CYP2D6 животных Модель: как вызвать аутоиммунные гепатиты у мышей

Резюме

Заражение мышей с аденовирус выражение основных человеческих аутоантигенов цитохром P450 2D6 (hCYP2D6) признан сыворотки пациентов, страдающих от 2 типа, аутоиммунный гепатит результаты в постоянной форме аутоиммунного-опосредованного заболевания печени характеризуется широким гепатит, фиброз и формирование CYP2D6 -специфического иммунного ответа.

Аннотация

Аутоиммунный гепатит является редким, но опасно для жизни аутоиммунное заболевание печени неизвестной этиологии ^1,2. В прошлом многие попытки создать модель животного, который отражает особенности заболевания человека ^3-5. Тем не менее, в различных моделях индукции болезнь была довольно сложной и часто гепатит был только переходным ^3-5. Таким образом, мы разработали простой модели мыши, используются основные человеческие аутоантиген 2 типа аутоиммунный гепатит (АИГ-2), а именно hCYP2D6, как триггер ^6. Тип 1 печени и почек микросомальные антитела (LKM-1) антител, распознающих hCYP2D6 являются отличительной чертой АИГ-2 ^7,8. Доставка hCYP2D6 в дикого типа FVB или C57BL / 6 мышей на аденовирус конструкции (Ad-2D6), что гарантирует прямые поставки запуска антиген печени. Таким образом, последующие местное воспаление создает благодатную почву ⁹ для дальнейшего развития аутоиммунных заболеваний. Сombination внутривенном и внутрибрюшинном введении Ad-2D6 является наиболее эффективным способом, чтобы вызвать длительную аутоиммунные повреждения печени (раздел 1). Ниже мы предлагаем подробный протокол о том, как аутоиммунные заболевания печени, индуцированных в CYP2D6 модели и, как различные аспекты поражения печени могут быть оценены. Во-первых, в сыворотке крови маркеров указывает гепатоцитов уничтожения, таких как аминотрансферазы, а также титры антител hCYP2D6 определяются путем отбора проб крови retroorbitaly (раздел 2). Во-вторых, hCYP2D6-специфических Т-клеточного ответа характеризуется сбор лимфоциты селезенки и печени. Для того чтобы получить чистый лимфоцитов печени, печень, которые перфузии по PBS через портальную вену (раздел 3), переваривается в коллагена и очищают на градиенте Перколла (раздел 4). Частота hCYP2D6 конкретных Т-клеток анализируется стимуляции hCYP2D6 пептидов и идентификацию IFNγ-продуцирующих клеток методом проточной цитометрии (раздел 5). В-третьих,клеточная инфильтрация и фиброз определяется иммуногистохимии печени секции (раздел 6). Такой режим анализ должен проводиться в несколько раз после начала болезни, чтобы доказать хронический характер модели. Величина иммунного ответа характеризуется частотой и деятельности hCYP2D6-специфических Т и / или В-клеток и степень повреждения печени и фиброз должны быть оценены для последующего анализа возможных методов лечения, чтобы предотвратить, задержать или отменить аутодеструктивное процесса в печени.

протокол

1. Внутривенное введение Ad-2D6 в офтальмологической синуса

1. В стерильных условиях, разбавить Ad-2D6 вирус маточного раствора с концентрацией 5 х 10 ⁹ БОЕ / мл в RPMI и сохранить Ad-2D6 антивирусное решение на льду. Введение две дозы 5 х 10 ⁸ БОЕ (внутривенно и внутрибрюшинно) оказалась привести к самым надежным результатом аутоиммунного гепатита у мышей штамма FVB.
2. Анестезию мыши с 4% в ИФ анестезии камеры. Зажмите заднюю ногу, чтобы убедиться, что животное находится под наркозом.
3. Держите мышь, затылка и затянуть свободной кожи головы с большим и средним пальцами. Подобно этому, глаза слегка выступает тяги на кожу рядом с глазом.
4. Поместите иглу вертикально в медиальной угла глазной щели (переход век ближе к носу животного) и медленно вводят 100 мкл Ad-2D6 антивирусное решение. Важно не прилагайте чрезмерных усилий, чтобыВо избежание повреждения сосудов и трахеи.
5. Медленно снять иглу, чтобы избежать утечки и закройте глаза.
6. Инъекции хорошо работать, если антивирусное решение не вытекает из корыта носа и глаз скользит обратно в исходное положение.
7. Сразу же после внутривенного введения, выполняют стандартные внутрибрюшинного введения второго 100 мкл Ad-2D6 антивирусное решение.

Кроме того, внутривенное введение может быть выполнен через хвостовую вену. Тем не менее, введение через глазной синуса гораздо легче выполнять и сводит к минимуму потери антивирусное решение. Было показано, что эти две технологии могут быть использованы как взаимозаменяемые, и что оба пути являются одинаково эффективными ^10.

Зараженные мыши отслеживаются побочные эффекты и явные признаки страдания и боли, такие, как потеря аппетита, потеря веса, потеря подвижности, отсутствие жениха, грубая шерсть волосами, сгорбившисьвнешний вид, а также лизать, кусать, царапины, или тряска конкретной области (например, места инъекции). Хотя мыши отображать значительный ущерб печени CYP2D6 модели мышей, кажется здоровым и нет никаких признаков страдания, боль и напряжение. Тем не менее, показатели тяжелой печеночной недостаточности, таких как сывороточные аминотрансферазы определяется на регулярной основе или являются частью проведенных экспериментов. Сыворотка аминотрансфераз в> 1000 Ед / л должно появляться только как прямой результат вирусной инфекции, но не хронически. Если в сыворотке крови аминотрансфераз хронически выше 1000 Ед / л (степень ограничения) мышей жертву.

2. Кровотечение мышь глаз

1. Анестезию мыши с 4% в ИФ анестезии камеры. Зажмите заднюю ногу, чтобы убедиться, что животное находится под наркозом.
2. Держите мышь, затылка и затянуть свободной кожи головы с большим и средним пальцами. Подобно этому, глаза слегка выступаеттяга к коже рядом с глазом.
3. Поместите кончик капилляра в нижней или внутреннего угла глаза и мягко, но твердо скользнул вдоль глазного яблока в глазной венозного синуса. Разрыву венозных капилляров и в результате кровоизлияния заполняет глазницы.
4. Слегка снять капилляр, чтобы освободить кончик так, чтобы остатки крови втягивается в трубку.
5. Когда достаточное количество крови собирается, трубка снята и веки. Кровотечение останавливается на снятие трубки и восстановление нормального глазного давления на венозные комплекса.
6. Кровь в капиллярной трубке передается Microtainer трубы и выдерживают в течение 30 минут на льду.
7. Microtainer трубку центрифугируют при 7500 мкг в течение 2 мин при 4 ° C.
8. Супернатант соответствует сыворотке, которое передается в новую пробирку и хранили при -80 ° C.
9. Сыворотку можно использовать для определения титра антител с помощью ИФА. IndicaТЗ повреждения печени, таких как сывороточные уровни печеночных ферментов аланинаминотрансферазы (ALT / GPT) и аспартатаминотрансферазы (AST / GOT) можно оценить с помощью тест-полосок в соответствии с Roche Diagnostics (Мангейм, Германия) и Reflotron Плюс анализатор ( Roche Diagnostics, Мангейм, Германия).

Кроме того, забор крови может быть сделано через хвостовую вену или через поверхностную височную вену ^11.

3. Перфузии печени мышей

Примечание: Этот шаг важен, чтобы избежать загрязнения изолированных лимфоцитов печени лимфоцитах крови

1. Усыпить мышей смертельной дозы CO _{2 с последующим} шейки дислокации.
2. Установите животного лежа на спине на пенопласт борту. Используйте иглы 23 G к контакту конечностей.
3. Увлажнение и дезинфекции мышь с 70% этанола
4. Около 1 см от задней ноги, сделать надрез черезкожи и мышечного слоя. Вырезать по обе стороны от животного работает до диафрагмы.
5. Когда диафрагма достигается кожи можно перевернуть обратно.
6. Сокращение диафрагмы от разрывов затем разрезать полой вены.
7. Перемещение желудка и кишечника в сторону, обнажив воротной вены.
8. В воротной вены вставки иглы 27 G подключен к 5 мл шприц, заполненный холодным PBS. Пусть PBS медленно смыть кровь из печени.
9. Проанализируйте печени, захватывая на диафрагму и сокращения диафрагмы от тела.
10. Передача печени чашку Петри и удаление диафрагмы, желчного пузыря и любой другой ткани по-прежнему связаны с печенью
11. Трансфер в печени до 10 мл PBS в 50 мл пробирку на льду или вставлять в соединение октября

4. Выделение лимфоцитов печени

1. Подготовьте следующие решения складе:
   • Коллагеназы IV акций (100 мг / мл), ял PBS. (Сделайте маленькие порции и храните при температуре от -20 ° C).
   • ДНКазы акций (25 мг / мл) в PBS. (Сделайте маленькие порции и храните при температуре от -20 ° C).
   • Коллагеназы буфера: PBS, содержащего 0,2 мг / мл коллагеназы IV, 0,02 мг / мл ДНКазы и 5% FCS, 1 печень, смешать 9,5 мл ледяной PBS, 20 мкл коллагеназа IV (100 мг / мл акций), 8 мкл ДНКазы ( 25 мг / мл акции) и 500 мкл тепло инактивированной FCS.
   • 35% Перколла, смесь 175 мл Перколла, 20 мл 10 х PBS акций; 305 мл PBS.
   • RPMI _полный = RPMI, содержащей 10% тепла инактивированной FCS, 100 μ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина.
2. Передача перфузии печени (см. раздел 3) до 10 мл свежего PBS в чашку Петри на льду и нарезать на мелкие кусочки с помощью ножниц.
3. Перевод на 70 мкм фильтр клетки и джонки сжатие через печень с пестиком стекла или пестиком с 2 мл шприц. Осторожно добавить 10 мл холодного буфера коллагеназы инажмите через сито. Соберите подвески и процеживают через сито в два раза больше.
4. Передача подвески на свежий 50 мл пробирку на льду. Процесс следующий печени.
5. Инкубируйте подвески клеток печени при 37 ° С в течение 60 минут, осторожно смешать каждые 15 мин.
6. Центрифуга на 30 мкг в течение 3 мин при 4 ° C.
7. Передача супернатант в новую пробирку, оставляя 5 мм жидкости над гранул
8. Центрифуга 650 мкг в течение 10 мин при 4 ° C.
9. Удалить супернатант, оставляя 3 мм выше гранул
10. Ресуспендируют осадок в 20 мл буфера Перколла
11. Центрифуга 600 мкг в течение 20 мин при 4 ° C.
12. Удалить супернатант и ресуспендируют гранул, щелкая трубки.
13. Вымойте гранул 1 х с PBS.
14. Вымойте гранул 1 х с _полной RPMI
15. Ресуспендируют осадок в 3 мл RPMI _{заполнить} и подсчет клеток в разведении 1:10.
16. Ресуспендирования клеток в ~ 10 ⁷ клеток / мл в RPMI _{заполнить} и передать трубку в лед.

5. Внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICCS)

5,1 стимуляции:

1. Подготовка печени лимфоцитов при температуре ~ 10 ⁷ клеток / мл в RPMI _{полный,} как описано. Пластина 100 мкл (10 ⁶ клеток) / и в квартиру 96-луночного планшета, который не ткань культуры лечение.
2. Добавить 50 мкл RPMI _{завершить} содержащие 2μg/ml Brefeldin, а затем добавить 50 мкл RPMI ^{полный,} содержащего 2 мкг / мл стимулирует CYP2D6 пептид (т.е. иммунодоминантных CD4 эпитоп CYP2D6 _41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ ¹² или иммунодоминантных CD8 эпитоп CYP2D6 _193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG ^12). Смешайте с помощью пипетки.
3. Выдержите в течение 5 часов при 37 ° C (оптимальное время стимуляции, но инкубации в течение ночи работает, а).

5.2. Пятно:

1. Подготовьте следующие решения складе:
   • FACS буфера: PBS, содержащим 1% эмбриональной телячьей сerum (FCS).
   • Фиксация / пермеабилизации буфера: FACS буфером, содержащим 0,1 сапонин% и 4% параформальдегид
   • FACS / сапонин промывочного буфера: FACS буфера, содержащего 0,1% сапонина
   • FACS / PFA буфера: FACS буфером, содержащим 1% параформальдегида (PFA)
2. Передача клеток в V-дно планшет (96 лунок) и вращение на 460 мкг в течение 3 мин при 4 ° C. Отменить среднего и вихрь пластины
3. Добавить 150 мкл буфера FACS и центрифуги в 460 мкг в течение 3 мин при 4 ° C. Отменить среднего и вихревой тарелки. Повторите шаг мыть.
4. Блок поверхности FcR в случае необходимости (при использовании вторичных антител) с 1 мкг / мл αCD16/32 коктейль (FcR блоков) в буфер FACS в течение 15 мин при 4 ° С и мыть 2 х 150 мкл буфера для окрашивания (460 мкг в течение 2 мин в 4 ° C).
5. Пятно на поверхности молекулами, т.е. Анти-CD8a-FITC МКА 10 мкг / мл в 50 мкл буфера FACS в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
6. Добавить 100 мкл FACSбуфера и спина при 460 мкг в течение 3 мин при 4 ° C.
7. Промойте клетки 2 х 150 мкл буфера FACS (460 мкг, 3 мин, 4 ° C). Vortex пластины.
8. Fix / permeabilize клеток с 100 мкл фиксации / пермеабилизации буфера в течение 10 мин при комнатной температуре.
9. Спиновая при 460 мкг в течение 7 мин при 4 ° C. Обратите внимание, что важно расширять центрифугирования время до 7 минут, с фиксацией / permeabilzation шаги меняет общую плотность клеток. Vortex пластины.
10. Вымойте 2 х 150 мкл FACS / сапонин промывочного буфера (460 мкг, 7 мин, 4 ° C). Vortex пластины.
11. Пятно для внутриклеточных молекул, т.е. Анти-IFNγ-PE МКА 10 мкг / мл в 50 мкл FACS / сапонин промывочного буфера в течение 30 мин при 4 ° C.
12. Добавить 100 мкл FACS / сапонин буфер стирки и отжима при 460 мкг в течение 7 мин при 4 ° C.
13. Промойте клетки 2 х 150 мкл FACS / сапонин промывочного буфера (460 мкг, 7 мин, 4 ° C). Vortex пластины.
14. Промойте ячейки 1 х с FACS буфера (460 мкг, 7 мин, 4 ° C). Vortex пластины.
15. Ресуспендирования клеток в 200 мкл FACS / PFA буфер передачи в трубах, и хранят при температуре 4 ° С в темноте, пока сбор данных с помощью проточной цитометрии. Мы обычно используем FACSCanto II или FACSCalibur (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия).

6. Иммуногистохимия

6.1. H & E окрашивание для оценки общей патологии печени:

1. Урожай печень, погружают в ткани-Tek Окт В одноразовая форма базы и быстрого замораживания в сухом льду.
2. Вырезать 7 мкм ткани печени разделы, используя Leica криостат установлен на -17 ° C и смонтировать на срезах тканей SuperFrost Plus микроскопом. Хранить слайды при температуре -20 ° C до дальнейшего использования.
3. Исправить cryosections в предварительно охлажденный этанола в течение 15 мин при температуре -20 ° C. Дайте высохнуть в течение 10 мин.
4. Вымойте 2 х в дистиллированной воде в течение 2 мин при комнатной температуре (следующие шаги, 6.1.5 - 6.1.13, проводятся при комнатной температуре).
5. Пятно в гематоксилин Майера решение для8 мин.
6. Промойте в теплой (30 ° C) воду из-под крана в течение 10 мин. Меняйте воду несколько раз.
7. Промыть в дистиллированной воде.
8. Промыть в 95% этанола на 20 сек.
9. Контрастирующая окраска в Eosin G / Y решение в течение 40 сек.
10. Высушить 2 х в 95% этаноле в течение 5 мин в инкубации.
11. Высушить 2 х на 100% этаноле в течение 5 мин в инкубации.
12. Очистить в ксилоле 2 х 5 мин на поляне.
13. Установите в Roti-Histokitt.

6.2. Иммуногистохимическое для осаждения коллагена I:

1. Урожай печень, погружают в ткани-Tek октября в одноразовых форм базы и быстрого замораживания в сухом льду.
2. Вырезать 7 мкм ткани печени разделы, используя Leica криостат установлен на -17 ° C и смонтировать на срезах тканей SuperFrost Plus микроскопом. Хранить слайды при температуре -20 ° C до дальнейшего использования.
3. Исправить cryosections в холодном этаноле в течение 15 мин при температуре -20 ° C. Дайте высохнуть в течение 10 мин.
4. Вымойте 2 х в PBS в течение 2 мин при комнатной температуре.
5. Инкубируйте в PBS, содержащем 0,3% H ₂ O ₂ и 0,1% азида Na-в течение 10 мин при комнатной температуре.
6. Вымойте 2 х в PBS в течение 2 мин при комнатной температуре.
7. Блок с авидин-биотин блокирующий комплект в соответствии с руководящими принципами производителя.
8. Блок с 10% FCS в PBS (FCS / PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре.
9. Основной антитела кролика против мышей коллаген I антитела, которые разводят 1:200 на 10% FCS / PBS. Инкубируйте участки с первичными антителами в течение 2 часов при комнатной температуре.
10. Вымойте разделах 3 х в PBS в течение 4 минут при комнатной температуре.
11. Развести биотинилированного анти-антитело до 1:500 и инкубировать с разделами на 1,5 часа при комнатной температуре.
12. Вымойте разделах 3 х в PBS в течение 4 минут при комнатной температуре.
13. Цветная реакция получается последовательным инкубации с авидин-пероксидаза и сопряженных диаминобензидина-перекись водорода по руководящим принципам производителя.
14. Контрастирующая окраска в Майер Онmatoxylin решение в течение 5 минут, промыть 2 х в PBS в течение 2 мин при комнатной температуре и смонтировать в Акватекс.

7. Представитель Результаты

Заражение мышей с Ad-2D6 индуцированной два различных стадиях повреждения печени. В первые дни после заражения вирусом печени вызывает резкое увеличение сывороточных аминотрансфераз, индикатор гепатоцитов смерти ^6. Это первое, острая стадия наступает независимо от выражения hCYP2D6, а также может наблюдаться после заражения вирусом пустой контроля (Ad-Control) или вирус выражения зеленый флуоресценции белков (Ad-GFP). В отличие от второго этапа является аутоиммунным-опосредованной и зависит от выражения запуска молекулы hCYP2D6. Это аутоиммунное стадия наступает в течение 2-4 недель после инфицирования и сохраняется в течение нескольких месяцев ^6.

<с классом = "jove_content"> Рисунок 1. CYP2D6 модели. FVB дикого типа или C57BL / 6 мышей вводят две дозы Ad-2D6 (внутривенно и внутрибрюшинно). В то время интерес печени и сыворотки собираются и анализируются на повреждение печени и формирование hCYP2D6-специфических антител и Т-клеток.

Следующие особенности, характерные для постоянного аутоиммунный гепатит развивается после Ad-2D6-инфекции дикого типа FVB или C57BL / 6 мышей в CYP2D6 модели: Во-первых, печень показывает аберрантно изменилась морфология. В частности, в печени доли слиты, гиперпластические узелки появляются разбросанные по всей печени и массивный фиброз капсульного видно (рис. 2).

Рисунок 2. Печень морфологии. Типичное объявление-2D6-индуцированного повреждения печени, которая была определена в 4-й неделе после заражения. Обратите внимание, что отдельные доли печени слиты (наконечники стрел). Гиперпластические узелки появляются разбросанные по всей печени (стрелки). Заражение контроль аденовирус не выразить hCYP2D6 не оказывает никакого влияния на печень морфологии.

Во-вторых, обширные и постоянные проникновения сотовой появится в пери-портал и паренхиматозных регионов печени Ad-2D6-инфицированных, но не Ad-Control-инфицированных мышей (рис. 3А). Фиброз развивается преимущественно в области субкапсулярной с некоторыми коллагеновых пучков выступающие в паренхиму (рис. 3В).

Рисунок 3. Гистологии печени. H & E окрашивания ткани печени разделе FVB мышей, инфицированных или Ad-управления или Ad-2D6 на 4-й неделе после заражения. Обратите внимание, что значительное проникновение мононуклеарных клеток имеются только в Ad-2D6 инфицированных мышей (одной стрелки). Тройной стрелки показывают больше сотового проникновения в паренхимы печени моста между соседними портальных трактов. B: Иммуногистохимическое представление фиброза печени на 4-й неделе после заражения с Ad-2D6 или Ad-контроль. Печень разделы окрашиваются коллагена с помощью анти-коллаген I антител. Обратите внимание, несколько слоев коллагена реализации в соответствии с капсулой печени (тройной стрелки) с некоторыми выступающими в пучки паренхимы (один стрелками) и наличием большого скопления проникновения клеток (наконечники стрел). Две секции представитель печени отображаются для каждого состояния. Размеры бара: 100 мкм.

Третьей особенностью является создание высоких титров анти-CYP2D6 антитела, которые имеют схожую специфику эпитоп для человека LKM-1 антител ^6,13. Последнее, hCYP2D6-специфических CD4 и CD8 Т-клеток, которые образуются преимущественно дома в печень. Такие hCYP2D6-специфических Т клеток могут быть обнаружены путем стимуляции immunodomiНант hCYP2D6 пептидов и последующего измерения IFNγ выражения внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICCS) (рис. 4). hCYP2D6-специфических CD8 Т-клеток, убить Ad-2D6-инфицированные клетки-мишени в естественных условиях ^12.

Рисунок 4. hCYP2D6-специфических Т клеток. проточной цитометрии анализа hCYP2D6 конкретных Т-клеток. Печень лимфоцитов были выделены в 4-й неделе после того, как Ad-2D6-инфекции и стимулировали либо иммунодоминантных CD4 и CD8 hCYP2D6 эпитоп ночь. Генерация IFNγ был обнаружен внутриклеточного окрашивания цитокинов и анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием FACS Песнь II (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия). Доля hCYP2D6-специфических CD4 и CD8 указывается.

Обсуждение

В предыдущих исследованиях, экспериментально гепатит часто сообщается, только переходные, и многие современные модели для аутоиммунных заболеваний печени зависит от сложного заболевания, а индукция протоколов (см. обзоры ^3,5). Например, некоторые модели используют трансгенных мышей, экспрессирующих антигенов цели и восприимчиво переданы целевой антиген-специфические, в основном, TCR-трансгенной, Т-клетки ^14,15. Часто дополнительной инфекции livertropic вирусами, бактериями или паразитами, необходимо, чтобы вызвать заболевание ^16-18. Кроме того, ДНК-вакцинация плазмиды, кодирующие антигены цель, в том числе CYP2D6 ^19, используется, чтобы вызвать гепатит. Тем не менее, дополнительная вакцинация плазмиды, кодирующие провоспалительных цитокинов, таких как IL-12, требуется ^20. К сожалению, за редкими исключениями ^15,20 гепатита лишь временный характер.

CYP2D6 модель ^6,21 использует простой метод тО вызывают аутоиммунный гепатит просто заражение мышей с аденовирус выражения hCYP2D6, основные аутоантиген в АИГ-2 ^7,8. Доставка по CYP2D6 аденовирус конструкция обеспечивает как прямое нападение на печень, а также местное воспаление, что способствует разрушение толерантности. Важно отметить, однако, что оба титра вируса, а также пути введения имеет решающее значение для этой модели. С одной стороны, Ad-2D6 является репликация вируса недостаточно, таким образом, достаточно высокий титр вируса требуется, чтобы создать критическую количество антигена в печени. С другой стороны, слишком высокий титр может привести к фатальной острой печеночной недостаточности. Кроме того, было показано ранее, что заражение мышей высокие титры аденовирус приводит к функциональному истощению иммунной реакции ^22. В нашей модели мы использовали комбинацию внутривенного и внутрибрюшинного инфекции для того, чтобы получить как хронический клеточной инфильтрации, а также добensive фиброза. Мы заметили, что внутривенное заражение только до сих пор вызывает массовый клеточной инфильтрации, но не фиброза субкапсулярной регионе, о том, что воспаление брюшины вследствие внутрибрюшинного введения могут быть вовлечены в непрерывный субкапсулярной накопление коллагена (Хинтерманн и Кристен, рукопись готовится к печати). Тем не менее, важно отметить, что наблюдаемое фиброза печени является антиген-специфические, так как мы не обнаружили активация печеночных звездчатых клеток и коллагена после заражения вирусом равных титры Ad-GFP или Ad-управления ^23.

CYP2D6 модель отражает многие аспекты человеческой ^1,2 АИГ, таких как хронический гепатит характеризуется стойкими клеточная инфильтрация и фиброз печени ^6. Кроме того, наличие высоких титров анти-CYP2D6 антител с аналогичной спецификой эпитоп и распространение ¹³ LKM-1 антител находится в АИГ-2 пациентов указывает на предварительноствие распространенных хронических аутоиммунных реактивности. CYP2D6 является основной антиген в АИГ-2, но он не признается пациентов с более частым АИГ 1 типа. Кроме того, пациенты страдают от других заболеваний печени с аутоиммунной этиологии, таких как первичный билиарный цирроз печени (PBC) или первичный склерозирующий холангит (PSC), генерировать признаком аутоантитела со специфичностью для различных аутоантигенов печень и печень, показать различные патологические особенности центровки на малых (PBC ) или большой (PSC) желчных протоков. Тем не менее, CYP2D6 моделей дает возможность анализировать immunopathogenic механизмов, участвующих в хронической печеночной воспалительные процессы, возникающие при аутоиммунных заболеваниях печени, для идентификации ключевых игроков, которые способствуют развитию аутоиммунной деструкции гепатоцитов, а также оценку возможных терапевтических вмешательств, чтобы вылечить болезнь.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Наименование оборудования	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
23G иглы	BD Biosciences	300800
27 ½ G иглы	VWR	612-0151
30 ½ G иглы	BD Biosciences	304000
Аланинаминотрансфераза тест-полосок (GPT / ALT)	Roche Diagnostics	10 745 138 202
Аспартатаминотрансфераза тест-полосок (GOT / AST)	Roche Diagnostics	10 745 120 202
Анестезия группы Univentor 400	AgnTho в
База формы, одноразовые мм 37x24x10	VWR	720-0208
Сотовые фильтр 70 мм	VWR	734-0003
Криостат	Leica	CM1850 UV
Гепаринизированной капилляров	Рыбак	3123987
Микроскопа скользит SuperFrost Plus	Менцель Глезер	J1800AMNZ
Microtainer SST труб	BD Biosciences	365951
Микротитровальные пластины, V-дно	VWR	391-1924
Reflotron Plus	Roche Diagnostics		Determiniation сыворотки AST / ALT
Имя ое реагент	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Кролик анти-мышиных анти-коллагена типа I IgG,	Chemicon	AB765P
Биотинилированные козьего анти-IgG кролика	Вектор (AXXORA)	VC-BA-1000-MC15
FITC-сопряженных анти мыши CD8a антител	Южно Biotech	1550-02
PE-сопряженных анти антитела IFNγ мыши	BD Biosciences	554412
PE-сопряженных анти-мышиных антител CD16/CD32 (FcR блок)	BD Biosciences	553141
Акватекс	VWR	1.08562.0050
Авидин / биотин Блокировка набора	Vector (AXXORA)	VC-SP-2001-KI01
Brefeldin	Сигма	B6542
Коллагеназы IV	Сигма	C5138-100мг
DAB подложки комплект 3'3'diaminobenzidine	Вектор (AXXORA)	VC-SK-4100-KI01
ДНКазы	Сигма	DN-25
Elite ABC реагентов	Вектор (AXXORA)	VC-PK-7100-L050
Eosin G / Y решение	Рот	X883.1
Эмбриональной телячьей сыворотки (FCS)	Biochrom AG	S 0115
Isofluran	Forene	B506
Гематоксилин Майера решение	AppliChem	A4840, 1000
Октябрь соединения	Сакура Finetek Европе	4583
PBS-буфере формальдегида на 10%	Рот	A146.3
Перколла	Amersham	17-0891-01
Roti-Histokit	Рот	6638,1
RPMI	Invitrogen	61870
Сапонин из коры Quillaja	Сигма	S7900