İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Özet

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

Özet

Modelleme insan ilaç zehirlenmesi ilerlemelere rağmen, birçok bileşikleri klinik çalışmalar sırasında beklenmeyen yan etkiler nedeniyle başarısız olur. Klinik çalışmaların maliyeti büyük, bu nedenle daha fazla öngörü toksikoloji ekranlarında geliştirilen ve ilaç geliştirme (Greenhough ve ark 2010) başlarında konuşlanmış olması çok önemlidir. İnsan hepatositler ilaç toksisitesinin değerlendirilmesi için altın standart model temsil eder, ancak değişken fonksiyon gösteren sınırlı bir kaynaktır. Bu nedenle, ölümsüzleştirilmiştir hücre hatları ve hayvansal doku modelleri kullanımı rutin bolluğu nedeniyle istihdam edilmektedir. Iki kaynaktan bilgilendirici olsa da, yetersiz fonksiyonu, türün değişkenliği ve / veya kültür istikrarsızlık (Dalgetty ve ark 2009) sınırlıdır. Pluripotent kök hücreler (PSC'leri) hücreleri gibi insan hepatosit cazip bir alternatif kaynak (HLCs) (Medine ve ark 2010). PSC'ler yetişkin bulunan tüm somatik hücre türleri için kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptirler ve böylece temsilfarklılaşmış hücrelerin bir potansiyel olarak bitmez tükenmez bir kaynak. Biz otomasyon ve verim fonksiyonel insan HLCs (Fletcher ve ark 2008; Hannoun ve ark 2010; Payne ve ark 2011 ve Hay ve ark 2011 Hay ve ark 2008) için uygun, yüksek verimli, basit bir prosedür geliştirdik. Biz teknoloji, hastalık modelleme, ekstra bedensel cihazlar inşaat ve muhtemelen hücre nakli tedaviler ilaç keşfi için HLCs ölçeklenebilir üretimine yol olacağına inanıyorum.

Protokol

1. Başlangıç ​​tüm kimyasal stoklarının hazırlanması ve kültür plasticware kaplama

Tüm adımlar, aseptik koşullarda, doku kültürü kaputu yapılmalıdır.

1. Insan temel Fibroblast Büyüme Faktörü (hbFGF) hazırlanması
   1. 0.22 mikron filtre ile PBS ve filtre% 10 BSA çözüm hazırlayın.
   2. % 10 BSA çözüm% 0,2 BSA solüsyon hazırlanır.
   3. 10 ml% 0,2 BSA solution/100 mikrogram hbFGF ekleyin.
   4. Pre-ıslak 0.22 mikron filtre ile 5 ml% 10 BSA çözüm filtreleyerek filtre. 10 ml BSA yıkama atın.
   5. Önceden yıkanmış bir filtre üzerinden hbFGF Filtresi.
   6. -20 ° C'de steril eppendorfs ve mağaza kısım hbFGF
2. İnsan aktivin A Tipi Hisse Senedi Çözüm hazırlanması
   1. 1 ml% 0,2 BSA bir şırınga ve ön ıslak filtre içine ekleyin.
   2. 100 mcg / mL bir stok konsantrasyonu% 0,2 BSA A aktivin sulandırınız.
   3. Aktivitelerine Filtren çözümü ve steril eppendorfs bir kısım, -20 ° C'de saklayın
3. Fare Wnt3a Stok Çözüm hazırlanması
   1. Wnt3a 2 mg flakon bir stok konsantrasyonu 10 mcg / mL PBS 200 ul ekleyin.
   2. -20 ° C'de steril eppendorfs ve mağaza kısım
4. İnsan HGF Stok Çözeltisi (1000X) hazırlanması
   1. Bir stok konsantrasyonu 10 mcg / mL PBS içinde HGF sulandırınız.
   2. Filtre steril eppendorfs HGF çözüm ve kısım, -20 ° C'de saklayın
5. Onkostatin M Stok Çözeltisi (1000X) hazırlanması
   1. Bir stok konsantrasyonu 20 mg / ml PBS içinde OSM sulandırınız.
   2. Filtre steril eppendorfs OSM çözüm ve kısım, -20 ° C'de saklayın
6. Matrigel kültür Kaplama plasticware
   1. 4 gecede Matrigel 10 ml stok şişe çözülme ° C buz ve daha sonra KO-DMEM 10 ml ekleyin. Soğutulmuş pipetler ve mağaza 1 ile iyice karıştırın-20 ° C'de ml alikot
   2. 4 Matrigel ° C en az 2 saat veya bir jel oluşumunu önlemek için bir gecede bir kısım çözülme.
   3. Matrigel soğuk KO-DMEM 5 ml ekleyin, bir pipet ile iyice karıştırın.
   4. 15 ml kadar soğuk KO-DMEM ve bir pipet kullanarak karışımı olun.
   5. (Tablo: (i)) kaplanmış olması plaka veya cam şişe matrigel ekle

Tabak / Flask	Cilt / Kuyu veya Flask
12 plaka	De ortalama 0.5 mL
6-plaka	Her 1 mL
25cm 2 şişesi	Şişesi ortalama 2 mL

(Tablo 1). HESC kültür kaplama tipik plasticware için matrigel Önerilen hacimleri.

6. 6. Kaplanmış plaka veya cam şişe, 4 gece boyunca inkübe ° C veya odaKullanmadan önce 1 saat boyunca ısıya.
   7. Matrigel ile kaplı plakalar veya şişeler, 1 hafta kadar 4 ° C'de saklanabilir. Onlar açıkça kaplı olan tarih ile etiketlenmiş olmalıdır. Bir hafta içinde kullanılan herhangi bir tabak veya cam şişeler atın.
      1. Kullanmadan önce kaplı kültürü kapsayıcı bir doku kültürü kaputu içinde oda sıcaklığına kadar gelmek için izin verir.
      2. Hemen önce matrigel aspire kullanmak ve hücre süspansiyonu iyi ya da balon eklemek.

2. Rutin bakım hESC kültür ve karakterizasyonu

1. HESC hatları, Resüsitasyon
   1. Sıvı azot depolama hESC çıkarın ve hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosunda çözünme.
   2. Hücre süspansiyonu sıcak ortamda birkaç ml içeren steril bir tüp dikkatli bir şekilde aktarın.
   3. Pelet santrifüj yoluyla hücreler @ 5min için düşük devirli (1000 RPM).
   4. Süpernatant ve çok nazik edinmek ve kapalı aspiresıcak ES orta ve MEF besleyici tabaka levha içine hücreleri pend.
   5. Günlük, taze ES orta ve subconfluence hücreleri üzerine tekrar çember yükleme hücreleri, hücreler Pasajlanması gerektirir.
2. Rutin hESC bakım
   ES hücreleri matrigel ile kaplı plakalar veya şişeler içinde yetiştirilir. Hücreleri günlük olarak incelenmiş ve beslenmesi gerekiyor:
   1. Kirlenme, hücre morfolojisi ve izdiham mikroskop altında inceleyin.
   2. Aspire geçirdi orta.
   3. Uygun bir ses, taze Fare Embriyonik Fibroblast-conditioned Orta (MEF-CM) + insan bFGF (son konsantrasyonu 4 ng / ml) ya da diğer serum ^serbest medya 6 ekleyin.
3. Kollajenaz ile Pasajlanması hücreleri
   hESC hatları (H1, H9 ve RCM-1), 1:3 bölünmüş oranı Pasajlanması aşağıdaki her 5-7 gün izdiham ulaşacak. Stroma varlığı Erken geçiş hESC daha yavaş büyüyecek ve matrigel zaman önemli bir faktör haline gelebilir. İnsan EKH 14 daha uzun süre bırakılmamalıdırmatriks bozulması nedeniyle aynı matrigel ve hücrelerin akışkan eğer bu durumda geçit, 1:1 veya 1:2 bölünmüş oranı hücreleri için gerekli olabilir.
   
   Enzim Kuluçka
   1. Tüm adımlar, aseptik koşullarda, doku kültürü kaputu yapılmalıdır.
   2. 1.6 bölümüne uygun olarak hazırlanan yeni bir matrigel kaplı bir tabak veya şişesi var olduğundan emin olun.
   3. Hücreler için istenen split oranı karar verin. Bir dizi faktör, split oranı karar katılan:
      1. Yüksek düzeyde düşük sayıda kolonilerin stroma: küçük bir iyi boyutuna geri geçişli olabilir veya bazı stroma kurtulmak ve böylece hESC büyümeyi teşvik koloni stroma oranı artacak 01:01 geçişli olabilir.
      2. Yeterince büyük hESC koloniler varsa kolonilerin sayısı bağlı olarak büyük kolonileri ile stroma Yüksek düzeyde, 1:1 veya 1:2 geçişli olabilir.
      3. Tipik küçük bir str ile büyüyen hESComa veya herhangi bir stroma ve / veya bazı farklılaşma 1:2 veya 3 geçişli olabilir.
      4. Iyi ya da balon medya aspire.
      5. 2 mL PBS (MgCl _2, CaCl ₂₎ ile bir kez yıkayın.
      6. Kollajenaz uygun bir hacmi (KO-DMEM 200 U / ml seyreltilmiş) ekleyin ve 37 inkübe ° C 2-5 dk. 2 dakikadan itibaren mikroskop altında (1 dakika aralıklarla) düzenli olarak inceleyin. Noktada farklılaşmış hücrelerin kaldırmaya başlar ve koloniler hücrelerin geçişli hazır kenarında kaldırmaya başlar.
   HESC Kazıma ve havuzu
   3. 6. Kollajenaz aspire.
      7. 2 mL PBS (MgCl _2, CaCl ₂₎ ile bir kez yıkayın.
      8. Split oranı bağlı olarak ve fiziksel olarak iyi ya da balonun yüzeyi hücreleri kaldırmak bir hücre kazıyıcı kullanarak MEF-CM uygun bir hacim, daha sonra gen çiğnemektly 2-3 kez 10 ml pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleme. HESC hücre kümeleri tutulur ve tek hücre içine kırık değil önemlidir.
   HESC Replating
   3. 9. Yeni matrigel kaplamalı matara veya kuyu üzerine çıkan hücre süspansiyonu Replate.
      10. MEF-CM hacmi için 4 ml 6 plaka iyi olun.
      11. Koloniler, hücre replating ve farklılaşmayı etkileyen levha / şişesi doku kültürü merkezinde çökmemesi için hücrelerin inkübatör ajitasyon verirken doku kültürü konteyner gibi hatta koloniler olası bir dağıtım sağlamak için.
4. Flow sitometri hESC popülasyonlarının Rutin karakterizasyonu
   1. hESC nüfus Eki 3 / 4, Tra 1-60 ve SSEA-4 gibi kök hücre belirteçleri için ayda bir defa akım sitometri yöntemiyle incelenir.
   2. hESCtek hücre süspansiyonları tripsin / EDTA (Invitrogen) ile 5 dakikalık bir tedavi aşağıdaki gibi popülasyonlar kendi substrat kaldırılır.
   3. 1x10 ⁶ hücre / mL PBS% 0.1 BSA ve% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş tek hücre tekrar
   4. Hücre hazırlama, 4 ° C'de 40 dakika için uygun antikorlar ile inkübe edin.
   5. Hücreler, PBS bağlanmamış antikor kaldırmak ve son hacim 100 mcL tekrar süspansiyon ve flow sitometri ile analiz için% 0.1 BSA ve% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş ile iki kez yıkayın.
   6. Veri 30.000-40.000 "canlı" etkinlikleri için 488 nm lazer ile donatılmış bir FACS Caliber sitometresinin kullanarak her bir numune için alınan ve CellQuest yazılımı (Becton Dickinson, San Jose, CA) kullanılarak analiz edilmektedir. Boyanmamış hücrelerin kontrol grubu olarak dahil edilir. Forward scatter ve yan dağılım parametreleri elektronik bir canlı geçidini kullanarak analiz enkaz ile birlikte ölü ve apoptotik hücre dışı bırakıldı.

3. DiferansiyehESC karaciğer endoderm, ation

1. Medya, hepatik endoderm için hESC farklılaşma için hazırlanması. Tüm medya hazırlık aseptik koşullarda, bir doku kültürü kaputu yapılmalıdır.
   1. RPMI Hazırlanması: B27 emişli orta endoderm farklılaşma
      1. RPMI-B27, orta karışımı RPMI 1640 (500 ml) ve B27 (50x, 10 ml) için
      2. Bileşenleri çalkalanarak karıştırılır.
      3. Tüm bileşenleri, 4 vakum, mağaza altında filtre ünitesi ve filtre ° C ekle
   2. Hepatosit farklılaşma SR-DMSO ortamın hazırlanması
      1. SR-DMSO orta, 80% KO-DMEM, 20% KO-SR,% 0.5 'lik L-glutamin,% 1 non-esansiyel amino asitler, 0.1mm β-mercaptoethanol ve% 1 DMSO karıştırın.
      2. Filtre vakum altında çözüm, mağaza, 4 ° C ve -20 ° C'de kısım gerekirse ve saklarız.
      3. 4 mL başına iyi bir 6-plaka ve T25 şişesi başına 6 mL kullanın.
   3. Hepa L15 olgunlaşması için ortamın hazırlanmasıtocyte olgunlaşma
      1. L-15, orta karışımı 500 ml Leibovitz L-15 orta, triptoz fosfat suyu (son konsantrasyonu% 8.3), ısı inaktive fetal sığır serumu (son konsantrasyonu% 8.3), 10 mcM hidrokortizon 21-hemisuccinate 1 mcM İnsülin (sığır pankreas ),% 1 L-Glutamine,% 0.2 'askorbik asit.
      2. Filtre vakum altında çözüm, mağaza, 4 ° C ve -20 ° C'de kısım gerekirse ve saklarız.
   4. Son RPMI Hazırlanması: B27 emişli orta
      1. Için gerekli priming orta hacmi deneyi (6 plaka başına 1 ml ve T25 şişesi başına 2 ml) koyun.
      2. 100 ng / mL son konsantrasyon için bir aktivin ekleyin.
      3. 50 ng / mL son konsantrasyon rekombinant Wnt3a ekleyin.
      4. İyice karıştırın ve medya artık kullanıma hazır.
      5. Bu son medya her gün taze yapılmalıdır.
   5. Son L-15 olgunlaşma orta hazırlanması
      1. Gerekli Uygulamadeneyi (6 plaka başına 4 ml ve T25 şişesi başına 6 ml) L-15 orta hacim.
      2. 10 ng / ml final konsantrasyonda HGF ekleyin.
      3. 20 ng / mL son konsantrasyon için OSM ekleyin.
      4. İyice karıştırın ve medya artık kullanıma hazır.
      5. Bu son medya her gün taze yapılmalıdır.
2. Astar hESC kesin endoderm
   1. Kültür hESC (H1, H9 ve RCM-1) ve bFGF ile desteklenmiş fare embriyonik fibroblast MEF-CM matrigel kaplı plakalar üzerinde yaymak.
   2. HESC emişli orta MEF-CM (RPMI 1640-B27 100 ng / ml aktivin A ve 50 ng / ml ile desteklenmiş yerine confluency seviyesini yaklaşık% 30 -60 (% hESC hattına bağlı) ulaştığınızda hepatik farklılaşma başlatın. Wnt3a.
   3. Hücreleri 3 gün (her 24 saatte bir değişen orta) emişli orta kültür ve aktivin A ve Wnt3a ile son priming ortamı her gün taze yapılır.
   4. priming ortamda 72 saat sonra 5 gün (orta değişen her 48 saatte) için ikinci bir farklılaşma, orta (SR-DMSO), orta değiştirmek.
   5. 8 gün kültürü olgunlaşma ve bakım ortamında hücreleri (L-15) 9 gün (her 48 saatte bir değişen bir orta) için 10 ng / mL hHGF ve 20 ng / ml OSM ile desteklenebilir. Her gün taze hHGF ve OSM ile Olgunlaşma ve bakım ortamında yapılır.
   6. Hücrelerinin yavaş yavaş bir dikenli / üçgen şekli poligonal bir görünüm (Şekil 2A) gösteren karakteristik bir karaciğer morfoloji morfolojik değişiklikler gösterirler.
   7. Hepato-hücre farklılaşması için şematik:

4. HESC elde edilen karaciğer endoderm Karakterizasyonu

1. Immün
   1. PBS iki kez, 1 dakika Her yıkamadan hESC elde edilen HLCs yıkayın.
   2. (Hücre, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 PFA Fix HLCss PBS içinde 4 ° C'de saklanan ve daha sonraki bir tarihte vitray) olabilir. Hücreler, -20 ° C'de 10 dakika boyunca buz gibi metanol ile tespit edilebilir
   3. Hücreler iki kez PBS, her yıkama 5 dakika yıkayınız.
   4. 2 dakika boyunca hücreler nükleer boyanma (metanol fiksasyonu kullanılır ise, bu adım gerekli değildir) için% 100 etanol ile oda sıcaklığında inkübe edin.
   5. Hücreler iki kez PBS, her yıkama 5 dakika yıkayınız.
   6. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle PBS / T (% 0.1 arasında) /% 10 BSA hücreleri engelleyin.
   7. Engelleme tampon gecede 4 ° C ajitasyon çıkartın ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS / T (% 0.1 arasında) /% 1 BSA ve inkübe seyreltilmiş ilgili primer antikor eklemek veya.
   8. Hücreler 3 kez PBS / T (% 0.1 arasında) / oda sıcaklığında% 1 BSA, 5 dakika, her yıkama ile yıkayın.
   9. PBS içinde seyreltilmesi ajitasyon ile karanlıkta 1 saat oda sıcaklığında inkübe hücreleri ve uygun ikincil Alexa Fluor antikor (1:400).
   10. Hücreler PBS ile 3 kez, 5 dakika, her yıkama yıkayın.
   11. MOWIOL 4-88 ve DAPI (1:1000) ile her yanı Dağı. Tüm hava kabarcıkları 4 kaldırılır ve mağaza sağlamak için hafifçe basılarak lamel ° C karanlık, iyi bir kapak kayma ile kaplayın.
2. RNA izolasyonu ve çıkarma
   1. PBS ve aspirat ile hESC elde HLCs yıkayın.
   2. TRIZOL reaktif 1 ml ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
   3. 1.5 ml Eppendorf (-80 ° C daha sonra gerektiğinde kullanmak için mağaza) hücreler ve yer Pençe.
   4. Kloroform 0.5 ml Eppendorf ve alt üst edilerek karıştırın ekleyin; bu davlumbaz yapılır emin olun.
   5. 15 dakika boyunca 13.000 RPM çözüm Santrifüj 4 ° C
   6. Arayüz hiçbir kirlenme olduğundan emin olun, temiz bir Eppendorf içine sulu tabaka ve yerde toplayın.
   7. 1 izopropanol mL ve karıştırın evirerek precipi 10 dakika oda sıcaklığında bırakınTate RNA.
   8. 10 dakika boyunca 13.000 RPM Santrifüj 4 ° C
   9. Süpernatantı aspire ve RNA pelet rahatsız değil emin olun. 0.5 ml% 70 etanol ile yıkayın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakın.
   10. 5 dakika boyunca 8.000 RPM Santrifüj 4 ° C
   11. Etanol aspire edin ve 5-10 dakika oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   12. Bir kez tüm etanol buharlaştı, deiyonize su 30 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin. RNA -80 ° C daha sonra kullanmak üzere saklayın.
   13. Nanodrop kullanarak RNA konsantrasyonu niceliğini.
3. Ters Transkripsiyon PCR
   1. Daha önce izole RNA (200 ng), rastgele hekzamer, nükleotidler (10mm) ters transkriptaz ve ince duvarlı 0.5 ml Eppendorf ilgili tampon kullanarak bir tepki ayarlayın.
   2. Bir negatif RT, yukarıdaki reaksiyon ters transkriptaz olmadan ayarlayın.
   3. Tüpleri bir termo cycler, PCR makinesi içine yerleştirin ve aşağıdaki p kurmakPROGRAM:
      1. 37 ° C - 5 dakika (1 döngü)
      2. 42 ° C - 1 saat (1 döngü)
      3. 95 ° C - 5 dakika (1 döngü)
   4. Gerekirse daha sonra kullanmak için cDNA -20 ° C'de saklayın.
4. TaqMan kantitatif revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu Hasat hücrelerin farklılaşması protokol boyunca farklı zaman noktalarında. RNA Özü ve talep üzerine aşağıdaki primerler ve Analiz (Uygulamalı Biyosistem) protokolü kullanılarak ters transkripsiyon qPCR yürütmek:
   1. Oct 4 Hs03005111_g1
   2. Nanog Hs02387400_g1
   3. Albumin Hs00910225_m1
   4. Alpha-fetoprotein Hs00173490_m1

RNA izolasyonu ve çıkarma lütfen için bölüm 3.3.2 'ye bakın .

1. Ters transkripsiyon ve TaqMan qPCR
   1. RNA 1 mg alın ve Invitrogen Üstsimge III ters transkripsiyon kullanılarak cDNA yazıya terskiti, üreticinin talimatlarına göre.
   2. Uygulamalı Biyosistem, 18S ribozomal kontrol astar ve rox Invitrogen 2x platin qPCR Supermix UDG uygun astar ve uygun bir su hacmi oluşan 25 ul TaqMan reaksiyonu kullanılan cDNA 1 ul.
   3. İyice karıştırın ve her bir örnek 10 ul ya 96 ya da 384 kuyu qPCR plaka iki kuyu içine yerleştirin.
   4. Bir kez tüm örnekler) yüklü, artı uygun kontrollerin, plaka, mühür ve Uygulamalı Biyosistem 7900HT TaqMan makinede analiz.
   5. Sonuçlar kontrol örneği üzerinden nispi ifade olarak ifade edilir.

5. - HESC Türetilmiş Karaciğer Endoderm Fonksiyonel Analiz P450 Tahliller Sitokrom http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
   1. Inkübe gün 17 hESC 37 ° C (n = 3) 5 saat özel substrat HE türetilmiştir. Gibi doku kültürü ortamları kullanın.37 negatif kontrol ve inkübe ° C'de 5 saat.
   2. Süpernatantlar toplayın ve tahlil üreticinin talimatlarına göre yürütmek.
   3. Göreli bazal aktivite düzeylerini ölçmek ve BCA Testi (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101) tarafından belirlenen başına mg protein normalleştirmek.

Notlar

1. Tüm miktarlar 6 plaka formatına dayanır. Gerekli plaka veya cam şişe, buna göre miktarlar ayarlayın.
2. Tüm emişli, farklılaşma ve olgunlaşma orta kullanmadan önce vakum altında filtre edilir.
3. Astar, farklılaşma ve olgunlaşma ortamında saklanan 4 ° C, 2 haftadan daha uzun için. Orta deney ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de kısım kalan medya ve mağaza için gerekli ne kadar değerlendirin.
4. Matrigel üreticinin talimatlarına uygun olarak yapılır; 1 ml alikotları kadar -20 ° C'de saklanabilir.
5. Grobir kez yapılan ve aliquoted wth faktörler, -20 ° C'de saklanabilir ve çözülmüş zaman 4 saklanabilir ° C, 2 haftadan daha uzun süre.
6. Primer antikor genellikle hESC elde edilen HLCs karakterize etmek için kullanılır (1:250, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) albümindir.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

HESC, Karakterizasyonu önce hepatik farklılaşma korudu

Çalışmada kullanılan H9 hESC kök hücre durumunu karakterize etmek için bir dizi parametre okudu. Hücreleri hESC morfolojisi, tanımlanan koloniler (Şekil 1A) büyüyen küçük, sıkışık hücrelerde sergilenen ve pluripotent kök hücre gen göstergeleri, Eki-3 / 4 ve Nanog (Şekil 1B). Biz bu genlerin ifadesi H7 hESC hattı pozitif kontrol ile karşılaştırıldığında önemli farklılıklar bulamadı. Ayrıca, hESC nüfusun% 90.1 'kök hücre belirteci SSEA-4 (Şekil 1C) için pozitif oldu.

oSC karaciğer endoderm farklılaşma

İnsan embriyonik kök hücreleri, in vitro hepatik endoderm (Hay ve ark 2008) etkin bir şekilde ayırt edilebilir. Gün 9 farklılaşma, hücre hasat ve HLCs için hESC farklılaşma değerlendirildi. Daha önce bildirdiği gibi, bir dizi derin morfolojik değişiklikler hESC sergiledi ve 9 gün, poligonal bir görünüm (Şekil 2A) gelişmekte olan erken hepatosit morfolojisi sergiledi. Ayrıca, Ekim-3 / 4, 9 günlük süre boyunca baskılanması (Şekil 2B) gözlenmiştir. Buna karşın, karaciğer transkript AFP ve albümin gün 7 itibaren up-regüle (Şekil 2C).

Karaciğer Endoderm in vitro maturasyon

Karaciğer endoderm kurulan yordam (Hay ve ark 2008) kullanılarak in vitro olgunlaştı. Farklılaşma kültürlerin son gününde insan karaciğer belirteçleri albümin, AFP ve E-cadherin immunohistokimyasal. Bizim kullanarak verimi HLCs işlem tipik olarak% 90 (Hanun ve ark 2010; Payne ve ark 2011 Hay ve ark 2008). HLCs Albumin, Alpha-fetoprotein ve E-Cadherin (Şekil 3) için pozitif boyandı.

Şekil 1. Bu çalışmada kullanılan hESC karakterizasyonu. (A) faz kontrast mikroskobu görüntüleri temsilcisi hESC morfolojisi 4x ve 10x büyütme kültür gözlemledi. (B) kültür hESC Oktamer (Eki-3 / 4), pozitif ve Nanog olumlu bir Nikon TE3000 / U inverted mikroskop kullanarak görüntüleri ele geçirildi . H7 hESC pluripotency gen ekspresyon düzeyleri için bir kontrol olarak kullanmak. Bağıl ifade endojen gen kontrolü ile karşılaştırıldığında indüksiyon kıvrımları ifade eder, β-2-mikroglobulin (C) FACS araziler aşamada özgün embriyonik antijenleri SSEA 4 hESC yüzey işaretleyici ifade düzeyleri de dahil olmak üzere, göstermektedir.

69/2969fig2.jpg "/>
Şekil 2. Kültür gözlenen farklılaşma 9 gün hESC kaynaklı karaciğer endoderm morfolojisi (A) Faz kontrast mikroskobu temsili görüntü, x4 ve x10 büyütme (B) gen ekspresyonu değişiklikleri Karakterizasyonu. Ilerici farklılaşmamış hücre gen ekspresyon baskılanması (Eki-3 / 4) ve (C) hepatosit gen ekspresyonu ekspresyonunun (albumin ve α-fetoprotein) gösteren, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ile RNA ekstrakte edildi ve cDNA analiz edildi. Bağıl ifade endojen gen kontrolü, β-2-mikroglobulin farklılaşma 0 gün ile karşılaştırıldığında indüksiyon kat ifade eder. P <0.05 gösterilir ve p <0.001 gün 0 hESC ile karşılaştırıldığında öğrencilerin t-testi ile ölçülen *** başlar. Hata çubukları, 1 standart sapma temsil eder.

Şekil 3. ChhESC kaynaklı karaciğer endoderm, aracterisation
Hepatosit belirteçleri, albümin, AFP ve hESC E-Cadherin (H9) türetilen karaciğer endoderm İmmünositokimya gösteren ifade. Negatif kontroller ilgili immünoglobulin G (IgG) ve görüntülerin gösterildiği temsilciler ile yapıldı.

Şekil 4 hESC (H9) elde edilen HLCs metabolik aktivite sergilerler. At HLCs için farklılaşmış Gün 17, H9 CYP3A metabolik aktivitesi (n = 6) sergiledi.

Tartışmalar

Biz insan HLCs ölçeklenebilir seviyelerini oluşturmak için basit, homojen ve in vitro yüksek oranda tekrarlanabilir bir model geliştirdik . Bizim modelimiz bir dizi dış işbirliği laboratuarları tarafından onaylanmıştır. Biz rutin olarak gelişim belirteçler ve karaciğer özel fonksiyonel testlerinin (çoğu ticari olarak mevcuttur) ev araç kutusu kullanılarak kök hücre elde edilen HLCs karakterize eder. Sürecinde önemli aşamaları şunlardır: bakım pluripotency kök hücre, kök hücre...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
İlköğretim antikorlar
Antijen *	Tip	Satıcı	Seyreltme
ALB	Monoklonal Fare	Sigma Aldrich	1 / 500
E-Cadherin	Monoklonal Fare	Millipore	1 / 100
alfa-fetoprotein	Monoklonal Fare	Sigma	1 / 500
SSEA-4 FITC	Monoklonal Fare	Biolegend	1 / 100
IgG	Monoklonal Fare	DAKO	1 / 500
Sekonder antikorlar
Anti-fare FITC konjuge	Monoklonal Keçi	Invitrogen	1 / 400