Ex Vivo Enfeksiyon Oncolytic Virüsler Canlı Doku

Özet

Oncolytic virüsler kanser tedavileri için umut vericidir. Tedavisi öncesinde hastalar elde edilen canlı doku örneklerinin infectability tespit etmek için bu tedavi yaklaşımı yeteneği benzersiz bir avantaj. Bu protokol için dokuların süreci anlatılmaktadır Ex vivo Oncolytic virüs ve sonraki viral kantifikasyon enfeksiyonu.

Özet

Oncolytic Virüsler (OVS) seçici çoğaltmak ve tümör hücreleri öldürmek ¹ roman terapötikler. HSV, Reovirus ve kanser tedavisi olarak Vaccinia OVS oncolytic platformları da dahil olmak üzere çeşitli etkinliğini değerlendiren birçok klinik çalışmalar halen devam etmektedir ^2-5. Oncolytic virüslerin bir önemli özelliği de genetik mikroskopi veya biyo-lüminesans ^{görüntüleme} 6,7 dokuların enfeksiyonu görselleştirmek mümkün kılan muhabiri transgenlerin ifade değiştirilmiş olabilir . Başarılı oncolytic virotherapy ⁸ olasılığını araştırmak üzere tedavi öncesi hasta ex vivo olarak dokuların enfekte mümkün olduğundan bu benzersiz bir avantaj sunmaktadır. Bu amaçla, uygun doku heterojenite telafi etmek ve doku canlılığı, özellikle önceden enfeksiyonu ⁹ değerlendirmek için doku örneği için kritik öneme sahiptir. Viral replikasyon yanı sıra, prematüre ve üretken enfeksiyon arasında ayrımcılık için homojenizasyon aşağıdaki dokulara doğrudan titrasyon oncolytic platformu tarafından ifade, muhabir transgenlerin kullanarak takip etmek de önemlidir. Bu protokolün amacı, bu sorunları ele almak ve burada 1 açıklanmaktadır. 2 hücre kültürü için tümör dokusu numune alma ve hazırlama. Metabolik boya Alamar mavi 3 GFP veya ateşböceği lusiferaz 4 ya da ifade vaccinia virüs kültürlü dokuların ex vivo enfeksiyon kullanarak doku canlılığının değerlendirilmesi. Floresan mikroskopi veya Vivo Görüntüleme Sistemi (IVIS) 5 kullanarak transgen ifade Algılama. Plak yöntemi ile virüs Niceleme. Bu kapsamlı bir yöntem doku işleme kolaylığı, doku heterojenite tazminat, doku canlılığı kontrolü, ve prematüre enfeksiyon ve kemik niyetli viral replikasyon arasında ayrımcılık da dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunuyor.

Protokol

1. Doku işleme

1. En iyi sonuç için, bu protokol taze izole doku% 10 işlenmeden önce cerrahisi sonrası FBS,% 1 Pennicilin / Streptomisin çözüm ve hemen% 0.1 Amphothericin B çözeltisi içeren DMEM medya yatırılan kullanarak yapılmalıdır. Bu mümkün değilse, doku işlenmeden önce 4 derece Bu ortamda bir gecede terk edilebilir.
2. Önce numune işleme, en az 5 dakika boyunca% 70 etanol çözüm tevdi ederek metal forseps ve tek kanatlı sterilize edin. Ayrıca,% 10 DMEM medya içeren 2 ml FBS,% 1 Pennicilin / Streptomisin çözüm ve% 0.1 Amphothericin B. ile 24-plaka hazırlamak
3. Doku örneği steril forseps kullanarak bir laminer akış hücre kültürü kaputu toplayın ve steril yan tarafında kapak uydurarak, boş bir 15 cm petri doku yatırmak.
4. Hücre kültürü kaputu, 2 mm biyopsi yumruk, Şekil 1 gibi doku içindeki bölgelerde çeşitli farklı çekirdek elde etmek için kullanın. Yatay eksende kolaylıkla kesilebilir, böylece her bir çekirdek arasında yeterince boşluk bırakarak, forseps yardımı ile 15 cm Petri kapağın çekirdek Depozito.
5. Şekil 1'de olduğu gibi steril bir jilet ile 4 hatta dörtte Split her bir çekirdek.
6. Pipetlemeyin ucu kullanarak, zaten DMEM 10% FBS,% 1 Pennicilin / Streptomisin çözüm ve% 0.1 Amphothericin B çözeltisi içeren 1.5 ml içeren, Şekil 1'de olduğu gibi A4 A1 farklı bir sıra belirli bir çekirdek, her çekirdek çeyrek koymak . Her çekirdek için tekrarlayın. Bu önyargı, belirli bir kuyu / durumda en aza indirirken, tümör temsili örnekleme izin vermelidir. Daha iyi temsil için, çekirdek sayısını artırmak.

2. Doku canlılığının değerlendirilmesi

1. Şekil 1'de gösterilen ve 1 saat süreyle% 5 CO ₂ ile 37 derece nemlendirilmiş bir inkübatör inkübe takiben doku işleme, iyi # A1 ve # A2 25μl Alamar mavi.
2. Takiben kuluçka Alamar mavi, her A1 ve A2 de 3 kez 100 ul kaldırmak ve 6 farklı bir 96-plaka kuyu transfer. Floresan plaka okuyucu (530 uyarma, 590 emisyon) kullanarak sinyal okuyun ve kayıtlarınız için verileri tutmak.
3. Alamar mavi sinyali okunduktan sonra, DMEM,% 10 FBS + PS + AmphoB içerdiğini de A1 C1, bir pipetlemeyin ucunu kullanarak tüm doku parçalarını aktarmak. Iyi bir ortam A1 aşırı miktarda transfer etmek için dikkatli olun.
4. 10 ⁶ GFP-ifade ve medya 25 ul vaccinia virüs seyreltilmiş lusiferaz ifade PFU sırasıyla kuyuları A3 ve A4 bozar. Eh, A2, hiç de dahil olmak üzere herhangi bir transgen ifade eden bir virüs ile enfekte olabilir.
5. 72 saat sonra, 25 ul Alamar mavi kuyuları C1 ve D1 ve 2.2 adımı tekrarlayın

3. Floresans mikroskobu ile GFP transgen ifade Görselleştirme

1. Hücre kültürü, iyi floresan fotoğraf çekmek için doku parçaları kapsayan tüm medya çıkarın.
2. Bir floresan yetenekli diseksiyon mikroskop kullanarak, öncelikle uygun bir çözünürlükte bir faz kontrast görüntü çekmek
3. Floresan moduna geçin ve bu durumda, GFP, faiz transgen görselleştirmek için uygun filtre kullanılarak bir resim çekmek.
4. Eşiğe bir resim çekmek için faiz transgen (TTT) o kadar olası bir başka dalga boyu için bir floresan filtre kullanın

4. Lusiferaz ifade Görselleştirme Vivo görüntüleme Sistemi (IVIS) yöntemiyle

1. Başlamadan önce IVIS başlatıldı olduğundan emin olun.
2. Kuyuları A4 ve B4, luciferase substrat 10 mg / ml, iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe 5 ul ekleyin.
3. IVIS maruz kalma süresi 5 saniye ayarlayın ve kuyuların bir resim çekmek. Görüntü doymuş ise, düşük pozlama süresi ile tekrarlayın. Herhangi bir sinyal varsa, pozlama süresi artar.
4. IVIS görüntüleme yazılımı kullanarak, iyi B4 sinyal kullanılarak arka plan kaldırmak ve lüminesans sinyali ölçmek için ilgi bölgenizi seçin.

5. Plak yöntemi ile viral titreleri Değerlendirilmesi

1. Viral titreleri niceleme önce, dokular ilk viral parçacıkların serbest homojenize olması gerekir. -80 Saklanan enfekte doku örnekleri, birkaç ay sonra yapılabilir
2. Analitik bir ölçek kullanılarak homojenize olması gerekir örnek tartılır. Bu durumda, biz iyi A2 toplanan örnek kullanabilirsiniz.
3. Doku 5 ml polistren yuvarlak alt şahin tüp yerleştirin ve 1 ml PBS ekleyin. Doku homojenizatörü kullanarak doku homojenize. Gerekirse, daha sonraki bir zamanda viral titreleri değerlendirmesi için -80 Homojenat saklayın.
4. Titresi vaccinia virüs, ilk 6 plaka plaka 1 milyon U2OS hücreleri ve 37 derecede gece boyunca inkübe% 5 CO ₂ nemliified inkübatör confluency ertesi gün yaklaşık% 95 ulaşmıştır.
5. Her seyreltme adım arasındaki ipuçları değiştirmek için emin olun, virüs seri dilüsyonları serum ücretsiz medya kullanın. Genelde biz 10 dilüsyonları 1 ve 900 ul içine aktarmak için 100 ul kullanabilirsiniz. Kaç dilüsyonları yapılan beklenen virüs verimi bağlıdır.
6. Dilüsyonları ardından, kaplama U20S hücreler daha sonra U2OS hücreleri enfekte seyreltilmiş virüs stokunun 500 ul (her seyreltme için) kapsayan medya çıkarın. 1 saat dakika için% 5 CO ₂ nemlendirilmiş inkübatör sıcaklık 37 derece hücreleri inkübe edin.
7. Bu süre zarfında, DMEM% 20 FBS ve 37 derecelik su banyosunda 3% CMC çözüm içeren konsantre 2 X ısınmak.
8. 1 saat inkübasyondan sonra, enfekte U2OS hücreleri kapsayan medya çıkarın. 2X DMEM birlikte,% 20 FBS ve enfekte U2OS hücrelerinin her iyi karşılamak için bu karışıma 2 ml% 3 CMC 01:01 hacimleri karıştırın.
9. Başka bir 48 saat boyunca 37 derece,% 5 _CO 2 nemlendirilmiş inkübatör hücreleri koyun .
10. 48 saat sonra, her bir kuyunun CMC bindirme üstüne 2 ml metanol-asetik asit fiksatif ekleyin ve bir hücre kültürü kaputu 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
11. Sabit kaplama musluk suyu kullanarak kuyuların kalanı atın ve yıkayın.
12. 2ml Coomassie mavi çözüm için de sabit U2OS hücreleri Leke ve bir tabak çalkalayıcı düşük hızda oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
13. Coomassie kuyulardan leke ve musluk suyu kullanarak tabak yıkama çıkarın. Kapak kapalıyken yaklaşık bir saat boyunca kurumasını bekleyin.
14. Sonuç viral plaklar Şekil 2C kolayca görüntülenebilmekte. Tabaklar bu aşamada süresiz olarak saklanabilir.
15. 10 ila 100 plaklar görülebilir seyreltme aşamada plaklar güvenin.
16. Kullanılan seyreltme sayılır plakların sayısını çarpın ve PFU / ml bir titresi vermek için 2 ile çarpın. 25 plaklar iyi bir milyon kat seyreltme sayılır Örneğin, ilk sulandırılmamış örnek titresi 25, 2 ya da 50 milyon PFU / ml ile çarpılır 1 milyon ile çarpılır. Ayrıca PFU / g titreleri rapor örnek için başlangıçta ağırlığını ölçmek bu sayıyı bölmek

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Doğru bir ameliyatla elde normal / tümör doku örneği veya infectable virüs olup olmadığını belirlemek için, bir ilk doku örneği uygulanabilir en emin olmanız gerekir. Şekil 1A, bu canlılığı metabolik bir boya (Alamar mavi) ve, en azından 72h bir süre boyunca hem normal ve tümör dokusu metabolik olarak aktif kalır kullanılarak tespit edilebilir gösterir. Bu dokuların kültürlerinde ex vivo viral replikasyon destek düşündürmektedir. Oncolytic virüsler önemli bir avantajı da, tedavi ya da görüntüleme transgenlerin ifade etmek için tasarlanmış olabilir. Şekil 2B-E GFP veya Lusiferaz daha bu dokuların, canlı ve aynı zamanda infectable olduğunu destekleyen, ex vivo enfekte dokuların tespit edilebilir olduğunu gösterir. Artan transgen ekspresyonu genellikle viral replikasyon ile ilişkili olmasına rağmen, mutlaka terapötik aktivite için önemli olduğu düşünülmektedir kendini amplifikasyon ve yayılması, yol açar, üretken bir viral yaşam döngüsü için eşit değildir. Bu nedenle, başlangıçta doku zarar vermek için kullanılan daha fazla virüs olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Şekil 2B plak yöntemi ile viral kantifikasyon üzerine daha fazla virüs sonra doku enfeksiyonu hemen sonra toplanan 72 saat enfeksiyon sonrası elde olduğunu gösterir. Genel olarak tümör dokusu cerrahi olarak eksize zaman viral replikasyon sırasında destek olabilir, en az 72 saatlik bir süre için hücre kültüründe canlı kalır ki, bu veriler göstermektedir.

Şekil 1. Doku Bakış numune / kesit protokolü Doku örneği birkaç 2 mm çekirdeği daha sonra rastgele kuyuları A1-A4 dağılır dört çeyrek ayrılır kaldırarak işlenir. Renk kodları her kuyuda kullanılan reaktifler göstermektedir. Kuyu içinde gri gölgeli kareler tasvir 6 ayrı çekirdeğe kadar her çeyrekte temsil eder. Iyi A1 doku ilk Alamar mavi okuduktan sonra medya ile yeni bir kuyu (C1) aktarılır. Virüsler ile 72 saat inkübasyon sonunda ikinci bir okuma yapılır. Wells A4 ve B4 72 saat inkübasyon sonrası enfeksiyon sonra luciferase ile desteklenmiş

Şekil 2. Canlılık ve hasta doku örnekleri infectability. A) 2 saat Alamar mavi sinyal ve 72 saat toplama ile ölçülen Doku canlılığı. Y ekseni boş düzeltilmiş Alamar mavi sinyali temsil eder. B) vaccinia virüs titresi2 ve 72 saat sonrası enfeksiyon C Coomassie boyama D U2OS hücreleri üzerinde vaccinia virüs plaklar) Örnek) Lüminesans sinyal hasta VV-lusiferaz enfekte doku elde edilen doku örneklerinde gram başına toplanan IVIS kullanarak görüntülü E) Floresans mikroskobu resimleri VV-GFP ile enfekte hasta doku örneği.

Tartışmalar

Bu protokol kritik adımlardan biri taze doku örneği alınmasıdır. Bir örnek, uygun olmayan bir ortam (örn. PBS) ameliyathane Uzun bir bekleyişin ardından hücre kültürü koymak ise, bu doku canlılığı uzlaşma ve infectability önlemek olabilir. Notu, normal doku doğal olarak daha fazla tümör dokularında bu etkilerin daha eğilimli. Bir başka kritik nokta, doku ve tutarlılığı örnek boyutu nasıl kullanıldığını birçok çekirdek. Gibi faktörler, doku hipoksisi ve infectectable yüzey, çekirdek ve çekirdek dörtte boyutuna bağlı olarak dalgalanma beri boyutu tutarsızlıklar hasta numunelerinin arasında değişkenlik yol açacaktır. Bu doku dilimleme makineleri kullanılarak kısmen çözülebilir ederken, burada sunulan yöntemin bir avantajı kolayca uygun olmayan, yumuşak veya viskoz dokular dahil olmak üzere, nispeten kolay olduğunu kirliliğine karşı daha az eğilimli ve doku tiplerinin çeşitli yaygın olarak uygulanabilir. doku dilimleme. Özellikle, çekirdek sayısı, daha iyi doku temsil almak için artırılabilir. Ayrıca, çekirdeklerin paralel yapılacak DNA, RNA ve protein izolasyonu gibi diğer potansiyel testleri karşılamak için daha fazla parça (örn. 5-8) kesilebilir. Ancak, hangi çekirdek tekrarlanabilir boyutlarda kesilebilir parçaları farklı boyutta corers kullanılarak modifiye edilebilir çekirdek, gerçek boyutuna bağlı olacaktır. İsteğe bağlı olarak, tekrarlanabilir büyüklükte doku parçaları elde etmenize yardımcı olacak bir yolu, onları küçük parçalar halinde parsellenmesi daha önce bir cetvel kullanarak çekirdek uzunluğu bile. Protokolü, diğer virüslerin doğal karşılamak için değiştirilebilir ve dokuların canlı olmalı ve en fazla 6 gün için çoğaltma desteği bulduk. Protokol cytrokines dahil olmak üzere diğer viral ifade transgenlerin ölçümleri daha uzatılabilir. Aşağıdaki enfeksiyon, dokularda immünohistokimyasal yöntemler, doku histolojisi daha da geliştirilmesini sağlar ve nasıl viral enfeksiyon ^10-12 daha fazla kesit ve boyama için parafine olabilir .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Yüksek glikoz DMEM	Hyclone	SH30243.01
Fetal sığır serumu	NorthBio Inc.	NBSF-701
Amphothericin B çözümü	Sigma Aldrich	A2942	% 0.1
Pennicilin-Streptomisin	Sigma Aldrich	P4333	% 1
Alamar Mavi	Invitrogen	DAL1025
D-luciferase potasyum tuzu	Moleküler Görüntüleme Ürünleri	D-luciferase potasyum tuzu 1g	PBS içinde yeniden süspanse 0.22 mikron filtre 10 mg / ml ve filtre
MEM tozu	Gibco	# 41500018	Kullanmadan önce filtre 0,22 mikron 2X MEM ve filtre yapmak için önerilen yarım hacmi olun
Karboksimetil selüloz (CMC)	Sigma Aldrich	C9481	Deiyonize su ve otoklav% 3'lük bir çözüm olun. Not tozu tekrar süspansiyon için biraz zaman alabilir
Coomassie Brillant Blue R	Sigma Aldrich	B7920
2 mm Biyopsi yumruk	Miltex	MX-33-31
Çift Kenar Hazırlık Bıçaklar	Personna Medikal Bakım	74-0002
Floresan diseksiyon Mikroskop	Leica	Model M205 FA
In vivo görüntüleme sistemi (IVIS)	Kaliper Yaşam Bilimleri	IVIS ® 200 serisi
Doku Tearor	Biospec ürünler	modeli 985370-395