CYP2D6 Hayvan Modeli:, Fare Otoimmün Hepatit indükleyin nasıl

Özet

Adenovirüs ile temel insan otoantijen ifade farelerin Enfeksiyon, CYP2D6 geniş hepatit, fibrozis ve kuşak tarafından karakterize otoimmün aracılı karaciğer hastalığı kalıcı bir form Tip 2 otoimmün hepatit sonuçları muzdarip hastaların sera tarafından tanınan P450 2D6 (hCYP2D6) sitokrom -belirli bir bağışıklık yanıtı.

Özet

Otoimmun hepatit, nedeni bilinmeyen, ^1,2 karaciğer nadir fakat hayatı tehdit eden otoimmün bir hastalıktır. , Geçmişte bir pek çok girişimlerine In profilini iyileştiren,,,,,, insan hastalığı ^(3-5) of karakteristik özellikleri yansıtıp yansıtmadığını, bir hayvansal modeli üretmek etmek Yaptı> edilmiştir> adres. Bununla birlikte olarak,, çeşitli modeller in, hastalığı of indüksiyon daha ziyade karmaşık idi ve: sık sık hepatit ^3-5 sadece transient idi. Bu nedenle, Tip 2 otoimmün hepatit (AİH-2), yani hCYP2D6, ⁶ gibi bir tetikleyici en önemli insan otoantijen kullanan basit bir fare modeli geliştirdik. HCYP2D6 tanıma Tip 1 karaciğer-böbrek mikrozomal antikor (LKM-1) antikorlar AİH-2 ^7,8 işaretidir. Wild tip FVB veya C57BL / 6 farelerde içine teslim hCYP2D6 karaciğer tetiklenmesi antijen doğrudan teslim edilmesini sağlayan bir Adenovirüs construct (Ad-2D6) oldu. Böylece, takip eden yerel inflamasyon, otoimmünite sonraki gelişmesi için verimli bir alan ⁹ oluşturur. Bir cAd-2D6 intravenöz ve intraperitoneal ombination karaciğer uzun ömürlü otoimmün hasarı (bölüm 1) ikna etmek için en etkili yoludur. Burada karaciğer hastalığı, CYP2D6 modeli indüklenir ve nasıl karaciğer hasarının farklı yönlerini nasıl tespit edilebilir otoimmün ayrıntılı bir protokol sağlar. Birincisi, hepatosit gibi aminotransferazlar yıkımı, yanı sıra hCYP2D6 antikor titreleri gösteren belirteçlerin serum düzeyleri kan retroorbitaly (bölüm 2) örnekleme yoluyla belirlenir. Second olarak, hCYP2D6-spesifik bir bir, hala devam eden T bir hücre yanıtı,,,, spleen ve karaciğer from lenfositleri toplamaya kullanıcısı tarafından karakterize edilen edilir. Saf karaciğer lenfositler elde etmek için, ciğeri kollajen sindirilir ve bir Percoll degrade (Bölüm 4) üzerinden arıtılmış portal ven (bölüm 3), ile PBS ile perfüze. , HCYP2D6-spesifik bir T hücreleri of frekans,, hCYP2D6 peptidler, ve, flow sitometri tarafından - IFNγ-üreten hücreleri (bölümünde sık kullanılan 5) of tanımlama ile birlikte daha fazla stimülasyon kullanıcısı tarafından analiz edilir. Üçüncü olarak,hücre infiltrasyonu ve fibrozis, karaciğer bölümler (bölüm 6) immünohistokimyasal olarak tespit edilmiştir. Böyle bir analizi bir rejim ile,,,,,,, modeli of, kronik bir bir doğa kanıtlamak etmek sipariş in,,, hastalığı of inisiyasyon sonra birkaç Zamanlar at yürütülmüştür uygulanmaz etmek sahiptir. ,,,,, Frekans ve aktivitesi,, hCYP2D6-, belirli bir T ve / ya da Yatak-hücreleri of ve karaciğer damage gibi mi ve fibrosis of mi derecesi kullanıcısı tarafından karakterize edilen bağışıklık bir yanıtı of magnitude,,,,, önlemek, geciktirmek ya da, autodestructive FESHETME etmek, mümkün olan tedaviler of, bir müteakip bir bir değerlendirmenin için değerlendirilecektir uygulanmaz etmek var , karaciğer of süreç.

Protokol

1. , Oftalmik sinüs içine Ad-2D6 intravenöz enjeksiyon

1. Steril koşullar altında, bir konsantrasyon 5 Ad-2D6 virüs stok solüsyonu sulandırmak x 10 ⁹ pfu / ml RPMI ve buz üzerinde Ad-2D6 virüs çözümü tutmak. 5 x 10 ⁸ pfu (intravenöz ve intraperitoneal) iki doz enjeksiyon farelerde FVB suşu otoimmün hepatit en güvenilir sonuç neden olduğu kanıtlanmıştır.
2. Anestezi odasına izofluran% 4 ile fare uyutmak. Hayvanın anestezi olduğundan emin olmak için arka bacak sıkıştırın.
3. Boynun arka tarafından fare tuşunu basılı tutun ve başparmak ve orta parmak ile baş gevşek deri sıkın. Bu beğendiniz mi,, gözün,,,, eye etmek bitişik cilt bilgi etmek, çekiş gücü kullanıcısı tarafından hafifçe doğru çıkıntı yapan.
4. Iğne, medial canthus (hayvanın burnu ile yakın göz kapaklarının kavşağı) içine dikey olarak yerleştirin ve yavaş yavaş 100 ml Ad-2D6 virüs çözümü enjekte. Çok fazla baskı uygulamak için önemli değildir,damarları ve nefes borusu hasarı önlemek.
5. Yavaşça dökülmesini önlemek ve göz kapaklarını kapatmak için iğneyi.
6. Virüs çözümü burun oluğu dışarı sızıntı değildir ve göz başlangıç ​​pozisyonuna geri slaytlar Enjeksiyon iyi çalıştı.
7. , Immediately intravenöz (İV) bir enjeksiyon izleyerek,,, Reklam-, 2D6 bir virüs bir çözüm of ikinci bir bir bir-100 mikrolitre of, bir standart bir bir bir bir intraperitoneal olarak bir enjeksiyon gerçekleştirdiğinizde.

Alternatif olarak, intravenöz (İV) bir enjeksiyon,,,,, tail ven via yürütüldüğünde uygulanmaz edebilirsiniz. Bununla birlikte,, oftalmik sinus via enjeksiyon,, gerçekleştirmek için çok daha kolaydır ve, virüs bir çözüm of kaybı en aza indirir. It, bu iki adet teknikleri birbirinin yerine olarak ve her ikisi de rotalar, ¹⁰ eşit derecede etkili şunlardır olduğunu bir kullanılan uygulanmaz edebilirsiniz olduğunu, göstermiştir> edilmiştir> gelmiştir.

Enfekte fareler, yan etkileri ve acı ve ağrı belirgin işaretler, iştah kaybı, kilo kaybı, hareket kaybı, başarısızlık damat, kaba tüy örtüsü gibi izlenir hunchedgörünümü yanı sıra, yalama, ısırma, tırmalama ya da belirli bir alanda (örneğin enjeksiyon sitesi) sallayarak. Farelerde, CYP2D6 model karaciğer için büyük bir hasar göstermekle birlikte, fareler sağlıklı görünüyor ve herhangi bir acı, ağrı veya stres belirtileri gösteriyor. Bununla birlikte, göstergeler, serum aminotransferazlar gibi ciddi karaciğer yetmezliği, düzenli bir şekilde tespit edilmesi veya yapılan deneylerin bir parçasıdır. > 1000 U / l serum aminotransferaz seviyeleri sadece virüsün bulaşma doğrudan bir sonucu olarak görünür, ancak kronik gerekir. , Serum aminotransferase seviyeleri,, 1000 yukarıda kronik olarak şunlardır ederse, bu örnekleri incelemek U / l '(ciddiyeti limiti),, fareler sakrifiye uygulanır:.

2. Fare göz kanama

1. Anestezi odasına izofluran% 4 ile fare uyutmak. Hayvanın anestezi olduğundan emin olmak için arka bacak sıkıştırın.
2. Boynun arka tarafından fare tuşunu basılı tutun ve başparmak ve orta parmak ile baş gevşek deri sıkın. Bunun gibi, gözün biraz çıkıntı, eye etmek bitişik cilt bilgi etmek, çekiş gücü.
3. Göz ve yavaşça alt veya iç köşesinde kılcal tüp ucunu ama sıkıca, oftalmik venöz sinüs küresi ile birlikte kaydırdı. Venöz kılcal damarların yırtılması sonucu kanama orbita boşluğunu doldurur.
4. ,,, Olan birikmiş kan,, tüp içine çizilmiş edilir olduğunu, bu yüzden bahşiş boşaltmanız etmek Slightly uygun test laboratuarında kapiler bir tüp çekilmeye.
5. Yeteri kadar bir bir kan toplanan edilir Ne zaman,, tüp, içine kapanık ve, edeni göz kapaklarının seyirmesidir kapattı edilir. Kanama tüp ve venöz kompleks üzerine normal göz tansiyonu yeniden kazanılmasından geri çekilmesi üzerine durur.
6. Uygun test laboratuarında kapiler bir tüp in Blood,,, bir Microtainer tüp etmek,,,, buz üzerinde 30, min için aktarılmasına ve inkübe edilir.
7. The Microtainer tüp,,,, 4 ° C. at, 2 min için 7500 xg için at santrifüje tabi edilir
8. Supernatant,,,,, bir, taze bir tüp etmek aktarılmasına ve edilen,, -80 at depolanan edilir serum ° C. etmek tekabül eder.
9. Serum,,,,, - ELISA yöntemi kullanıcısı tarafından antikor titresi belirlemek etmek kullanılır uygulanmaz edebilirsiniz. Indicadeki Roche Diagnostics göre testi şeritler (Mannheim, Almanya) ve Reflotron Plus analizörü (kullanarak aminotransferaz alanin aminotransferaz (ALT / GPT) ve aspartat (AST / GOT) değerlendirilecektir karaciğer enzimlerinde serum düzeyleri gibi karaciğer hasarının Roche Diagnostics, Mannheim, Almanya).

Alternatif olarak, kan örneklemesi, kuyruk veni yoluyla veya yüzeyel temporal ven ¹¹ üzerinden yapılabilir.

3. Fare karaciğer perfüzyon

Not: Bu adım, kan lenfositleri izole karaciğer lenfositler kontaminasyonu önlemek açısından önemlidir.

1. Servikal dislokasyon ile CO ₂ öldürücü dozlarda fare Euthanize.
2. , Strafor kurulu sırtını üzerine koyarak hayvan monte edin. Ekstremitelerde pin 23 G iğne kullanın.
3. Nemlendirmeniz ve, 70% EtOH ile birlikte için fare dezenfekte edin.
4. Arka ayakları uzak yaklaşık 1 cm üzerinden bir kesi yapmak.cilt ve kas tabakası. ,,, Diyaframın 'etmek up çalışan,, hayvansal of her ikisi de iki tarafın on Kes'i.
5. ,, Diyaframın ulaşıldığında edilir Ne zaman,, cilt geriye doğru olarak biçimde döndürülebiliyorlar, uygulanmaz edebilirsiniz.
6. Diyafram akıntılar uzak kesin sonra vena kava kesti.
7. Portal ven açığa tarafına mide ve bağırsakları hareket ettirin.
8. Soğuk PBS ile dolu bir 5 ml şırınga bağlı 27 G iğne ekleme portal ven. PBS yavaş karaciğer kan yıkayın.
9. ,,, Diyaframın üzerine kapma ve,, vücut from away diyaframın kesme kullanıcısı tarafından karaciğer parçalara ayır.
10. Petri karaciğer aktarın ve diyafram kaldırmak, safra kesesi ve herhangi başka bir dokusunu hala karaciğere bağlı
11. ,,, Buz on, bir 50 ml 'tüp in, 10 ml' PBS etmek karaciğer Devret ya da Ekim bileşik, in embed.

4. , Karaciğer lenfositleri of Isolation

1. Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın:
   • Kollajenaz IV stoku (100 mg / ml) in PBS. (-20 ° C'de küçük alikotları ve mağaza olun).
   • PBS içinde seyreltin. - DNase hisse senedi (25, mg / ml '') uygulamasının etkileri araştırıldı. (-20 ° C'de küçük alikotları ve mağaza olun).
   • Collagenase buffer:, PBS 0,2 mg: /, ml 'collagenase IV, 0,02, mg / ml' DNase ve% 5 FCS ihtiva eden,;, 1 karaci ¤ er için,, 9,5 ml ',, ice-soğuk algınlığı PBS, karıştırmayınız 20, mikrolitre collagenase IV (-100 mg / ml' hisse senedi), 8 mikrolitre DNase (, 25 mg / ml stok) ve 500 ul ısı ile inaktive edilmiş FCS.
   • % 35 Percoll karışımı 175 ml Percoll, 20 ml 10 x PBS stok; 305 ml PBS.
   • RPMI _komple = RPMI% 10 oranında, ısı-inaktive edilmiş FCS,-100 μ / ml 'penisilin,-100 ug / ml streptomisin ile korunurlar., Seç 2 mM L-glutamin göstermek ihtiva eden.
2. Buz üzerinde bir petri 10 ml taze PBS perfüze karaciğer (bkz. Bölüm 3) aktarın ve makas kullanırken küçük parçalar halinde kesin.
3. Bir bardak havaneli veya 2 ml şırınga bir havaneli ile 70 mikron hücre süzgeç ve sıkma karaciğer yelkenli içine aktarın. 10 ml soğuk kollajenaz tampon ve dikkatlice ekleyinsüzgecinden basın. Süzgecinden süspansiyon ve filtre iki kat daha fazla toplayın.
4. Buz üzerinde taze 50 ml tüp süspansiyon aktarın. Sonraki karaciğer işleyin.
5. 37 ° C'de 60 dakika inkübe karaciğer hücre süspansiyonu, her 15 dakikada bir hafifçe karıştırın.
6. , 4 ° C. at, 3 min için 30, xg için at santrifüjleyin..
7. Pelet 5 mm üstünde sıvı bırakarak, yeni bir tüp süpernatant aktarın
8. , 4 ° C. at, 10 min için 650 xg için at santrifüjleyin..
9. Pelet yukarıda 3 mm bırakarak, süpernatant atın
10. 20, ml 'Percoll buffer in Pastör pipetiyle pelletini
11. , 4 ° C. at, 20, min için 600 xg için at santrifüjleyin..
12. Tüp Flicking tarafından süpernatant ve Pastör pipetiyle pelet atın.
13. PBS ile pelet 1 x yıkayın.
14. _Tam RPMI pelet 1 x yıkayın
15. Pastör pipetiyle pelet 3 ml RPMI _tamamlamak ve 1:10 seyreltme hücreleri saymak.
16. _Tamamlamak, RPMI ~ 10 ⁷ hücre / ml Pastör pipetiyle hücreleri ve buz tüp transfer.

5. Hücre içi sitokin boyama (ICCS)

5.1 Uyarım:

1. ,, # Tarif edildiği gibi _komple RPMI bölgesindeki, ~ 10 ⁷ hücreleri / ml 'at karaciğer lenfositleri hazırlayın. Plaka 100 ul (10 ⁶ hücre) / doku kültürü tedavi edilmezse düz bir 96 plaka içine.
2. 50μl RPMI ekle 2μg/ml Brefeldin içeren _tamamlamak ve daha sonra eklemek 50μl RPMI 2 mcg / ml uyararak CYP2D6 peptid içeren ^komple (yani immünodominant CD4 epitop CYP2D6 _41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ ¹² veya immünodominant CD8 epitop CYP2D6 _193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG ^12). Pipetleme ile karıştırın.
3. 5 saat boyunca inkübe 37 ° C (optimum stimülasyon zaman ama gece boyunca inkübasyon yanı çalışır).

5.2. Boyama:

1. Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın:
   • FACS tamponu: PBS% 1 fetal buzağı içerenerum (FCS) ve.
   • Tespiti / permeabilization tampon:% 0,1 saponin ve% 4 paraformaldehite içeren FACS tampon
   • FACS / saponin yıkama tamponu:% 0,1 saponin içeren FACS tampon
   • FACS / PFA buffer: FACS buffer,% 1 oranında paraformaldehite (PFA) ihtiva eden
2. , V-bottom için bir mikrotiter plate ile (96-well) içine hücreleri Devret. Ve, 4 Şuna, 3 min için 460 xg için at spin ° C. Orta ve vorteksi plaka atın
3. 150 ul FACS tampon ve santrifüj ekleyin 3 dakika boyunca 460 xg'de 4 ° C Orta ve vorteks plaka atın. Yineleme adım yıkayın.
4. ,,,, 15,,, 4 ° C at min ve yıkamak (2) toplam 150 mikrolitre boyanma arabelleği (buffer) ile x (Üyelik at 2 min için mesajların 460 xg için (bölgesindeki 1) FACS buffer ug / ml 'αCD16/32 kokteyl ve (FCR block) ile birlikte Block' yüzey FCR gerekli olan if (, ikincil bir antikorlar kullanarak ne zaman) 4 °. C).
5. Yüzey molekülleri, için Stain'i:. Ie Anti--CD8a-FITC mAb 10, ug /, 50 mikrolitre FACS buffer ° koyu renk in C daha az 30, - 4 at min için, in ml '.
6. 100 ul FACS ekle,,,,, 4 ° C. at 3 min için 460 xg at buffer ve spini
7. 150 ul FACS tamponu (3 dk 4 ° C ile 460 xg) hücreler 2 x yıkayın. Vorteks plaka.
8. ,, 10 min at RT, için-100 mikrolitre bir fiksasyonu / permeabilization buffer ile birlikte hücreleri geçirgenliği artar / adıma düzelt..
9. , 4 ° C. at, 7 min için 460 xg için at Spin. Fiksasyonu / permeabilzation adımları, hücrelerin genel yoğunluk değiştirirse bu yana, 7 dakika santrifüj zaman uzatmak için önemli olduğunu unutmayın. Vorteks plaka.
10. 2 x 150, ul FACS / saponin yıkama tamponu (7 dk 4 ° C ile 460 xg) yıkayın. Vorteks plaka.
11. Intrasellüler moleküllerinin var olması için Stain'i: ie Anti--IFNγ-PE mAb 10, 4 at (50) 30 min için,,, mikrolitre FACS / saponin wash buffer, in ug / ml '° C..
12. 7 dakika boyunca 460 xg'de 4 100, ul FACS / saponin yıkama tamponu ve spin ekle ° C
13. 150, ul FACS / saponin yıkama tamponu (7 dk 4 ° C ile 460 xg) hücreler 2 x yıkayın. Vorteks plaka.
14. Hücreleri yıkayın, FACS tamponu ile 1 x (7 dk 4 ° C ile 460 xg). Vorteks plaka.
15. 200 ul FACS / 4 PFA tampon, tüpler içine transferi, ve mağaza ° C de karanlıkta Pastör pipetiyle hücreler flow sitometri ile veri edinimi kadar. Biz normalde bir FACSCanto II veya FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Almanya) kullanın.

6. İmmünohistokimya

6.1. H & E boyama genel karaciğer patolojinin değerlendirmesi için:

1. Hasat, karaciğer, kuru buz üzerinde bir tek baz kalıp ve hızlı dondurma Doku-Tek OCT batırmayın.
2. 7 mikron karaciğer doku kesitlerinde -17 ayarlanmış bir Leica kriyostat kullanarak kesin ° C ve doku kesitlerinde SuperFrost Plus mikroskop üzerine monte edin. Mağaza slaytlar -20 ° C daha sonra kullanmak kadar.
3. ,, -20 ° C. at 15, min için -,, pre-soğutmalı, EtOH in cryosections adıma düzelt 10 dakika kurumasını bekleyin.
4. ,, Room sıcaklık at 2 min (- 6.1.13,,,, oda sıcaklığında at gerçekleştirilir uygulanır aşağıdaki adımları uygulayın, 6.1.5 'birbirine bağlanabilir) için distile su ile ¸ tıktan bölgesindeki 2 x yıkayın.
5. Için Meyer Hematoksilen çözüm Leke8 dk.
6. Ilık in yıkayın (30, ° C) tap su 10 min için. Su birkaç kez değiştirin.
7. Distile, lisans su in durulayın.
8. , 20 sec için, 95% EtOH in durulayın.
9. 40 sn için Eosin G / Y çözeltisi Counterstain.
10. ,, Inkübasyon başı gecelik 5 min için 95% EtOH in 2 x sulandirip dehidratize.
11. ,, Inkübasyon başı gecelik 5 min için-100% EtOH in 2 x sulandirip dehidratize.
12. , Takas başına 5 dakika boyunca, ksilen 2 x temizleyin.
13. Roti-Histokitt monte edin.

6.2. Kollajen I depozisyonu için İmmünohistokimya:

1. Hasat karaciğer, Doku Tek OCT bırakın. kuru buz üzerinde bir tek baz kalıp ve hızlı dondurma.
2. 7 mikron karaciğer doku kesitlerinde -17 ayarlanmış bir Leica kriyostat kullanarak kesin ° C ve doku kesitlerinde SuperFrost Plus mikroskop üzerine monte edin. Mağaza slaytlar -20 ° C daha sonra kullanmak kadar.
3. ,,, -20 ° C. at 15, min için soğuk algınlığı EtOH in cryosections adıma düzelt. 10 dakika kurumasını bekleyin.
4. ,,, Oda sıcaklığında at 2 min için PBS in 2 x yıkayın.
5. inkübe edin,, PBS içinde seyreltin. 0,3%: H Ç _{2, 2} ve,,, room sıcaklık at 10 min için 0,1% Na-azit, ihtiva eden.
6. ,,, Oda sıcaklığında at 2 min için PBS in 2 x yıkayın.
7. Üreticinin kurallarına göre bir avidin-biotin engelleme kiti ile engelleyin.
8. ,, Room sıcaklık at 30, min için, (10) PBS (FCS / PBS) 'in% FCS ile birlikte engelle'yi tıklatın.
9. The primer antikor,,,,, 10% FCS / PBS in 1:200 oranında seyreltildi edilir bir tavs ¸ an anti--için fare kollajen I antikor konumundadır. ,,, Oda sıcaklığında at 2 hrs için birincil bir antikor ile birlikte bölümlerde inkübe edin. -.
10. ,, Room sıcaklık at 4 min için bölümlerde, PBS içinde seyreltin. 3 x yıkayın.
11. ,, 1:500 'e kadar var biyotinile olmuş, anti-tavs ¸ an bir antikor ile yer sulandırınız ve, oda sıcaklığında at,, 1,5 hr için en bölümlerde ile birlikte inkübe edin..
12. ,, Room sıcaklık at 4 min için bölümlerde, PBS içinde seyreltin. 3 x yıkayın.
13. Color reaksiyon,,,, avidin-peroksidaz konjugatı ve,, üreticisine kullanıcısının Netlog'daki kullanılan yönergelere göre,, diaminobenzidin-hidrojen bir peroksit, ile birlikte sequential bir inkübasyon kullanıcısı tarafından elde edilen edilir.
14. Meyer Counterstain Oiçin, matoxylin bir çözüm 5 min,, room sıcaklık at 2 min için,, PBS in 2 x yıkamak ve Aquatex in monte edilir..

7. Temsilcisi Sonuçlar

Ad-2D6 indüklenen karaciğer hasarı iki ayrı aşama olan fareler enfeksiyon. , Enfeksiyon sonra, olanlar önce bir gün, In,, karaciğer of virüs enfeksiyon,,,,,, serum aminotransferase seviyeleri of, bir, akut bir artış,, hepatosite ölüm ⁽⁶⁾ of, bir indikatörü, neden olur. , Bu, olanlar önce,, akut bir evre,, hCYP2D6 of ekspresyonu of bağımsız olarak oluştuğunda, programa ve,, aynı zamanda,,,, bir boş bir bir kontrolü virüs (Reklam-Control) ya da,, yeşil renkli bir floresans protein (Reklam-GFP) eksprese eden, bir virüs ile birlikte enfeksiyon sonra, gözlemlenen uygulanmaz edebilirsiniz. Kontrast In,, ikinci bir evre,,,,, otoimmün bir-mediated ve,, tetiklemesini molecule (hCYP2D6) of ekspresyonu on bağımlı konumundadır. Bu otoimmün aşamada enfeksiyon sonrası 2-4 hafta içinde ortaya çıkar ve birkaç ay ⁶ için devam.

Şekil 1. CYP2D6 model. Wild tip FVB veya C57BL / 6 farelerinde Ad-2D6 (intravenöz ve intraperitoneal) ile iki doz enjekte edilir. ,,,, Ilgi çekici of, bir zamanlı At,, karaciğer ve serum toplanan uygulanır ve, karaciğer damage ve, hCYP2D6-,, belirli bir antikorlar ve T-hücreleri, of formasyonu için değerlendirilecektir.

Aşağıdaki özellikleri wild tip FVB veya C57BL / 6 fareleri CYP2D6 modeli Ad-2D6 enfeksiyon sonrası gelişen kalıcı otoimmün hepatit için karakteristik vardır: Birincisi, karaciğer bir aberrantly değiştirdi morfolojisi gösterir. Özellikle, karaciğer loblarında kaynaşmış, hiperplazik nodüller tüm karaciğer ve büyük bir kapsüler fibrozis (Şekil 2) görünür yayılmış görünür.

Şekil 2. Karaciğer morfolojisi. Tipik Ad-2D6 bağlı karaciğer hasarı hafta 4-enfeksiyon sonrası tespit. Bireysel karaciğer loblarında (ok başları) erimiş unutmayın. Hiperplazik nodüller tüm karaciğer (oklar) yayılmış görünür. HCYP2D6 ifade eden bir kontrol adenovirüs ile enfeksiyon, karaciğer morfolojisi üzerine etkisi yoktur.

İkinci olarak, kapsamlı ve kalıcı hücresel sızmaları Ad-Kontrol-enfekte Ad-2D6-enfekte olmuş fakat farelerde (Şekil 3A) karaciğerinin peri-portal ve parankimal bölgelerde görünür. Fibrozis ağırlıklı parankim (Şekil 3B) çıkıntılı bazı kollajen demetleri ile subkapsüler bölgede gelişir.

Şekil 3,. Karaciğer histolojisi A: H & E boyama hafta 4-enfeksiyon sonrası Ad-Denetim veya Reklam-2D6 ile enfekte FVB farelerin karaciğer dokusunda bölümünde. Mononükleer hücrelerinin önemli sızmaları (Ad-2D6 enfekte farelerde sadece unutmayıntek okları). Üçlü okları komşu portalı yolları arasındaki köprü karaciğer parankimi büyük hücresel sızmaları göstermektedir. B: Ad-2D6 veya Ad-kontrol enfeksiyon sonrası 4. haftada karaciğer fibrozu immünohistokimyasal gösterimi. Karaciğer bölümlerde,,,,,, bir, anti-kollajen I antikor kullanarak kollajen için boyand> edilmiştir> adres. Parankimi (tek oklar) ve infiltre eden hücreler (ok) büyük kümeler halinde çıkıntılı bazı demetleri ile karaciğer kapsül (üçlü oklar) altında kollajen kişiliktedirler birden fazla katmanı unutmayın. İki temsilcisi karaciğer kesitlerinde her bir durum için görüntülenir. Boyut çubukları: 100μm.

Üçüncü bir özelliği, insan LKM-1 antikorları ^6,13 benzer bir epitop özgüllük anti-CYP2D6 antikor titresi yüksek, nesil. ,, Son yorumlanan, hCYP2D6-spesifik bir CD4, ve CD8 adet T-hücreleri, karaciğer etmek ev olduğunu ağırlıklı olarak olarak oluşturulur uygulanır. Böyle bir - hCYP2D6-belirli bir T-hücreleri,,, immunodomi ile birlikte stimülasyon kullanıcısı tarafından algıladı uygulanmaz edebilirsiniznant hCYP2D6 peptidler ve bir hücre içi sitokin boyama (ICCS) (Şekil 4) ile, IFNγ ifade sonraki ölçüm. hCYP2D6-spesifik CD8 T hücrelerinin in vivo ¹² Ad-2D6-enfekte hedef hücreleri öldürür.

Şekil 4. hCYP2D6-spesifik T hücrelerini hCYP2D6-spesifik T hücrelerinin flow sitometrik analizi. Ad-2D6-enfeksiyon sonrası 4. haftada Karaciğer lenfositler izole edilmiştir ve immünodominant CD4 veya CD8 hCYP2D6 epitop gecede ya uyarıldı. IFNγ üretimi hücre içi sitokin boyama tarafından tespit ve, FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Almanya) kullanılarak flow sitometri ile analiz edildi. , HCYP2D6-, belirli bir CD4 ve CD8 hücreleri özelliğine kadar etkili of yüzdesini. Belirtilmedikçe edilir.

Tartışmalar

Daha önceki çalışmalarda, deneysel Hepatit genellikle otoimmün karaciğer hastalığı için sadece geçici ve birçok güncel modeller oldukça kompleks bir hastalıktır indüksiyon protokolleri (değerlendirmeleri ^3,5 bakınız) bağlı olduğu rapor edilmiştir. Örneğin, çeşitli modeller, belirli bir hedef antijenlerini eksprese eden transgenik fareler kullanmak ve adoptively hedef antijene özgü, çoğunlukla TCR-transgenik T hücreleri ^14,15 aktarılır. Sıklıkta, livertropic,, virüsler, bakteriler ya da Parazitlerin ile birlikte, bir ek bir bir bir bir enfeksiyon,,, hastalığı ^16-18 indüklemek etmek gerekli olan konumundadır. Alternatif olarak,,, CYP2D6'nın ¹⁹ de dahil olmak üzere, target antijenleri,, için kodlandığında plazmidler ile birlikte DNA-aşılama,,,, hepatit indüklemek için kullanılan edilir. Bununla birlikte,,,,, bu tür, IL-12, gibi pro-inflamatuvar sitokinlerin,, için kodlandığında plazmidler ile birlikte, bir ek bir bir aşılama ^(20,) gereklidir edilir. Ne yazık ki, birkaç istisna dışında sadece geçici ^15,20 hepatit.

CYP2D6 modeli ^6,21 basit bir yöntem t kullanıro sadece Adenovirüs hCYP2D6, AİH-2 ^7,8 büyük otoantijen ifade bir ile enfekte fareler tarafından otoimmün hepatit neden. CYP2D6 bir adenovirüs yapı tarafından teslim etmesi, karaciğer doğrudan hedefleme yanı sıra hoşgörü dökümünü teşvik eden bir lokal inflamasyon garanti eder. Ancak virüs titresi yanı sıra yönetim rota bu model için çok önemli olduğunu not etmek önemlidir. Reklam,, birini elini On,-, 2D6,, böylece,,, bir Replikasyonu noksan virüs konumundadır, virüs of, bir yeterli bir bir bir, yüksek titresinde,, karaciğer mesafede olan, antijen of, bir kritik bir bir bir miktarını üretmek etmek, gereklidir edilir. ., Diğer bir elini On,, yüksek çok, bir titresinde,,,, bir fatal bir,, akut bir karaciğer başarısızlık in sonuçlanabilir gidebilecek. Buna ek In, it,,, adenovirus of, yüksek titreleri kullanıcısı tarafından fareler of enfeksiyon, bağışıklık bir yanıtı ⁽²²⁾ of, bir fonksiyonel bir bir bir bitkinlik, etmek yol açar olduğunu, daha önceden göstermiştir olmuştur. Bizim modeli In, biz,, her ikisi de, kronik bir hücresel bir infiltrasyonunu yanı sıra gibi ext ile elde etmek için,, sipariş in,, intravenöz ve intraperitoneal olarak enfeksiyon of, bir kombinasyon kullanılanensive fibrozis. Biz tek başına intravenöz enfeksiyon hala büyük bir hücre infiltrasyonu neden olur, ama subkapsüler bölgede, intraperitoneal nedeniyle peritoneal inflamasyon gösteren hiçbir fibrozis, kollajen sürekli subkapsüler birikimi (Hintermann & Christen, lığa) dahil olabilir gözlemledik. Ancak, Ad-, GFP veya Reklam-Kontrol ²³ eşit virüs titresi enfeksiyondan sonra Karaciğer yıldızsı hücreleri ve kollajen depolanması aktivasyonu tespit etmedi bu yana gözlenen karaciğer fibroz, antijen-özel olduğunu not etmek önemlidir.

CYP2D6 modeli gibi kalıcı hücre infiltrasyonu ve karaciğer fibrozu ⁶ ile karakterize kronik hepatit A gibi pek çok açıdan, insan AİH ^1,2 yansıtır. Buna ek In,,,,, 'e benzer bir epitopunu spesifisite ve, in AIH-2 hastalarda bulundu: LKM-1 antikorlar etmek tıklayınız. Yayılıyor ^{13 -.} Ile birlikte, yüksek-titresinde anti--Toplam CYP2D6'nın antikorlar of varlığında,,,,, pre gösteriryaygın bir kronik otoimmün reaktivite seçilecek eserlerin çalışılmasıdır. CYP2D6'nın,,,, AIH-2 'in major bir antijen konumundadır,, ancak it,, daha fazla sık sık olan type 1 AIH ile birlikte tanısı konulan hastalarda kullanıcısı tarafından tanınan değil edilir. Buna ek olarak, otoimmün etiyoloji ile diğer karaciğer hastalıkları, primer biliyer siroz (PBC) veya primer sklerozan kolanjit (PSC) gibi muzdarip hastalar, damgasını otoantikorlar oluşturmak farklı, karaciğer otoantijenlere ve ciğeri belirleyicilik küçük boyutlu merkezleme farklı patolojik özellikler (PBC göstermektedir ) veya büyük (PSC) safra yolları. Bununla birlikte,, CYP2D6 modelleri, hepatositlerin otoimmün imha sürücü ve hastalığı tedavi etmek mümkün terapötik müdahaleyi değerlendirmek için anahtar oyuncular tanımlamak için, otoimmün karaciğer hastalıkları sırasında ortaya çıkan kronik karaciğer inflamatuar süreçlerde yer immunopathogenic mekanizmalarını analiz etmek bir fırsat sunuyor.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ekipman Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
23G iğne	BD Biosciences	300800
27 ½ G iğne	VWR	612-0151
30 ½ G iğne	BD Biosciences	304000
Alanin aminotransferaz test şeritleri (GPT / ALT)	Roche Diagnostics	10 745 138 202
Aspartat aminotransferaz test şeritleri (GOT / AST)	Roche Diagnostics	10 745 120 202
Anestezi Ünitesi Univentor 400	AgnTho Kullanıcı
Baz kalıp, tek 37x24x10 mm	VWR	720-0208
Hücre süzgecinden 70mm	VWR	734-0003
Kriyostat	Leica	CM1850 UV
Heparinize kapiller tüp	Balıkçı	3123987
Mikroskop SuperFrost Plus, slaytlar	Menzel Gläser	J1800AMNZ
Microtainer SST tüpler	BD Biosciences	365951
Mikrotiter plakaları, V-bottom için	VWR	391-1924
Reflotron Artı	Roche Diagnostics		Serum AST / ALT BELİRLENMESİ
O Adf reaktif	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Rabbit anti--için fare anti--Collagen İçin türü I IgG,	Chemicon	AB765P
Tinile keçi anti-tavşan IgG	Vector (AXXORA)	VC-BA-1000-MC15
FITC-konjuge anti fare CD8a antikor	Güney Biyoteknoloji	1550-1502
PE-konjuge anti fare IFNγ antikor	BD Biosciences	554412
PE-konjuge anti-fare CD16/CD32 antikor (FCR blok)	BD Biosciences	553141
Aquatex	VWR	1.08562.0050
Avidin / Biotin Engelleme kiti	VC-SP-2001-KI01
Bir Brefeldin	Sigma	B6542
Kollajenaz IV	Sigma	C5138-100mg
DAB substrat kiti 3'3'diaminobenzidine	Vector (AXXORA)	VC-SK-4100-KI01
DNaz	Sigma	DN-25
Elit ABC Reaktifi	Vector (AXXORA)	VC-PK-7100-L050
Eosin G / Y çözeltisi	Roth	X883.1
Fetal buzağı serum (FCS)	Biochrom AG	G 0115
İsofluran	Forene	B506
Meyer Hematoksilen çözümü	¸	A4840, 1000
Ekim Bileşik	, Sakura Finetek Avrupa	4583
PBS-tamponlu formaldehit,% 10	Roth	A146.3
Percoll	Amersham	17-0891-01
Roti-Histokit	Roth	6638,1
RPMI	Invitrogen	61870
Quillaja kabuğu gelen Saponin	Sigma	S7900