Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Riepilogo

Questo protocollo video viene illustrato il metodo di analisi per generare neurosfere ed espandere le cellule staminali neurali adulte provenienti dalla regione periventricolare del mouse, e fornisce approfondimenti tecnici per garantire la si può raggiungere culture neurosfere riproducibile.

Abstract

L'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali putativo (NSC) dal cervello adulto murino è stato descritto da Reynolds e Weiss nel 1992 utilizzando una chimica definita senza siero sistema di coltura noto come il test neurosfere (NSA). In questo saggio, la maggior parte dei tipi di cellule differenziate morire entro pochi giorni di cultura, ma una piccola popolazione di cellule precursori fattore di crescita sensibili sottoposti attiva proliferazione in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e / base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Queste cellule formano colonie di cellule indifferenziate chiamate neurosfere, che a sua volta può essere reinoculate per espandere il pool di cellule staminali neurali. Inoltre, le cellule possono essere indotte a differenziarsi, generando le tre principali tipi di cellule del sistema nervoso centrale cioè neuroni, astrociti e oligodendrociti. Questo test fornisce un prezioso strumento per fornire una costante, fonte rinnovabile di precursori indifferenziati sistema nervoso centrale, che potrebbero essere utilizzati per studi in vitro e anche per scopi terapeutici.

Questo video viene illustrato il metodo NSA per generare ed espandere NSCs dalla regione periventricolare topo adulto, e fornisce approfondimenti tecnici per garantire la si può raggiungere culture neurosfere riproducibile. La procedura prevede la raccolta del cervello da topo adulto, micro-dissezione della regione periventricolare, preparazione dei tessuti e della cultura nella NSA. Il tessuto raccolto viene prima digerito chimicamente con tripsina-EDTA e poi dissociato meccanicamente in NSC medio per ottenere una sospensione singola cellula e, infine, placcato in NSA. Dopo 7-10 giorni in coltura, la risultante neurosfere primarie sono pronti per la sottocultura di raggiungere la quantità di cellule necessario per gli esperimenti futuri.

Protocollo

Parte 1: impostare prima di procedere alla dissezione:

1. Volume appropriato di completo supporto NSC è preparata mescolando NeuroCult medio basale NSC e NeuroCult NSC Supplementi proliferazione con un rapporto 9:1, rispettivamente. NSC medio può essere fatta anche in laboratorio in base alla composizione mezzo di crescita NSC pubblicato nella letteratura ¹. Se il laboratorio non ha molta esperienza con fare media, si consiglia di utilizzare media disponibili in commercio che è stato per la crescita di qualità controllata NSC prima di essere venduto (che è il caso di NeuroCult, Technolgies cellule staminali).
2. Il mezzo è riscaldato in un bagno d'acqua a 37 ° C.
3. Freddo HEPES-buffered medio minimo indispensabile (HEM), con elevata concentrazione di antibiotici (10%) è preparato per la dissezione e lo scopo di lavaggio. In alternativa, media NSC basale con l'integrazione di antibiotici può essere usato anche per questo scopo.
il 30-40 HEM freddo contenenti antibiotici è erogato in sterili 50 ml provette per la raccolta del cervello.
4. Diversi 10 centimetri di plastica piastre di Petri sono necessari per tenere il cervello durante la dissezione 10 centimetri e uno sterile piatto di vetro Petri per tenere il tessuto sezionato.
5. Gli strumenti chirurgici necessari per rimuovere il cervello (forbici grandi, piccole forbici a punta, pinze grandi, piccole pinze curve, e una piccola spatola) o per la dissezione dei tessuti (pinze piccolo, curvo pinza sottile, e bisturi) vengono sterilizzati con perle di vetro sterilizzatore a 250 ° C o altri metodi di autoclave disponibili.
microscopio è pulito con alcool al 70% e impostare all'interno della cappa PC2.

Parte 2: raccolta cervello di topo adulto e micro-dissezione:

1. 2-4 adulto (5-8 settimane) sono topi anestetizzati secondo i propri protocolli istituzionali animali approvato con 3-4% di isoflurano o intra-peritoneale iniezione di pentobarbital (120 mg / kg).
cervicale viene eseguita per assicurarsi che l'animale non soffre il dolore e angoscia.
2. Il mouse anestetizzato è prevista sul suo addome su una carta velina assorbente, e la testa è sciacquato con etanolo al 70% per sterilizzare la zona.
3. Forbici di grandi dimensioni vengono utilizzati per decapitare l'animale appena sopra la regione cervicale del midollo spinale.
4. Forbici a punta sono usate per fare una mediana caudale-rostrale taglio e per esporre il cranio.
5. Bordi Il taglio della pelle sono usate per tenere la testa e poi ogni lama di una forbice piccolo viene inserito in ogni cavità orbitale per fare un taglio coronale tra le orbite.
6. Utilizzo del forame magno come un punto di ingresso, un taglio longitudinale è fatta attraverso il cranio lungo la sutura sagittale e due tagli laterali sono anche alla giunzione delle pareti laterali e la base del cranio. Si deve fare attenzione a non danneggiare il cervello sottostante facendo piccoli tagli e assicurando l'angolo delle pale è poco profondo possibile.
7. Il cranio sovrastante ogni emisfero è afferrato e pelati verso l'esterno utilizzando una pinza curva per esporre il cervello, quindi utilizzando una piccola spatola bagnata, il cervello è scavato in una provetta da 50 ml contenente HEM.
8. Questa procedura viene ripetuta fino a quando tutti i cervelli sono stati raccolti.
9. I cervelli vengono trasferiti al cofano PC2 e lavati tre volte con un volume sufficiente di freddo HEM sterile per rimuovere possibili contaminanti come il sangue e capelli. I cervelli vengono poi trasferiti su un piatto da 10 centimetri di Petri contenenti HEM.
10. Per sezionare la regione periventricolare proencefalo, il piatto contenente il cervello è posto sotto il microscopio da dissezione a basso ingrandimento. I cervelli vengono poi posizionati sul piatto la loro superficie ventrale e tenuti dal lato caudale con belle pinze curve. Un'altra serie di pinze curve viene utilizzato per rimuovere il bulbo olfattivo.
11. Dopo la rimozione dei bulbi olfattivi, il cervello vengono ruotati per esporre l'aspetto ventrale.
12. A 90 ° taglio coronale avviene a livello del chiasma ottico e gli aspetti caudale del cervello vengono scartati.
13. Questa procedura viene ripetuta fino a quando tutti i cervelli vengono sezionati.
14. A maggiore ingrandimento, gli aspetti rostrale del cervello vengono ruotati in modo che la superficie di taglio rivolta verso l'alto. In primo luogo, il setto viene rimosso ed eliminato con una bella curva micro-forbici o curve, pinze a punta, e poi il sottile strato di tessuto che circonda la parete laterale dei ventricoli si taglia, escluso il parenchima striatale e il corpo calloso. Tessuto sezionato è riunito in un piatto sterile 10 centimetri di vetro Petri.
15. Questa procedura viene ripetuta fino a quando tutti i cervelli sono micro-sezionati.

Parte 3: preparazione dei tessuti e cellule di rivestimento:

1. Il tessuto aggregati vengono tritate per circa 1-2 minuti utilizzando un bisturi, solo fino a pezzi molto piccoli rimangono.
2. Un volume totale di 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA è usato e tutto il tessuto macinato viene trasferita in un tubo da 15 ml. 3ml tripsina-EDTA è sufficiente per una buona digestione dei tessuti raccolti da un massimo di 8 topi.
3. Il tubo viene incubato per 7 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C.
4. Alla fine dell'incubazione enzimatica, il tubo viene restituito al cofano e un uguale volume di inibitore della tripsina di soia viene aggiunta per fermare le attività tripsina.
5. La sospensione è pipettato su e giù da garantire l'inattivazione della tripsina e poi pellet per centrifugazione a 700 giri (110 g) per 5 min.
6. Il supernatante viene scartato, ed i pezzi di tessuto sono risospesi in 150 ml di sterili medio basale NSC. Ripristino della pipetta a 200 microlitri, le macchie sono dissociate pipettando gentilmente su e giù (3-7 volte) fino ad una superficie liscia sospensione lattiginosa singola cella è raggiunto. Il numero di passi pippetting dipende direttamente dalla dimensione delle particelle nel tessuto tritata (è meglio tritare il tessuto in pezzi molto piccoli in modo da aumentare la superficie per l'attività tripsina). Lunga e vigorosa dissociazione meccanica potrebbe portare alla formazione di sfera ridotta a causa staminali neurali e la morte delle cellule progenitrici.
7. Per rimuovere i detriti e poco dissociato pezzi, basale medio NSC si aggiunge alla sospensione cellulare dissociato a raggiungere un volume totale di 10-15ml. La sospensione cellulare viene fatta passare attraverso un colino 40μm cellule in una provetta dimensioni adeguate, e poi pellet per centrifugazione a 700 giri (110 g) per 5 min.
8. Per rimuovere ulteriormente le macerie, si raccomanda di risospendere il pellet in 10-15 ml di terreno NSC e centrifugare la sospensione cellulare a 700 giri (110 g) per 5 min.
9. Il supernatante viene scartato. Quindi le cellule vengono risospese in volume sufficiente di totale medio NSC integrato con 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml e 1μl/ml del 0,2% eparina.
dissociato da un cervello viene messo in una T25 pallone (contenente 5 ml di terreno completo). Le cellule vengono poi incubate a 37 CO ° C, 5% ₂ Per 7-10 giorni in cui neurosfere momento lo hanno formato. Tessuto raccolto da un cervello di solito in grado di generare neurosfere 400-600.

Parte 4: Passaging e l'espansione del NSC:

1. Quando le neurosfere sono pronti per la subcultura (150-200 micron di diametro), il mezzo con sfere sospese viene rimossa dal fiaschi, collocati in un apposito tubo di tessuto sterile cultura dimensioni, e centrifugati a 700 giri (110 g) per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Il supernatante viene scartato e le sfere sono risospesi in 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA. In alternativa, neurosfere possono anche essere diversi passaggi con metodi meccanici o chimici dissociazione descritti in letteratura ^2,3.
3. La sospensione cellulare viene incubata a 37 ° C a bagnomaria per 2-3 minuti, poi un uguale volume di inibitori della tripsina di soia viene utilizzata per interrompere l'attività tripsina.
4. La sospensione cellulare viene delicatamente pipettato su e giù per assicurare che la tripsina è stato completamente inattivato.
5. La sospensione cellulare viene centrifugata a 700 rpm per 5 min. Poi, il sopranatante viene rimosso e le cellule sono risospese in 1 ml di terreno NSC.
6. 10μl di sospensione cellulare viene miscelato con 90μl di trypan blu per eseguire una conta cellulare.
7. Le cellule sono placcati in una concentrazione di 5x10 ⁴ Cellule / ml in totale medio NSC integrato con 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml e 1μl/ml del 0,2% con eparina in un apposito pallone di colture di tessuti dimensioni. Utilizzo medio-5ml per T25, 20 ml per T75 e T175 40 ml per fiaschi.
secondarie si formano in 5-7 giorni se posti in incubazione a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO ₂.

Parte 5: Risultati Rappresentante:

Nella cultura primaria NSC adulti, la maggior parte delle cellule muore dopo 2-3 giorni, ma fattore precursore crescita sensibile (comprese le cellule staminali e progenitrici), le cellule si moltiplicano (Figura 1) e di generare colonie di cellule indifferenziate dopo 6-8 giorni. In queste culture una notevole quantità di detriti è normalmente presente che potrebbe acquisire una forma sferica, e può essere scambiato per neurosfere. La quantità di detriti è direttamente dipendente dalla micro-dissezione e tecniche di preparazione dei tessuti. Neurosfere sono vere fase luminosa (luminoso) e diventano più sferiche l'aumento delle dimensioni (vedi video). Dopo 7-10 giorni, le sfere devono essere arrotondati, ma non compattato, e dovrebbe misurare tra 150 e 200 micron e dovrebbe avere rigido micro-chiodi alla periferia a forte ingrandimento (Figura 2). Se le neurosfere sono autorizzati a crescere troppo grandi, diventano di colore scuro a causa di morte delle cellule al centro delle sfere. Le neurosfere di grandi dimensioni sono difficili da separare ed eventualmente iniziare a fissare al substrato e differenziare.

Figura 1. Primaria adulto cultura NSC 3 giorni dopo placcatura. Le frecce indicano piccole colonie di NSC proliferativa. Ingrandimento originale; 20x.

Figura 2. Passaggio uno neurosfere adulto 7 giorni dalla placcatura. Si noti la micro-chiodi alla periferia della sfera. Ingrandimento originale; 20x.

Discussione

Il test neurosfere ² ha guadagnato l'attenzione generale della comunità di ricerca non solo per l'isolamento e lo studio di NSCs da SNC ^4-5, ma anche per l'isolamento di altri tipi di cellule staminali provenienti da tessuti diversi putativo, come il petto ⁶ e ⁷ e cuore per l'identificazione del cervello, della mammella e del colon cellule staminali tumorali ^8-9 suggerendo che questo sistema di coltura può essere applicato a una serie di somatiche ...

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