Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Özet

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir tekniktir Caenorhabditis elegans.

Özet

Caenorhabditis elegans, erken gelişim süreçlerinin çalışmalarında sık sık bir model sistemi olarak kullanılmaktadır . Embriyolar, genetik kaynakları ve dönüşüm göreli kolaylığı şeffaflık C. yapmak niteliklerdir Erken embriyogenez için mükemmel bir model elegans. Lazer tabanlı konfokal mikroskopi ve floresan etiketli etiketleri, araştırmacılar, gelişmekte olan embriyonun özel hücre yapıları ve proteinlerin takip etmek izin verir. Örneğin, bir floresan etiketli boyalar kullanarak, lizozomlar ya da mitokondri gibi özel organelleri, takip edebilirsiniz. Bu boyalar yetişkin gonad mikroenjeksiyon sayesinde erken embriyo teslim edilebilir. Ayrıca, spesifik protein lokalizasyonu flüoresan protein etiketleri kullanılarak takip edilebilir. Örnekler Burada bir floresan lizozomal boya kullanımının yanı sıra floresan etiketli ve ubiquitin histon proteinler gösteren sunulmaktadır. Etiketli histon DNA görselleştirmek ve böylece hücre döngüsü aşamasında tanımlamak için kullanılır. GFP etiketli ubikuitin erken embriyo ubiquitinated veziküllerin dinamiklerini ortaya koymaktadır. Etiketli lizozomlar ve GFP Gözlemler: ubikuitin ubiquitinated veziküller ve lizozomlar arasında ko olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Lizozomal boya mikroenjeksiyon tekniği sunulmuştur. Transgenenic suşları üretme Teknikleri (1, 2) başka sunulmaktadır. Görüntüleme için, standart bir lazer tarama konfokal mikroskop ya da dönen bir disk konfokal mikroskop zaman atlamalı mikroskobu ile takip embriyolar yetişkin hermafrodit nematod kesip ve% 2 agaroz pabuçlarına monte edilmiş. Bu metodoloji, yüksek çözünürlüklü görünüm için erken embriyogenez sağlar.

Protokol

1. Nematodu kültürlerin

1. Uygun C. edinin elegans Caenorhabditis Genetik Menkul Kıymetler Merkezi (CGC) veya bir meslektaşım süzün .
2. OP50 bakteriyel bir çim (3) numaralı seribaşı NGM agar plaklarına nematod büyütün. GFP suşları büyüme analizi için 25 ° C tavsiye edilir.
3. Mikroskopi deneyden önce gün numaralı seribaşı plaka üzerine en az 40 L4 larvaları almak ve 25 ° C gece tabak yerleştirin. Bu solucanlar, deneme için genç yetişkinler olacak.

2. Enjeksiyonlar

Lizozomlar veya mitokondri gibi yapıları görüntülemek için arzu edilir ise, yetişkin görselleştirme önce floresan boya ile enjekte edilebilir.

1. Kurutulmuş agaroz enjeksiyon pedleri hazırlayın. (Kaç gün önceden bir yapılabilir.)
   1. Suda erimiş% 2'lik agaroz hazırlayın. Pasteur pipeti ile 22X54 mm coverglass üzerine 2 damla koymak. Damla üstüne çapraz başka bir coverglass yerleştirin. Ped çapı yaklaşık 1,5 cm kadar, uygun kalınlık elde etmek için, üst coverglass basın. 5-10 dakika bekletin.
   2. Üst coverglass çıkarın. 1 saat süreyle 80 ° C fırında koyarak agaroz ped dehydrate veya bir gecede masa üstü oturmak için izin verir.
2. Mitotracker veya Lysotracker çözüm hazırlayın.
   1. Yumurta Tampon floresan ajan sulandırınız. Biz genellikle Mitotracker veya Lysotracker 1:10 seyreltme kullanın.
   2. 1.2 OD cam kapiller enjeksiyon iğnesi yapılır. Bir iğne bir iğne çektirmenin kullanarak çekin.
   3. Sulandırılmış boya ile iğne geri doldurmak için çekilmiş bir Pastuer pipetlemeyin kullanın.
   4. Kullanana kadar bir ışık, nemlendirilmiş odasında Yeri iğne.
3. Ön-Enjeksiyon: mikroskop ve iğne ayarlama.
   1. Mount enjeksiyon iğnesi enjeksiyon aparat üzerine. Cihaz DIC görüntüleme yeteneği ile donatılmış bir Nikon TE200 inverted mikroskop sahneye monte Narishige doğrudan sürücü mikromanipülatör.
   2. 1.2 mm ID tüp basınç regülatörü bağlı bir iğne takın. Sıkıştırılmış hava veya azot Ya harici bir basınç kaynağı olarak kullanılabilir. Regülatör 20-25 psi ayarlayın.
   3. Enjeksiyon ped üzerine ağır mineral yağı (Parafın petrol) Yeri 2 damla.
   4. Mikroskop üzerine enjeksiyon yastık yerleştirin ve yağın içine iğne düşük. Basınç uygulandığında iğne serbestçe emin sıvı akışı yapmak için kontrol edin. Enjeksiyon basıncı uygulayın ve iğne sıvı akana olmadığını gözlemleyin. Eğer yoksa, nazikçe iğnenin ucunu kırmak için ihtiyacınız olacak. Iğne ucu hafifçe kırık coverglass enjeksiyon pad üzerinde yerleştirilen küçük bir bit sürerek kırılmış olabilir. Iğne akan sonra, bir sonraki adıma hareket ettirin.
4. Enjeksiyon.
   1. Yaklaşık 1 saat önce izleme embriyolar, enjeksiyon pad üzerinde yağ damlası genç erişkin solucanlar aktarmak. Diseksiyon mikroskobu kullanarak bu transferi gerçekleştirin. Solucanlar transfer için bir sivri ucu ile bir platin tel solucan almak kullanın.
   2. Pad üzerinde yatarken, böylece 10 solucanlar - 3 düzenleyin. Enjeksiyon için, daha kolay solucanlar birbirine paralel dizilmiş ve biraz daha az bir solucan uzunluk dışında iseniz Solucanlar enjeksiyon pad sonra hızlı bir şekilde çalışmak ve solucanlar kuruma helak önce enjeksiyon işlemi tamamlamak için önemlidir.
   3. Enjeksiyon mikroskop mikroskop sahneye solucanlar coverglass yerleştirin. Distal gonad tüp orta kesiminde (rachis) içine odaklanın. Sonra aynı odak düzlemi içine iğne ucu taşımak için mikromanipülatör kullanın. Sahne yatay solucan iğne ile delinmiş olduğunu taşıyın. Iğne ucu rachis içinde bir kez basınç uygulayın ve gonad boya karışımı ile doldurmak için izin verir. Enjeksiyon pad üzerinde tüm solucanlar gonad hem silah enjekte edilir.
   4. Enjeksiyondan sonra, solucanlar Yumurta Buffer, yaklaşık 0.5 ml sunmak için çekilmiş bir yeniden süspanse kullanın. Bu dehidratasyon ölüyor onları korumak ve onlara enjeksiyon prosedürü kurtarmak için izin verecek.
   5. Solucanlar, bir ışık, nemlendirilmiş odasında oda sıcaklığında 1-2 saat kurtarmak için izin verin.

3. Embriyolar incelemekte Agaroz pad

1. Yumurta Tampon erimiş% 2 agaroz hazırlayın.
2. Tamamen yeniden süspanse edin, temiz bir mikroskop lamı üzerine 3 damla erimiş agaroz koydu.
3. Onları kapsayan bant etiketleme bir katman diğer iki slaytlar arasındaki yeri slayt. Bunlar agaroz pedi doğru kalınlıkta olmasını sağlayacaktır ayırıcılar olarak hizmet vermektedir.
4. Temiz ikinci bir mikroskop lamı dik aşağı agaroz damla üzerine yerleştirin. Üst slayt kılavuzu slaytlar bant dayanmaktadır kadar aşağı doğru bastırın.
5. Gözlem için embriyo monte etmek için hazır hemen önce, üst kızak kaldırın.

4. Görüntülemek için Montaj embriyolar

1. Varsa solucanlar enjekte edilmiş, sonraki iki adımı izleyin. Yoksa bunları atlayın.
   1. Bir gün önce hazırlanan plaka genç erişkin solucanlar seçin. Genç yetişkinler içinde embriyolar görmek gerekir.
   2. Giremeyen bir NGM plaka üzerine 5-20 solucanlar seçin. Solucanlar onlara takılıp bakterilerin çoğu kaybedersiniz böylece solucanlar birkaç dakika için giremeyen plaka etrafında tarama için izin verin.
2. Erişkin solucanlar genç embriyoların elde
   1. 18 mm ² cam coverglass (1.5 coverglass kalınlığı tercih edilir) orta Yumurta Buffer 5-20 ul damla yerleştirin.
   2. Yumurta Buffer düşüş içine giremeyen plaka veya enjeksiyon ped solucanlar taşıyın.
   3. 26 gauge derialtı iğne ile açık solucanlar kesin. Vulva yakın solucan kesilerek açılır. Embriyolar solucanın dökülebilir göreceksiniz.
3. Mount mikroskop lamı üzerine
   1. Agaroz pad ile hazırlanan ve embriyolar coverglass üzerine düşüktü mikroskop lamı tersine çevirin.
   2. Uzun zaman atlamalı gerekiyorsa, coverglass kenarlarında kuruma önlemek için sızdırmazlık için vazelin kullanın.

5. Mikroskopi

1. Uygun embriyoların bulunması.
   1. Mikroskop sahneye Yeri kaydırın. Embriyolar 10X lens ile tarayın.
   2. Erken evre embriyolar bulmak için, anne mayoz tamamlama sürecinde olan embriyolar araştırın. Kısalma geçirmiş değil çünkü mayotik embriyolar daha sonra embriyolar ayırt edilebilir. (Embriyolar mayoz tamamladıktan sonra, ön sonunda hücre zarı ve yumurta kabuğu arasında önemli bir boşluğu bakın.)
   3. Belirlediğiniz uygun bir şekilde, embriyogenezisin kayıt için daha yüksek bir büyütme lens taşımak, embriyo sahnelenecek.
2. Görüntüleme
   1. Bu örnekte, biz mCherry ifade embriyolar hayal: H2B ve GFP: Ub etiketli proteinlerin. Biz Zeiss LSM700 geleneksel lazer tarama mikroskobu kullanıyor.
   2. Görüntüler 63X 1.4NA objektif kullanılarak toplanır. 488 ve 555 lazerler minimal lazer gücü ve maksimum kazanç ile kullanılır. AZ yığını her 10-15 saniyede bir toplanır. Photobleaching ölçüde bağlı olarak 30-60 kez puan toplanır. Z yığını görüntüler son kez hızlandırılmış video için maksimum projeksiyon görüntü içine çökmüş.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 C İlk Mitoz Gübreleme elegans.

Şekil 2 Mikroenjeksiyon işlemi.

Kilavuz Video 1 GFP Time-lapse video. Mayotik embriyo ubikuitin artı Lysotracker Mavi Videoyu izlemek için buraya tıklayın.

Tartışmalar

Sperm ile füzyon sonra, zigot dinamik olayların bir dizi uğrar. Bu olaylar, hızla gelişen embriyonun içine görece statik bir hücre oosit dönüşümü. Birçok organizmalar, sitoplazmik düzenlenmeleri embriyonik kutupluluk kurulması ve yumurta aktivasyonu için kritik öneme sahiptir. C. elegans embriyo yumurta aktivasyonu ve embriyogenez bu erken olayları gözlemlemek için mükemmel bir fırsat sağlar. Embriyo döllenme sonrasında nispeten hızlı bir şekilde şeffaf ve erken gelişim olaylar meydana C. elegans araştırmacılar erken gelişim yer alan floresan etiketli proteinlerin ifade birçok yararlı transgenik suşları yarattı. RNAi veya mutantlar ile birlikte bu suşların çok hücreli bir organizmanın gelişimi (5, 6, 7, 8) altında yatan moleküler yollar diseksiyon için güçlü bir sistem sağlar. Bu video makalede, C. erken embriyogenez sırasında olayları kaydetmek için bu araçları ve teknikleri kullanarak pratik bir yaklaşım sunuyor elegans.

Olgun C. elegans oosit mayoz I profaz tutuklandı ve yetişkin hermafrodit sperm kesesi döllenmiş. Döllenmeden sonra, oosit mayoz I ve II kalan ilerler. Bu aşamalar floresan etiketli histon H2B (5) kullanılarak görülebilir. Anne mayoz tamamlanması sırasında, sperm DNA (bkz. Şekil 1) yoğunlaşmış kalır. Mayoz tamamlanmasından sonra, anne ve babaya DNA decondensed ve iki pronuclei formu olur. Pronucleus anne baba pronucleus doğru göç ve embriyo merkezine yakın bir araya. Mitoz pronükleer toplantıdan sonra hızla söz konusudur. Tüm bu olaylar, bir saatten daha kısa bir süre içinde ortaya çıkar. Böylece, bu olaylar dizisi zaman atlamalı mikroskopi kolayca yapılabilir. Sahne bu tekniğin bazı tesis konfokal mikroskop erişmek için ek olarak nematod kültür gibi temel mikroskopi becerileri gerektirir.

Burada sunulan örnek bir transgenik C. kullanır ubikuitin ve mCherry:: H2B iki floresan protein, GFP ifade elegans süzün. Konfokal lazer tarama mikroskobu, bu iki proteinin dinamik yerelleştirme gözlemlemek için kullanılır. Buna ek olarak, floresan etiketli Lysotracker enjeksiyon Döllenmeden sonra embriyo lizozomlar kaderi takip etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Mitokondri veya yerel kalsiyum konsantrasyonları (9) görselleştirilmesi için etiketli izci enjeksiyon yapılabilir. Teorik olarak, enjeksiyon protokolü embriyo floresan etiketli molekülünün herhangi bir türünü görüntülemek için kullanılabilir. Bu etiketli küçük moleküller, proteinler, lipidler, vb Bazı durumlarda içerebilir, aslında, solucanlar alımı kolayca mitotracker (10) gibi bazı boyalar etiketli izci enjekte etmek için gerekli olmayabilir. Ancak, iliklerine ve lysotracker enjeksiyon de denemiş ve embriyolarda görünüm için enjeksiyon ile daha iyi sonuç bulundu.

Teknik Hususlar:

Bu prosedür ile sunulan görüntülemede zorluk çok erken embriyolar mikroenjeksiyon tekniği yanı sıra teknik zorluklar içerir. Microinjections agaroz enjeksiyon ped kalınlığı ile ilgili olarak, başarılı enjeksiyon için kritik öneme sahiptir. Pedi çok kalın ise, solucanlar dessicate ve hızlı bir şekilde ölecektir. Pedi çok ince ise, solucanlar enjeksiyon işlemi sırasında ped sopa olmaz.

Erken embriyolar sıcaklık ve tampon koşulları gibi çevre koşullarına duyarlı olabilir. Vahşi tip embriyolar sperm DNA ve mayoz II (4) tamamlanması bir kaç dakika içinde pronükleer göç decondensation başlatmak gerekir. 20 dakika içinde, ilk sitokinez başlamalıdır. Embriyolar çok yüksek lazer yoğunluğu maruz veya aşırı ısınmış olan ya da montaj sırasında ezilmiş, bu süreç kesintiye olabilir. Bu tür embriyoların gelişimi tutuklama. Bu durum ortaya çıkarsa, deney lazer güç azalması veya kalın bir agaroz pad ile tekrar edilmelidir.

C. elegans embriyolar döllenmeden hemen sonra kadar yumurta kabuğu salgılamaya yoktur. Döllenme ve yumurta kabuğu salgılanmasını arasındaki kısa süre içinde, embriyoların anne (11) dışında üstesinden değildir. Bazı laboratuvarlar in utero görüntüleme embriyolar (5, 12) Bu sorun kaçınılması görüntüleme Uterus içinde döllenme sırasında veya hemen sonra meydana gelen olaylar yakalama yeteneği gibi bazı avantajlar sunmaktadır . Ancak, bu teknik derin doku görüntüleme sağlayan mikroskop sisteminin kullanımını gerektirir. Bu iki foton veya çoklu foton gibi sistemler, özellikle bu (13, 14) için uygundur. Geleneksel bir lazer tarama ya da disk konfokal mikroskop iplik, en iyi görüntü embriyolardan elde edilen ha kullanırkenve erişkin solucan, burada açıklandığı gibi kesilmiş.

Görüntüleme Sistemi Hususlar:

Tür kullanılır konfokal görüntüleme sistemi, kullanıcıların ihtiyaçlarına bağlıdır. Genel olarak, bir dilek, mümkün olan en yüksek çözünürlükte görüntüler elde etmek için lazer tarama sistemleri tavsiye edilir. Öte yandan, görüntü elde görece hızlı ve photobleaching / fototoksisite azalır gibi dönen disk sistemleri daha iyi görüntüleme son derece dinamik süreçler için uygundur.

Özel görüntüleme parametreleri deneysel tasarım ve istihdam konfokal görüntüleme sistemi bağlı olarak değişecektir. Çok boyutlu görüntüleme, toplanan kanallar, odak düzlemleri ve zaman noktalarının sayısını dikkate almak gerekir. Photobleaching ve fototoksisite sınırlayıcı etkileri nedeniyle herhangi bir deneyde, sonlu bir sayıda görüntü elde edilebilir. Böylece elde edilecek kanal sayısını artırmak için seçerseniz, büyük olasılıkla, odak düzlemleri ve / veya zaman noktaları ve tersi sayısını azaltmak için ihtiyacınız olacak. Elde edilecek görüntülerin toplam sayısı yanı sıra kullanılan konfokal mikroskop hassasiyeti gibi görüntülü olmak fluorofor yoğunluğu etkisinde olacak. , Daha yoğun fluorophores ve daha hassas aletler gerektirmez ve daha kısa pozlama süreleri, böylece daha az photobleaching ve fototoksisite üretecek.

Çok sayıda veya görüntüleme sistemleri mevcuttur. Biz kendi laboratuvarlarında kullanılan sistemler hakkında bilgi verecektir. Disk konfokal mikroskopi iplik görüntüleme solucan embriyolar için, biz Planı Apo amacı NA 60X/1.4 ile donatılmış Nikon TE2000U inverted mikroskop kullanıyoruz. Mikroskop Yokogawa CSU10 dönen disk ünitesi, bir Hamamatsu C9100-13 EM CCD kamera ve Spektral Uygulamalı Araştırma LMM5 lazer birleştirme modülü 405 çıkışı ile dört katı hal lazerleri içeren, 491, 561 ve 655 nm bağlıdır. Bu sistemi kullanarak bir ya da iki kanal, altı ila on iki odak uçaklar, ve 25 ila 50 timepoints arasında (30 ila 60 saniye aralıklarla) çekebilirsiniz. Tipik bir pozlama süresi 100 ila 200 milisaniye.

Konfokal mikroskobi lazer tarama ile görüntüleme embriyolar için, 2 kanal ve dört katı hal lazerleri (405, 488, 555, ve 635 nm) ile donatılmış bir Zeiss LSM700 kullanın. Bu sistem, embriyo görüntüleme için kullanılan bir Plan-Apo 63X/1.4NA amacı ile bir Zeiss Axio Gözlemci inverted mikroskop eklenir. Sistem, aynı zamanda sınırlı bir görüntü işleme ve analiz sağlar görüntü alımı için Zeiss ZEN yazılımı kullanır. Iki fluorochromes görüntüleme, genellikle 1-5 odak düzlemleri (~ 0.5 mm dışında) toplamak ve bir Z yığını her 15 saniyede toplamak. Koleksiyonlar önemli photobleaching oluştu kadar devam etmektedir. Son kez hızlandırılmış video oluşturmak için, Z yığını görüntüler ZEN yazılımı maksimum projeksiyon aracı kullanılarak konsolide edilir. Videolar yazılım avi dosyaları olarak ihraç edilmektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Kompozisyon
Yumurta Tampon			5mM HEPES pH 7.2, 110mm NaCl, 4mm KCl 5mM Mg asetat, 5mM CaCl 2
Mitotracker	Invitrogen	M-7512
Lysotracker	Invitrogen	L-7525
Enjeksiyon Kılcal pipetleyin	Harvard Apparatus, Kent, İngiltere	GC120F-10
İğne Çektirme	Kopf	Model 700C
Mikroenjektör Aparatı	TriTech Araştırma	MINJ-1 mikroenjeksiyon regülatörü