바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 알긴산 Microspheres의 생성

요약

다음 섹션에서 우리는 생명 의학 애플 리케이션에서 사용할 수 알지네이트요 microspheres의 준비 절차를 설명합니다. 우리는 특히 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로서 세포 및 단백질 캡슐의 이중 목적 multilayered 알지네이트요 microspheres를 만들기위한 기술을 설명합니다.

초록

알긴산 기반의 자료가 있기 때문에 그들의 친수성 ​​자연, biocompatibility, 물리적 아키텍처 생명 의학 애플 리케이션에 상당한 주목을 받았습니다. 응용 프로그램은 세포 캡슐, 약물 전달, 줄기 세포 배양 및 조직 엔지니어링 공사장 공중 발판을 포함합니다. 실제로 임상 시험은 현재 islets는 유형 I 당뇨병의 치료로서 PLO 코팅 알지네이트요의 microbeads에 캡슐되는 수행되고있다. 그러나, islets 많은 수의는 가난한 생존 다음의 이식에 의한 효능 필요합니다. 로컬 캡슐 세포 주위 microvascular 네트워크 형성을 자극하는 능력은 산소, 포도당 및 기타 필수 영양소 개선된 교통 수단을 통해 그들의 생존을 증가시킬 수 있습니다. Fibroblast 성장 인자-1 (FGF-1)은 혈관 형성을 자극하고 허혈성 조직의 산소 수준을 향상시킬 수 자연스럽게 발생하는 성장 인자이다. 그것이 sust으로 전달되었을 때 FGF-1의 효능이 향상됩니다오히려 하나의 대형 bolus 행정부보다 ained 패션. 섬 캡슐 시스템의 성장 요인의 지역 장기 릴리스는 잠재적으로 기능성 그래프트 결과를 개선, 이식된 세포를 향해 직접적으로 혈관의 성장을 자극 수 있습니다. 이 문서에서 우리는 생명 의학 애플 리케이션에서 사용할 수 알지네이트요 microspheres의 준비 절차를 설명합니다. 또한, 우리는 multilayered 알지네이트요의 microbeads를 생성용으로 개발된 방법을 설명합니다. 세포는 외부 알지네이트요 계층의 내부 알지네이트요 코어, 그리고 angiogenic 단백질에 캡슐 수 있습니다. 이 외부 레이어에서 단백질의 릴리스는 이식된 islets 향해 직접 현지 microvascular 네트워크의 형성을 자극합니다.

프로토콜

여기서 프로토콜 multilayered 알지네이트요의 microbeads (그림 1)을 생성하는 3 단계 절차를 설명합니다. 첫째, 알지네이트요의 microbeads은 (그림 2A) 형성됩니다. 이 절차는 아래 섹션 1에 설명되어 있습니다. 세포 또는 단백질이 전달 시스템의 역할을하기 위해이 단계에서 microbeads에 추가할 수 있습니다. 다음 단계는 microbeads에 permselective 레이어의 형성을 포함하고 섹션 2에 설명되어 있습니다. 마지막 단계는 추가 알지네이트요 계층의 형성을 포함하며 제 3에 설명되어 있습니다. 구슬의 표면 (그림 2B)의 외부에이 레이어 형태는 시스템에 다음과 이식에 대한 세포 반응을 지시하는 치료 분자를 (그림 2C) 캡슐 및 전달하는 데 사용할 수 있습니다.

1. 알긴산의 Microbead 준비

1. 1 ML에서 LVM의 알지네이트요의 15 그램을 해소하여 1.5 % (W / V) LVM의 알지네이트요 솔루션을 준비내부 레이어 알지네이트요 솔루션 (산도 7.4로 조정 DI 워터에서 25 밀리미터 HEPES 버퍼, 118 MM NaCl, 5.6 MM KCl, 및 2.5 밀리미터 MgCl _2). 알지네이트요 전원이 완전히 투명, 점성 용액을 형성 해산 때까지 Vortexer에 섞는다. 참고 :이 프로토콜은 알지네이트요의 microcapsules 이내 섬 캡슐을위한 최적의 조건을 설명 ^한 농도와 알지네이트요 microspheres의 성분이 다른 응용 프로그램 (예, 약물 전달, 조직 공학 등)주의에 대한 속성을 조정 변경될 수 있습니다. 섬 캡슐 들어 islets 이전 microencapsulator에 로딩이 단계에서 알지네이트요 솔루션에 추가할 수 있습니다.
2. 100 MM CaCl ₂ 및 DI 워터에서 10 밀리미터 HEPES 버퍼를 용해하고 pH를 7.4로 조정하여 crosslinking 솔루션 (DI 워터 22 MM CaCl _2)를 준비합니다. 참고 사항 : ^BR이 같은 다른 이가의 양이온은 ^+, 시니어 ^{2 +} 등 ⁺ 알지네이트요 겔화 D의 특성에 따라 대신 칼슘 ² 사용될 수esired.
3. 주사기에 25 게이지 바늘을 추가하고, 바늘이 공기 재킷의 중심에 있는지 확인하기 위해 양옆의 밸브를 조절하여 2 채널 에어 자켓 알지네이트요의 microencapsulator를 설정합니다. 다른 게이지 바늘이 대상 알지네이트요의 microbeads의 크기에 따라이 단계에 사용될 수 있습니다.
   이 단계도 주사기로 수행할 수 microencapsulator를 사용할 수 없습니다. 주사기로 알지네이트요 솔루션을 추가하고 원하는 microbeads의 크기에 따라 바늘 게이지를 선택합니다.
4. 직접 바늘 아래 crosslinking 솔루션의 10 ML이 들어있는 플라스크를 놓습니다. 솔루션 볶음 막대를 놓습니다.
5. microbeads를 형성 알지네이트요를 crosslink하기 위해 CaCl ₂ 용액에 직접 방울을 주입. 계속 저어으로, 적어도 15 분간 치료 crosslinking 솔루션의 구슬을 품어.
6. 15 ML의 원심 관에 비즈를 전송합니다. , 잔류 용액을 제거두 분마다 정상 생리 식염수에 0.2 % _CaCl의이 세 가지 세차장을 수행합니다.

2. 폴리-L-ornithine과 코팅 Microbeads를

1. 정상 식염수에있는 폴리-L-ornithine (PLO)의 0.1 % (W / V) 솔루션 3 ML을 준비합니다. 그것이 완전히 명확한 솔루션을 형성 해산되기 전까지 와동에 솔루션을 놓습니다. 폴리-L-라이신 (PLL)는 permselectivity 비슷한 수준의 결과를이 단계를 위해 대신 PLO에 사용될 수 있습니다.
2. PLO 솔루션으로 알지네이트요의 microbeads를 전송합니다. PLO 충분한 시간이 polycation-polyanion 복합을 형성 알지네이트요과 상호 작용할 수 있도록 30 분 소용돌이에 장소. 30 분 말에, 알지네이트요 microbeads의 주위에 분명히 보이는 흰색 코팅도 있어야합니다.
3. PLO 솔루션을 제거 두 분마다 정상 식염수에 0.2 % _CaCl의이 세 가지 세차장을 수행합니다.

3. 바깥 알긴산을 만드는 것은 때려치어

1. 외부 레이어를 만드는 데 사용되어야하는 원하는 농도 알지네이트요 솔루션을 준비합니다. (1.1) 상기에 설명된대로 솔루션은 준비가되어 있습니다. 외부 레이어의 크기는 (그림 3) 사용 알지네이트요의 조성과 농도에 의해 영향을받습니다.
2. 셀 - 스트레이너로 알지네이트요의 microbeads를 전송합니다. microbeads 가능한 건조하기 위해 여분의 용액을 흡수할 수 있도록 Kimwipe을 사용합니다.
3. Parafilm 표면에 microbeads를 전송합니다. 원하는 경우 이러한 유리 또는 플라스틱 배양 접시와 같은 다른 부드러운 표면은 Parafilm에 대한 대체하실 수 있습니다.
4. 알지네이트요의 microbeads에 (3.1)에서 준비 알지네이트요 솔루션을 전송합니다. 알지네이트요 솔루션의 볼륨이 완전히 알지네이트요의 microbeads를 충당해야한다. microbeads 45 분 알지네이트요 솔루션 유지합시다.
5. microbeads에 바인딩되지 과잉 알지네이트요 솔루션을 제거하는 피펫을 사용합니다.
6. 에 microbeads를 전송22mM CaCl ₂ 용액 있습니다. 이것은 별개의 외부 알지네이트요 계층의 형성 그 결과 microbeads 주위 알지네이트요 솔루션을 crosslinks.
7. 이분 각각 정상 식염수에 CaCl ₂ 22 밀리미터 든 세 세차장을 수행합니다. 현미경 microbeads을 관찰 하는게 핵심 microbead 주위에 형성된 볼 수있는 뚜렷한 외부 알지네이트요 층 수 있도록해야합니다.

4. 대표 결과

그림 1. multilayered 알지네이트요의 microbeads를 만드는 절차의 개략도. Khanna 외로부터 허가를 재현. J Biomed Mater 해상도 A. 11월, 95 (2), 632-40 (2010).

그림 2. ()와 (B)의 알지네이트요 microbeads의 위상 콘트라스트 이미지입니다. () microbead을 보여줍니다이후 합성 단계 (1.7), (B) 단계 (3.7)을 마친 후 현재 뚜렷한 외부 알지네이트요 레이어를 표시하면서. (C) 외부 계층에 캡슐 fluorescently-라벨 BSA 단백질의 FITC 이미지입니다. Khanna 외로부터 허가를 재현. J Biomed Mater 해상도 A. 11월, 95 (2), 632-40 (2010).

그림 3. 외부 알지네이트요 레이어의 크기는 사용 알지네이트요의 조성과 농도를 기반으로 다양한 수 있습니다. 우리의 결과는 LVM과 LVG의 알지네이트요 모두를 위해 증가 알지네이트요 농도와 외부 레이어의 크기 증가, 그 LVG 알지네이트요가 동일 농도에서 LVM의 알지네이트요보다 두꺼운 아우터 레이어를 얻을, 것을 보여줍니다. Khanna 외로부터 허가를 재현. J Biomed Mater 해상도 A. 11월, 95 (2), 632-40 (2010).

그림 4. FGF-1의 출시, LVM 및 LVG의 알지네이트요 사용의 농도를 기반으로 다양한 외부 알지네이트요 계층에서 angiogenic 성장 인자 단백질. (A)와 (B) 쇼 퍼센트 릴리스, 그리고 (C)와 (D) 다른 외부 레이어 공법 시간 대 FGF-1의 해당 대량 릴리스를 나타냅니다. 버스트 초기 5 H (A와 C) 이내에 모든 조건을 위해 전시 발표하고, 최대 30 일 대한 낮은 선량 연속 릴리스 (B와 D)이 있습니다. Khanna 외로부터 허가를 재현. J Biomed Mater 해상도 A. 11월;. 95 (2), 632-40 (2010) 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

토론

알긴산은 해조류에서 추출 및 1,4 '-β-D-mannuronic 산 (M)와 α-L-guluronic 산성 (G) ^2,3 단위로 구성되어 자연, 산성 다당류이다. 단순 겔화가 발생했을 때 같은 ^칼슘이 같은 이가의 양이온, ^+, 시니어 ^{2 +,} 또는 바 ^{2 +} 인접 알지네이트요 체인 사이의 이온 가교를 형성 G-단량체와 상호 작용. 알지네이트요의 Microbeads은 chondrocytes, hepatocytes를 포함한 fibroblast의 성장 인...

자료

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Pronova Ultrapure LVG의 알지네이트요	노바 - 매트릭스	4,200,006	알지네이트요 공법의 종류가 있습니다. 알지네이트요의 선택은 크기를 포함하여 microbeads 끝 특성, 기계적 특성 및 전송에 영향을 미칩니다. 사용된 구성은 주어진 응용에 최적화된해야합니다.
Pronova Ultrapure LVM의 알지네이트요	노바 - 매트릭스	4,200,206	알지네이트요 공법의 종류가 있습니다. 알지네이트요의 선택은 크기를 포함하여 microbeads 끝 특성, 기계적 특성 및 전송에 영향을 미칩니다. 사용된 구성은 주어진 응용에 최적화된해야합니다.
폴리-L-ornithine 하이드로 클로라이드	시그마 - 올드 리치	P2533