseke için, beyinlerini içeren çanak düşük büyütme diseksiyon mikroskobu altında yerleştirilir. Beyinleri sonra kendi ventral yüzeyinde düz yerleştirilmiş ve ince kavisli bir forseps kullanarak kaudal tarafında düzenlenen. Kavisli bir forseps başka bir koku ampuller kaldırmak için kullanılır.
11. Koku ampuller çıkarıldıktan sonra, beyinleri ventral yönünü ortaya çıkarmak için döndürülür.
12. 90 ° koronal kesme optik kiazma düzeyinde yapılır ve beyinleri kaudal yönlerini atılır.
13. Bu tüm beyinleri kesitli kadar işlem tekrarlanır.
14. Yüksek büyütme, beyinlerinin rostral yönlerini döndürülmüş olan kesim yüzeyi yukarı bakacak şekilde. İlk olarak, septum kaldırılır ve striatal parankimi ve korpus kallosum hariç, ince bir kavisli mikro-makas ya da eğri, sivri forseps ve sonra ventrikül lateral duvar çevreleyen doku ince bir tabaka kesilir kullanarak atılır. Disseke doku 10cm steril cam petri kabı toplanmış.
15. Bu tüm beyinleri mikro-disseke kadar işlem tekrarlanır.

Bölüm 3: Doku hazırlama ve kaplama hücreleri:

toplanmış doku, bir neşter bıçak kullanarak yaklaşık 1-2 dakika kıyılmış.
1. Toplam hacmi 3 ml% 0.05 tripsin-EDTA kullanılır ve kıyılmış doku, 15 ml'lik bir tüp içine aktarılır. 3ml tripsin-EDTA 8 farelere kadar hasat dokuların iyi bir sindirim için yeterli olacaktır.
2. Tüp 7 dakika süreyle 37 ° C'lik su banyosunda inkübe edilir.
3. Enzimatik inkübasyon sonunda tüp kaput döndürülür ve soya tripsin inhibitörü eşit miktarda tripsin faaliyeti durdurmak için eklendi.
4. Süspansiyon pipetlenir ve tripsin inaktivasyon sağlamak için ve 5min için 700 rpm (110 g) santrifüj sonra pelet.
5. Süpernatant atılır ve doku parçaları steril MGK bazal orta 150 ul yeniden süspanse. 200 ul pipet sıfırlanması, yığınları hafifçe yumuşak bir sütlü tek hücre süspansiyonu elde edilene kadar (3-7 kez) aşağı yukarı pipetleme ve ayrı. Pippetting adımların sayısını doğrudan kıyılmış doku (tripsin aktivitesi için yüzey alanını artırmak için, doku o kadar çok küçük parçalar halinde kıyma iyidir) parçacıkların büyüklüğüne bağlıdır. Uzun ve güçlü mekanik ayrılma nöral kök ve progenitör hücre ölümü nedeniyle azaltılmış kürenin oluşumuna yol açabilir.
6. Enkazını ve un-ayrışmış parçalarını kaldırmak için, bazal MGK orta toplam hacmi 10-15ml ulaşmak için ayrışmış hücre süspansiyonu eklenir. Hücre süspansiyonu uygun bir boyut tüpe 40μm hücre süzgecinden geçirilir ve sonra 5min 700 rpm (110 g) santrifüj pelet.
7. Daha enkaz kaldırmak için, MGK orta 10-15 ml pelet tekrar süspansiyon ve 5min 700 rpm (110 g) hücre süspansiyonu santrifüj tavsiye edilir.
8. Süpernatant atılır. Ardından hücreler tam MGK orta,% 0.2 heparin 20ng/ml EGF, 10 ng bFGF ve 1μl/ml ile desteklenen uygun hacmi yeniden süspanse.
9. Grubuyla bir beyin dokusunun bir T25 balonuna (5 ml tam orta içeren) konur. Hücreler daha sonra, 37 ° C'de% 5 CO inkübe ₂ 7-10 gün için zaman neurospheres oluşmuş olmalıdır. Doku bir beyinden gelen hasat genellikle 400-600 neurospheres üretebilirsiniz.

Bölüm 4: NSC'lerde Pasajlanması ve genişleme:

1. Neurospheres altkültürü (150-200 mikron çapında) için hazır olduğunuzda, askıya küreler ile orta, şişeler kaldırılır uygun bir boyut steril doku kültürü tüp yerleştirilir ve 5 dakika süreyle 700 rpm (110 g) santrifüje oda sıcaklığında.
2. Süpernatant atılır ve küreler 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA yeniden süspanse. Alternatif olarak, neurospheres de, mekanik veya kimyasal disosiasyon yöntemler kullanılarak geçişli olabilir literatürde ^2,3.
3. Hücre süspansiyonu 37 inkübe ° C soya tripsin inhibitörü eşit miktarda tripsin faaliyeti durdurmak için kullanılır, sonra 2-3 dakika, bir su banyosu.
4. Hücre süspansiyonu tripsin tamamen inaktive olduğundan emin olmak için hafifçe aşağı yukarı pipetlenir ve.
5. Hücre süspansiyonu, 5 dakika boyunca 700 rpm'de santrifüj edilir. Sonra, süpernatantı kaldırılır ve hücrelerin MGK orta 1 ml yeniden süspanse.
6. 10μl hücre süspansiyonu, hücre sayımı gerçekleştirmek için tripan mavi 90μl ile karıştırılır.
7. Hücreleri 5x10 bir konsantrasyon kaplama ⁴ Hücre / ml,% 0.2 heparin 20ng/ml EGF, 10 ng bFGF ve 1μl/ml uygun bir boyut doku kültürü şişesi ile desteklenmiş tam MGK orta. T175 şişeler için T75 ve 40 ml, T25, 20 ml 5ml orta kullanın.
8. 37 ° inkübe İkincil neurospheres 5-7 gün içinde oluşan ° C,% 5 CO ile nemlendirilmiş bir inkübatör ₂.

Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları:

Birincil yetişkin MGK kültürü, hücre çoğunluğu, 2-3 gün ama büyüme faktörü duyarlı habercisi (kök ve progenitör hücreler de dahil olmak üzere) hücreleri çoğalacak (Şekil 1) sonra ölmek ve 6-8 gün sonra farklılaşmamış hücrelerin koloniler oluşturmak. Bu kültürde önemli bir miktarda enkaz normalde mevcut küresel şekillendiğini ve neurospheres için yanlış olabilir. Enkaz miktar mikro diseksiyon ve doku hazırlama teknikleri, doğrudan bağımlı. Gerçek neurospheres parlak faz (ışık) ve (video) boyutu arttıkça daha küresel hale. 7-10 gün sonra, küre, yuvarlak ama sıkıştırılmış olmalıdır; ve 150 ila 200 mikron ölçmek ve aynı zamanda yüksek büyütme (Şekil 2) çevre sert mikro-sivri olmalıdır. Neurospheres çok büyük büyümek için izin verilirse, bu kürelerin merkezinde hücre ölümü nedeniyle koyu renkli hale gelir. Büyük neurospheres ayırmak zordur ve sonunda yüzey eklemek ve ayırt başlar.

Şekil 1. İlköğretim yetişkin MGK kültür. Oklar proliferatif NSC'lerde küçük koloniler göstermektedir. Orijinal büyütme, 20x.

Şekil 2. Passage bir yetişkin neurosphere. Kürenin çevresindeki mikro-ani unutmayın. Orijinal büyütme, 20x.

Tartışmalar

Neurosphere tahlil ² MSS ^4-5 izolasyon ve NSC'lerde çalışma için değil, aynı ^zamanda meme ⁶ ve 7 kalp gibi birçok dokulardan varsayılan kök hücrelerin, diğer türlerinin izolasyonu için sadece araştırma topluluğu geniş dikkat çekti. beyin, meme ve kolon tümör kök hücreler bu kültür sistemi, somatik ve vücutta tümör habercisi hücre popülasyonlarının bir dizi uygulanabilir olduğunu ^{düşündüren} 8-9 belirlenmesi için . Bu yöntemin...

Malzemeler