Uzun menzilli DNA Etkileşimleri belirlenmesi için İlişkili Kromozom Tuzak

Özet

Ilişkili kromozom tuzak (ACT) tayini uzun menzilli DNA etkileşimleri belirlemek için bir romanı tarafsız bir yöntemdir. Uzun menzilli DNA etkileşimleri karakterizasyonu gen ekspresyonu normal fizyoloji hem de hastalıklı devletlerin nükleer mimari ilişkiyi belirlemek için izin verecektir.

Özet

Genetik bilgi DNA tarafından kodlanan karmaşık ve oldukça düzenli bir kromatin yapısı içinde organize edilir. Her kromozom, geliştirme veya hücre döngüsü evresine göre değişebilir belirli bir bölge, kaplar. Gen ifadesi, özel transkripsiyonel fabrikalarda oluşabilir uzak aynı kromozom üzerinde farklı kromozomlar veya mevcut DNA segmentleri co-lokalizasyon kromatin segmentlerinde lider, çeşitli kromozom topraklarından döngü çıkışı. Associated Kromozom Trap (ACT), tahlil, tarafsız bir biçimde uzanan ve kromozom konformasyon yakalama tekniğini değiştirerek bu uzun menzilli DNA dernekler tanımlamak için etkili bir yöntem sağlar. ACT testi trans transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarının araştırılması için mümkün kılar ve normal fizyoloji ve hastalık durumlarında sırasında nükleer mimarisi gen ekspresyonu arasındaki ilişkiyi açıklamaya yardımcı olabilir.

Protokol

1. Uzun menzilli kromatin etkileşimleri formaldehit fiksasyonu

1. % 5 CO ₂ ile birlikte bir kuluçka% 15 FBS ve% 80-90 izdiham 1 x penisilin / streptomisin Kültür insan hücre hattı RPMI1640 orta HL-60, 37 ° C
2. Hücreler 1200 rpm'de 15 dakika boyunca 50 ml Nunc tüp, santrifüj içine toplayın ve sonra aspirasyon orta kaldırmak
3. Hücre pelletleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 5 ml kültür ortamı ekleyin. RPMI1640 /% 10 FBS, 40 ml hacmi yaklaşık 1 x 10 ⁷ hücreler, daha sonra seyreltilmiş kromatin düzeltmek için 1.7 ml% 37 formaldehit ekleyin.
4. Nazik sallayarak 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve sonra 2.4 ml 2M glisin ile soğutun. 1200 rpm'de 15 dakika santrifüj 4 ° C ve süpernatant kaldırmak. Pelet 40 ml buz PBS ile bir kez yıkayın, sonra pelet aşağı spin ve PBS kaldırmak.

2. Çekirdekleri izole etmek için hücre parçalama

1. 40 ml taze proteaz inhibitörleri (1:500 seyreltme) ve 0.1 mM PMSF buz lizis tamponu (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl,% 0.2 NP-40) yeniden süspanse edin hücreleri. 90 dakika, 15 dakika 2500 rpm'de santrifüj rotasyon ile soğuk bir odaya inkübe ve supernatant çıkarın.

3. BGL II Kısıtlama enzim sindirimi

1. 1 x NEB tampon 3 0.5 ml çekirdekleri süspanse edin ve 15 μlof% 10 SDS ekleyin. Sallayarak ile 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin, sonra Triton X-100 SDS ayırmak için% 20 45 ul ekleyin. Ile 37 ° C 'de 1 saat süreyle sallayarak inkübe edin.
2. Restriksiyon enzimi sindirim için 1 x 10 ⁶ çekirdek (yaklaşık 15 mg, özgün hücrelere onda biri) bir kısım kullanın. Adım 3.1 'den 55 ul çekirdekleri çözüm çıkarın ve 1 x NEB tampon BGL II (50U/ul) 3 ve 12 ul ul 433 ile 500 ul makyaj. 37 ° ° C'de bir gece inkübe edin.

4. Etkileşim DNA segmentleri ligasyonu

1. Restriksiyon enzimi inaktive 65 ısıtarak 95% 10 SDS ul ve doğasını ekleyerek ° C su banyosunda 20 dakika.
2. 1 x ligasyonu tamponu (30 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl _2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) ve% 20 Triton X-100 360 ul 7 ml ve 1 saat süreyle 37 ° C'de inkübe .
3. 16 daha düşük sıcaklığa ° C ve 400 U / ml T4 DNA ligaz 50 ul ekleyin. 4 saat 30 dakika sonra oda sıcaklığında numune 16 ° C'de inkübe edin ve.

5. DNA Saflaştırma

1. Proteinaz K 300 mg ekleyin ve 65 ° C'de bir gece inkübe edin.
2. 37 A ve inkübe ° C 30 dakika boyunca 5 mg RNaz ekle
3. Izopropanol fenol / kloroform ekstraksiyon ve çökelti DNA DNA arındırın. DNA 150 ul steril distile su ile çözülür.

6. Msp I Sindirim ve oligonükleotid linkers ile ligasyon

1. 4-6 saat için 37 ° C Msp I 5 adet saflaştırılmış DNA 2μg inkübe edin. 65 yaşında ben Msp inaktive ° C de 10 dakika sonra 5 mg / ml glikojen 1 ul etanol içinde DNA hızlandırabilir . DNA pelet 50 ul steril distile su ile çözülür.
2. 20 mcM linker oligonükleotid L 2 ul ile 50 ul Msp I ile tedavi edilen DNA Mix (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 ul 20 mcM oligonükleotid S (5'-cggtgaatc 3'), 1 ul steril distile su ve 10 x T4 DNA ligaz tamponu 6 ul. Karışımı sıvı balmumu ile kaplayın.
3. Doğasını oligonükleotidler 50 ° C ° C 1 dakika ve 10 ile yavaş yavaş soğumasını bekleyin termal cycler 0.5 ° C / dakika degrade.
4. 400 U / ml T4 DNA ligaz 1 ul ekleyin ve 15 ° C gecede inkübe. Linker bağlanan QIAquick PCR Arıtma kiti kullanılarak DNA ve steril distile su ile 50 ul Zehir arındırın.

7. PCR ve dizi analizi

1. DNA uzun menzilli etkileşimler (yani, 'yem') incelemek için istediğiniz belirli bir bölge için bir astar seçin. Bu örnekte, biz ABL-1 kullanır.
2. Gerçekleştirmek için 20 mcM 1 ul kullanarak ilk turda PCR ABL -1 özel astar # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 20 mcM 1 ul linker özel astar # 2963 (1 ul saflaştırılmış DNA 5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3 x Klen Taq DNA polimeraz I kokteyl ve steril distile su ile 3 ul 3μl. ³² P-dCTP İki ul ul PCR önce 3 x Klen Taq DNA polimeraz I kokteyl 100 eklenir. Son uzatma 95 18 döngüleri ° C, 20 saniye boyunca 65 ° C 40 saniye ve 72 ° C 1 dakika boyunca; sıcak bir başlangıç ​​PCR için termal döngüsü 72 ° C 2 dk, 95 ° Cfor 2 dakika 72 ° C5 dakika.
3. 30 ul steril distile su QIAquick PCR Arıtma kiti ve Zehir DNA kullanarak ilk tur PCR ürünleri arındırın.
4. 20 mcM 1 ul ABL-1 spesifik primer # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (Şekil 1a), 1 ul ekleyerek iç içe primerler kullanılarak PCR ikinci turda gerçekleştirmek için ilk PCR ürünü seyreltilmiş 100 x 1 ul atın 20 mcM linker özel astar # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), steril distile su ul 3 x Klen Taq DNA polimeraz I kokteyli ve 3 3 ul. Termal bisiklet programı 25 devir 95 ° C, 20 saniye boyunca 67 ° C 40 saniye ve 72 ° C, 72 ° C'de 5 dakika uzatma takip 1 dakika.
5. PCR ürünleri% 5 üre-PAGE jel çalışan ve bir PhosphoImager maruz ekran (Şekil 1b) tarama gözünüzde canlandırın. Her PCR bant Eppendorf tüp içinde 60 ul steril distile su içeren bir jel şeritler çözme ve 95 ° C'de 5 dakika inkübe jel geri dönüştürülebilir. Tüm örnekleri toplamak için 10 saniye boyunca 10.000 rpm kısaca santrifüjleyin. Yukarıda açıklandığı gibi aynı koşullar kullanarak primer çifti 2961/4626 PCR işlemi gerçekleştirmek için DNA şablon olarak kullanmak için 1 ul çıkarın. Dizi analizleri QIAquick PCR Arıtma kiti kullanılarak arıtma sonra yapılabilir.
6. Http://genome.ucsc.edu (Şekil 1c): DNA dizilerinin web sitesinde kendi kromozomal konumunu belirlemek için bir online araç kullanılarak analiz edilmektedir. 'Blat' bir DNA dizisi yapıştırmak için olanak sağlayan yeni bir pencere girmek için tıklayın, yeni bir pencere 'to' tıkladıktan sonra görünür ve 'Blat Arama Sonuçları' gösterir. DNA dizisi yerini göstermek için bir sonraki pencerede girmek için% 100 kimliği ile hit 'tarayıcı' tıklayın.

8. Temsilcisi Sonuçlar

1. ABL-1 bölge yem olarak kullanarak, uzun menzilli DNA etkileşimleri belirlemek için ACT testinin

Şekil 1a, iki BGL II siteleri ve bir BamH I site gösterildiği gibi ACT tayini için seçilmiştir. PCR ikinci turda, astar 4626/2961 ABL-M1 yükseltmek için kullanılan set, 4630/2961 ABL-M2 için kullanılan ve 4636/2961 ABL-M3 için kullanılmıştır. Tipik bir jel desen çeşitli gruplarda (Şekil 1b) birini gösterir. Parçanın bir ACT testi her iki kombine DNA segmentleri oluşur: ikinci segment yem bölge segmentinde ilk restriksiyon enzim tanıma dizisi katıldı ilişkili ortağı gelen bir kesimi, yem DNA bölgesi türetilmiştir. Ikinci enzim tanıma dizisi ilişkili ortağı dizisi (Şekil 1c) sonunda görünecektir. Klonlanmış ABL-M1 parçası +133,592,306-133,592,399 gelen kromozom 9q32.4 bulunan ABL1 bölgenin DNA içerir ve ilgili ortak +71,869,882-71,870,107 gelen kromozom 3p13 yer almaktadır. Ilgili ortakların kimlikleri UCSC genom tarayıcı (GRCh7/hg19 Şubat ayında yayınlanan, 2009) kullanarak kendi dizilerini patlatma tarafından keşfedildi. PROK2 chr3p13 lokustaki ilişkili ortağı olarak tespit edilmiştir.

Benzer şekilde, klon ABL-M3 ABL-1 lokusu yakınındaki kromozom-içi bir dernek olarak tespit edilmiştir ABL-M2 ilişkili ortağı, chr5q21.1 lokalize idi.

2. ACT testinin daha az yaygın olan uzun menzilli etkileşimlerinin belirlenmesi

3C dayalı Diğer deneyleri, Şekil 1 ve Igf2 / H19 ^lokus 12 daha göstermiştir daha pek çok etkileşim ortakları bildirdin . Biz ana hatlarıyla olduğunu metodoloji en yaygın uzun menzilli etkileşimleri seçecektir. Ancak, PCR döngüleri sayısını artırarak, ek, daha az sıklıkta dernekler belirlemek de (Şekil 2) mümkündür.

3. Normal dokulara göre, kanser hücrelerinin uzun menzilli etkileşimleri farklar.

ACT testi, normal hücreler ve kanser hücreleri (Şekil 3) arasındaki nükleer mimari farklılıkları ve uzun menzilli etkileşimleri de tanımlamak için kullanılır. Bu farklılıklar hücre dönüşümü sırasında meydana gelen nükleer mimari değişiklikleri yansıtmak ve böylece bu testte sonuçta tanısal amaçlı olabilir. Normal ve kanserli dokuların hem de ortaya çıkan benzer jel desen ACT testi güvenilir ve tekrarlanabilir olduğunu belirtti. ACT testi, FISH ve ChIP deneyleri gibi uzun menzilli DNA ortakları, daha fazla analiz, uzak merkezi arasında belirlenen derneklerin varlığını doğrulamak için gerekli olan belirleyebilir. Genetik, fizyolojik ve biyokimyasal çalışmalar, daha sonra bu uzun menzilli DNA dernek biyolojik etkileri aydınlatmak için yapılabilir.

Şekil 1 ACT testinin HL-60 hücrelerinde DNA yem olarak ABL-1 bölge. a. DNA yapısıABL-1 bölgede ure. ACT tayininde kullanılan ilk restriksiyon enzimini BGL II. Ikinci turu için PCR primerleri da oklar ve ilgili astar numaraları tarafından etiketlenir. b. % 5 üre-PAGE ACT testinin Gel desen. Primer çifti 4626/2961 nested PCR ABL-M1 klon yükseltme için kullanılan, 4630/2961 klonlamak ABL-M2 için kullanılan ve 4636/2961 klon ABL-M3 için kullanılır. c. Klon ABL-M1 DNA dizisi. ABL-1 yem DNA DNA parçası kırmızı etiketli ve ilgili DNA ortağı camgöbeği etiketlenir. BGL II sitesinde (AGACTC), yeşil etiketli ve Msp sitesi (CCGG) mor etiketlenir .

Şekil 2 PCR döngüleri ACT testinin sonuçlarını etkileyebilir. Fare fibroblast hücreleri yem DNA olarak Igf2/H19 lokustaki imprinting kontrol bölgesi (ICR) kullanarak, farklı bisiklet programları ACT tayininde birinci ve ikinci tur PCR uygulandı. PCR ilk turda 18-20 döngüleri görüntülenebilmekte için yeterli sinyal yükseltmek değildi. Net bantlarında ikinci PCR sonuçları yirmi beş döngüleri, ikinci tur için PCR döngü sayısını artırırken, daha fazla bantlara ek olarak bir karalama deseni neden olmuştur.

Şekil 3 ACT testinin normal kolon doku ve kolon kanseri dokusu arasında nükleer mimarisinde farklılıklar Algılama a. ICR bölge IGF2/H19 lokus ve Igf2 gen DNA yapısı. ACT tayini için DPN II siteleri etiketlenir. Ikinci turda PCR kullanılan Astarlar karşılık, bu rakam panel b her kulvarın farklı renklerde oklar ve numaralarına göre etiketlenir. b. % 5 üre-PAGE ACT testinin Gel desen. Normal kolon dokusundan MAD03-1423 ve kolon kanseri dokusu MAD04-149 Kooperatif İnsan Doku Ağı (CHTN) Batı Bölümü elde edildi. Her kolon dokusundan homojenize edildikten sonra, ACT testinin Burada açıklanan prosedürleri takip yapıldı. Lane 1 primer çifti paneli pembe etiketli 2961and # 4161 # (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') kullanarak PCR sonuçları temsil eder; şeritli 2 primer çifti # 2961 # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 kullanılarak PCR sonuçları temsil eder ') paneli turuncu etiketli; 3 şeritli primer çifti # 2961 # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3 kullanılarak PCR sonuçları temsil eder' paneli mavi etiketli); şeritli 4, # 2961 primer çifti kullanılarak PCR sonuçları temsil eder. # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') panel a. yeşil etiketli Benzersiz bantlar normal kolon dokusunda sadece görünen sarı oklarla etiketli olup, sadece kolon kanseri dokusu ortaya çıktı bu bantları kırmızı oklar etiketlenir. ICR, basma kontrolü bölge; DMR, farklı metil bölge.

Tartışmalar

Dekker ve arkadaşları, iki genomik ^lokusların 1 arasındaki etkileşimi frekansı tespit etmek için kromozom konformasyon yakalama (3C) yaklaşımı geliştirdi ve 3C, ^memeli hücrelerinde 2 bilinen iki DNA bölgeleri arasında, intra-kromozomal ve inter-kromozomal dernekler araştırmak için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır ^-9. Hi-C yeni geliştirilen metodoloji genom DNA dernek çalışması için uygulanabilir olsa da, ACT testinin hala lokus spesifik DNA ^etkileşimi 10-11 çalışması için etkili bir tekniktir . Biz bu yaklaşımı, kültürlü, fare ve insan hücreleri (Şekil 1) bilinen bir DNA bölgesi ile ilgili bilinmeyen DNA bölgeleri belirlemek için değiştirdiniz. Biz, bize bilinen bir hedef DNA bölgesi ¹² ile ilişkilendirmek roman bilinmeyen DNA ortakları belirlemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem olarak ilişkili kromozom tuzak (ACT) testi bu yöntem adında . ACT testinin ¹³ roman yönlerini çalıştırmadan önce gerekli kontrolleri ile başarılı bir 3C tahlil yapılır. Mümkün olduğunca çok sayıda ilgili DNA bölgeleri olarak tofind amacıyla, birinci ve ikinci kısıtlama enzimlerin çeşitli kombinasyonları kullanmak için gerekli. Bu, ilk 3C ligasyonu adımı gerçekleştirmeniz CpG metilasyon duyarsız restriksiyon enzimleri kullanmak için özellikle önemlidir. Protein bağlama ve DNA metilasyon kısıtlama enzim sindirimi verimliliği etkileyen ve belli bir restriksiyon enzimi sindirimler için ilgili DNA bölgeleri ligasyonu yetmezliğine yol açabilir. Intra-ve inter-kromozomal ligasyonu oluşumu, protein-DNA çapraz bağlama ve ilgili DNA bölgeleri hem de uygun fiziksel haritalar bağlıdır. Bu nedenle, bazı ön deneyler ACT testinin uygulanabilir bir etkin formaldehit konsantrasyonu ve tedavi süresi kurmak için gerekli. Formaldehit (from1.5% 2%) son konsantrasyonlarda bir dizi sırasında çeşitli laboratuvarlarında tahlil ^7,9 3C kısmı kullanılmıştır. Alternatif olarak, linkers olarak kullanılan oligonükleotidler ikinci restriksiyon enzimi ile kesilen yapışkan son maç için dizayn edilebilir. 18-20, ikinci turda PCR PCR ve 20-25 döngüleri ilk turda döngüleri açık bantları sağlayabilir bulundu rağmen, her bir deney (Şekil 2) için en iyi PCR koşulları kurmak için gerekli. Molekül içi 5'-end ve 3'-ucundaki tamamlayıcı bir DNA iplikçik PCR oluşabilir adaptörü dizisi arasındaki tavlama, DNA molekülü ile tavlama adaptörü özel astar engeller ve ilk birkaç döngüleri çok düşük amplifikasyon verimliliğini sonuçlandı. Döngüleri için hedef DNA amplifiye sonra, miktarı bu nonspesifik reaksiyonlar çok daha büyük olabilir ve astar hedef DNA molekülleri tavlama rekabet kolaylaştırabilir. Arka plan amplifikasyon ve neden ilk turda PCR ürünü, PCR ikinci turda arka plan azaltmak için PCR reaksiyonu fazla primerleri kaldırmak için önemli arka plan amplification.It azaltmak için seyreltilerek neden bu aynı zamanda. PCR tabanlı tüm deneylerde olduğu gibi, insan ve fare DNA çoğunluğu oluşturan Tekrar dizisi bölgelerinde bulunmayan primerler tasarımı için hayati önem taşımaktadır. Hi-C yeni geliştirilen metodoloji genom DNA dernek çalışması için uygulanabilir olsa da, ACT testinin hala lokus spesifik DNA etkileşimi çalışması için etkili bir tekniktir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI1640 medium	Invitrogen	22400-105
acrylamide	Invitrogen	15512-023
ATP solution, 10mM	Invitrogen	AM8110G
fetal bovine serum	Invitrogen	16000-044
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
1M Tris pH8.0	Invitrogen	AM9856
RNase A	Invitrogen	12091-039
SDS	Invitrogen	15525-017
urea	Invitrogen	15505-035
BamH I	New England Biolabs	R0136T
Bgl II	New England Biolabs	R0144M
Dpn II	New England Biolabs	R0543T
Msp I	New England Biolabs	R0106S
dNTPs	New England Biolabs	N0447L
proteinase K	New England Biolabs	P8102S
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T
37% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775
Bis-acrylamide	Sigma-Aldrich	146072
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43815
glycine	Sigma-Aldrich	50046
PMSF	Sigma-Aldrich	93482
proteinase inhibitor	Sigma-Aldrich	S8830
Nonidet P-40	Roche Group	11754599001
KlenTaq1	Ab peptides	1001
dCTP alpha P32	PerkinElmer, Inc.	BLU513H250UC
PTC-100 Thermal Cycler	MJ Research	mjptc100
Power Supply	Bio-Rad	164-5056
OmniPAGE Maxi	Aurogene Life Science	VS20D
Typhoon 9400	GE Healthcare	63-0055-78