Biyomedikal Uygulamalar için Aljinatta Mikrokürelerin Üretimi

Özet

Aşağıdaki bölümlerde, biyomedikal uygulamalarda kullanım için aljinat mikroküreler hazırlanması için prosedürleri özetlemektedir. Biz özellikle tip 1 diyabet için potansiyel bir tedavi olarak hücre ve protein encapsulation çift amaçlı çok katmanlı aljinat mikroküreler oluşturmak için bir teknik göstermektedir.

Özet

Aljinat esaslı malzemeler nedeniyle hidrofilik doğa, biyouyumluluk ve fiziksel mimari biyomedikal uygulamalar için oldukça dikkat çekmektedir. Uygulamalar hücre kapsülleme, ilaç dağıtım, kök hücre kültürü ve doku mühendisliği iskeleleri bulunmaktadır. Aslında, klinik çalışmalarda şu anda adacık tip I diyabet bir tedavi olarak FKÖ kaplı aljinat mikro kapsüllü hangi yapılmaktadır. Bununla birlikte, adacıklar, çok sayıda sağkalım aşağıdaki transplantasyonundan dolayı etkinliği için gereklidir. Yerel kapsüllü hücrelerinin etrafında mikrovasküler ağ oluşumunu teşvik yeteneği oksijen, glikoz ve diğer hayati besin gelişmiş ulaşım yoluyla canlılığı arttırabilir. Fibroblast büyüme faktörü-1 (FGF-1) kan damarlarının oluşumunu teşvik ve iskemik dokularda oksijen seviyelerini artırmak için mümkün olan bir doğal olarak meydana gelen büyüme faktörüdür. Bir sust olarak temin edildiğinde FGF-1 etkinliği arttırılıryerine tek bir büyük-bolus daha ained moda. Adacık kapsülleme sistemlerinden büyüme faktörlerinin yerel uzun vadeli sürüm potansiyel fonksiyonel greft sonuçlarının iyileştirilmesi, nakledilen hücrelerin doğrudan katkıda kan damarlarının büyümesini teşvik edebilir. Bu yazıda, biyomedikal uygulamalarda kullanım için aljinat mikroküreler hazırlanması için prosedürleri özetlemektedir. Buna ek olarak, biz çok katmanlı aljinat, mikro-küreler üretmek için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreler dış tabakadaki aljinat iç çekirdek aljinat, ve anjiyojenik proteinleri içinde kapsüllenmektedir edilebilir. Bu dış katmandaki proteinlerin serbest nakledilen adacıklar yönelik doğrudan yerel mikrovasküler ağların oluşumunu teşvik etmektedir.

Protokol

Burada protokol katmanlı aljinat mikro (Şekil 1) oluşturmak için üç aşamalı bir yordam açıklanır. İlk olarak, aljinat, mikro-küreler (Şekil 2A) oluşturulmaktadır. Bu prosedür, aşağıdaki bölümde 1 'de tarif edilmektedir. Hücreleri ya da proteinler bir dağıtım sistemi olarak hareket etmek için, bu aşamada mikroboncukları eklenebilir. Bir sonraki adım mikroboncukları bir permselective tabakasının oluşturulmasını içerir ve 2. bölümünde tarif edilmiştir. Son adım ek bir aljinat tabakasının oluşturulmasını içerir ve bölüm 3'te tarif edilmektedir. Boncuklar yüzeyi (Şekil 2B) dış kısmında, bu tabaka formları sistemi aşağıdaki nakli için hücresel tepkidir yönlendirmek için terapötik molekülleri (Şekil 2C) saklanması ve sağlamak için kullanılabilir.

1. Aljinat microbead Hazırlık

1. 1 mL LVM aljinat 15 gram eritilmesi ile bir% 1.5 (w / v) LVM aljinat çözeltisi hazırlayıniç tabaka aljinat çözeltisi (pH 7.4 'e ayarlanır DI su içinde 25 mM HEPES tampon, 118 mM NaCI, 5.6 mM KCI, 2.5 mM _MgCl2,). Aljinat gücü tamamen açık, viskoz bir çözüm oluşturmak için çözünmüş kadar bir Vortexer üzerinde karıştırın. Not: Bu protokol aljinat mikrokapsüller içinde adacık encapsulation için en uygun koşulları açıklar ¹ konsantrasyon ve aljinat mikroküreler kompozisyonu diğer uygulamalar (örneğin ilaç dağıtım, doku mühendisliği, vb) Not özelliklerini ayarlamak için değiştirilebilir. Adacık kapsülleme için adacıklar önceden microencapsulator olarak yüklenmesi için bu aşamada aljinat çözeltisine ilave edilebilir.
2. 100 mM _CaCI2 ve DI su içinde 10 mM HEPES tampon çözücü ve pH 7.4 'e ayarlayarak çapraz bağlayıcı çözelti (DI su içinde 22 mM _CaCl2) hazırlayın. Not: Br ² gibi başka iki değerlikli katyon ^+, Sr ^{2 + +} gibi, aljinat jelleşme d doğasına bağlı olarak yerine Ca ² kullanılabilmektediresired.
3. Bir şırınga için 25-gauge iğne ekleyerek ve iğne hava yeleği merkezinde olduğundan emin olmak için her iki tarafta vanalar ayarlamak tarafından iki kanallı hava yeleği aljinat microencapsulator ayarlayın. Farklı mastar iğnelerin hedeflenen aljinat mikroboncuk boyutuna bağlı olarak, bu adım için kullanılabilir.
   Bu aşama, aynı zamanda, bir şırınga ile yapılabilir, bir microencapsulator mevcut olmamalıdır. Şırıngaya aljinat çözeltisi ekleyin ve istenilen mikroboncuk boyutuna göre bir iğne gösterge seçin.
4. Doğrudan iğne altında çapraz bağlayıcı çözelti 10 mL içeren bir şişeye yerleştirin. Çözelti içinde bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
5. Mikro-küreler oluşturmak üzere aljinat çapraz bağ amacıyla _CaCI2 çözeltisi içine doğrudan damlacıklar enjekte edilir. Sürekli karıştırılarak, en az beş dakika boyunca tedavi etmek çapraz bağlayıcı çözelti içinde boncuklar inkübe.
6. Bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne boncuklar transfer edin. , Artık çözelti çıkarınve iki dakika her biri için normal tuzlu su çözeltisi içinde% 0.2 _CaCI2 ile üç yıkama gerçekleştirmek.

2. Poli-L-ornitin ile kaplama mikroboncukları

1. Normal serum fizyolojik içinde poli-L-ornitin (FKÖ) bir% 0.1 (w / v) çözeltisi 3 mL hazırlayın. Tamamen açık bir çözeltisinin oluşturulması, eriyene kadar bir girdap üzerine çözeltisi yerleştirin. Poli-L-lisin (PLL) seçici geçirgenliğe benzer seviyeleri ile sonuçlanır Bu adımda, bunun yerine FKÖ'nün kullanılabilir.
2. FKÖ çözüm içine aljinat mikroküreler aktarın. FKÖ yeterli zaman polikatyon-polianyon kompleks oluşturarak, aljinat ile etkileşim sağlamak için 30 dakika boyunca bir vorteks koyun. 30 dakika sonunda, aljinat, mikro-küreler etrafında belirgin bir görünür beyaz kaplama olması gerekir.
3. FKÖ çözüm çıkarın ve iki dakika her biri için normal salin% 0.2 _CaCl2 ile üç yıkar gerçekleştirin.

3. Dış Aljinatta oluşturma Layer

1. Dış katman oluşturmak için kullanılacak olan istenilen konsantrasyonu bir aljinat çözeltisi hazırlayın. (1,1) 'da anlatıldığı gibi solüsyonu hazırlanır. Dış tabakasının boyutları (Şekil 3) kullanılan aljinat bileşimi ve konsantrasyonu tarafından etkilenir.
2. Bir hücre-süzgeç için aljinat mikroküreler aktarın. Mikroküreler mümkün olduğunca kurutmak için fazla çözüm emmek için bir Kimwipe kullanın.
3. Bir parafilm yüzeye mikro aktarın. Arzu edilirse, cam ya da plastik Petri tabağı gibi diğer düz yüzeyler, parafilm için ikame edilebilir.
4. Aljinat mikroküreler üzerine (3.1) hazırlanan aljinat çözüm aktarın. Aljinat çözeltisi hacmi tamamen aljinat mikroküreler kapsamalıdır edilebilir. Mikro-küreler 45 dakika boyunca aljinat çözelti içinde kalmasını sağlar.
5. Mikroküreler bağlı olmayan aşırı aljinat çözüm çıkarmak için bir pipet kullanın.
6. Içinde mikro-küreler aktarmak22mm _CaCI2 içindeki bir çözeltisine. Bu, farklı dış aljinat tabakasının oluşumu ile sonuçlanarak, mikro-küreler etrafında aljinat çözeltisi çapraz bağlar.
7. Iki dakika her biri için serum fizyolojik _CaCI2 22 mM üç yıkama yapın. Mikroskop altında mikro görüntüleniyor çekirdek microbead etrafında oluşan görülen ayrı bir dış aljinat kat için izin vermelidir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. Çok katmanlı aljinat, mikro-küreler oluşturmaya yönelik prosedürün şematik. Khanna ve ark izniyle. J Biomed Mater Res A. Kasım; 95 (2), 632-40 (2010).

Şekil 2,. (A) ve (B) aljinat mikroboncuk faz kontrast görüntülerdir. (A) 'a microbead gösterirsonra, Sentez, aşama (1,7), (B) adım (3,7) tamamlanmasından sonra, mevcut farklı bir dış tabaka aljinat gösterir iken. (C) dış tabaka içinde kapsüllenmektedir floresan-etiketli BSA bir protein FITC görüntüsüdür. Khanna ve ark izniyle. J Biomed Mater Res A. Kasım; 95 (2), 632-40 (2010).

Şekil 3. Dış aljinat tabakasının boyutları kullanılan aljinat bileşimi ve konsantrasyonuna dayalı çeşitlendirilebilir. Bizim sonuçlarımız LVM ve LVG aljinat her ikisi için, artan aljinat konsantrasyonu ile dış tabaka boyutu artar ve bu LVG aljinat eşit konsantrasyonlarda LVM aljinat daha kalın dış katmanları verir, göstermektedir. Khanna ve ark izniyle. J Biomed Mater Res A. Kasım; 95 (2), 632-40 (2010).

Şekil 4. FGF-1 salınması, LVM ve LVG aljinat kullanılan bir konsantrasyon göre değiştiği dış tabakadan aljinat, bir büyüme faktörü anjiyojenik proteini. (A) ve (B) göstermektedir oranında salınma ve (C) ve (D) farklı bir dış tabaka formülasyonlar için zaman karşısında FGF-1, karşılık gelen yığın yayın temsil eder. Bir patlama ilk 5 h (A ve C) içindeki tüm koşulları için sergilenen bırakma ve 30 güne kadar düşük doz sürekli sürüm (B ve D) vardır. Khanna ve ark izniyle. J Biomed Mater Res A. Kasım;. 95 (2), 632-40 (2010) büyük rakamı görmek için buraya tıklayın .

Tartışmalar

Aljinat yosunu çıkarılan ve 1,4 '-β-D-mannuronic asit (M) ve α-L-guluronic asit (G) ^2,3 ünitelerinden oluşan bir doğal, asidik polisakkarittir. Basit jelleşme oluşur Ca ² gibi iki değerlikli katyonlar, ^+, Sr ^{2 +} ve Ba ^{2 +} bitişik aljinat zincirleri arasındaki iyonik köprü oluşturan G-monomerler ile etkileşim. Aljinat mikroküreler kondrosit, hepatosit dahil fibroblast büyüme faktörü-1 (FGF-1), sinir büyüme faktörü, lösemi inhibitör fak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Pronova Ultrapure LVG aljinat	Nova-Matrix	4200006	Aljinat formülasyonlar çeşitli mevcuttur. Aljinat tercih büyüklüğü de dahil olmak üzere mikroboncuk uç özellikleri, mekanik özelliklere, ve nakil etkiler. Kullanılan bileşimi verilen bir uygulama için optimize edilmesi gerekmektedir.
Pronova Ultrapure LVM aljinat	Nova-Matrix	4200206	Aljinat formülasyonlar çeşitli mevcuttur. Aljinat tercih büyüklüğü de dahil olmak üzere mikroboncuk uç özellikleri, mekanik özelliklere, ve nakil etkiler. Kullanılan bileşimi verilen bir uygulama için optimize edilmesi gerekmektedir.
Poli-L-ornitin hidroklorür	Sigma-Aldrich	P2533