Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Özet

Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu geliştirdi C. albicans Denir Ca BChip. Ilaç duyarlılık profili bir test Ca BChip mantar çip ideal antifungal ilaçların gerçek yüksek verimli görüntüleme için uygundur düşündüren, geleneksel 96-plaka modeli ile karşılaştırılabilir.

Özet

Candida albicans şu anda ABD hastanelerinde ¹ dördüncü en sık görülen nozokomiyal kan dolaşımı enfeksiyonu temsil kandidiazis ana etyolojik ajan kalır. Bu fırsatçı enfeksiyonlar tehlikeye bireylerin sayısının artmasıyla için büyüyen bir tehdit ve kabul edilemez yüksek mortalite oranları taşırlar. Bu en sık kullanılan antifungal ajanlara karşı direncin ortaya çıkmasına da antifungal ilaçların sınırlı cephaneliği nedeniyle kısmen, ama. Ileri tedavi komplike kandidiyazis tezahürleri çoğunluğu biyofilmlerin oluşumu ile ilişkili olduğu bir gerçektir ve bu biyofilm içindeki hücrelerin klinik olarak en kullanılan antifungal ajanlar ² direnç seviyelerinin artmasına göstermektedir. Burada C. oluşan bir yüksek yoğunluklu mikroarray geliştirilmesi tarif Biz Ca BChip ³ adında var albicans nano-biyofilmlerin. Kısaca, bir robot microarrayer t kullanılırC. o baskı maya hücreleri sağlam bir zemin üzerine albicans. Baskı sırasında, maya hücreleri gibi nL 50 kadar düşük ve uygun bir kaplama ile birlikte bir cam zemin üzerinde immobilize bir birimi kullanılarak, üç boyutlu bir matris içine alınır. İlk baskıdan sonra, slaytlar biyofilm geliştirilmesi için izin vermek için 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Bu dönemde noktalar olgun C ile ilişkili tipik yapısal ve fenotipik özellikleri göstermeyen tam gelişmiş "nano-biyofilm" içine büyümek albicans biyofilm (yani morfolojik karmaşıklığı, üç boyutlu mimari ve ilaç direnci) ^4. Genel olarak, Ca BChip ~ 750 eşdeğeri ve mekansal farklı biyofilm oluşur; birden fazla fiş baskılı ve aynı anda işlenebilir olduğu ek avantaj. Hücre canlılığı FUN1 metabolik floresan yoğunluğu mikroarray tarayıcı kullanarak lekeyi ölçerek tahmin edilmektedir. Bu mantar çip ideal u için uygundurantifungal ilaç keşfi için gerçek yüksek verimlilik tarama se. Mevcut standartlar (yani biyofilm ⁵ 96-mikrotiter plate modeli) ile karşılaştırıldığında, fungal biyofilm çip ana avantajları otomasyon, minyatür, miktarı ve reaktifler ve analizler zaman maliyet tasarrufu, hem de işçiliğinin ortadan kaldırılmasına olan yoğun adımları. Biz çip önemli antifungal ilaç keşfi sürecini hızlandırmak inanıyorum.

Protokol

1. Fonksiyonlu Slaytlar hazırlanması

1. Çıkarılabilir bir slayt rafa mikroskop yerleştirin ve% 99 etanol (histolojik grade) içeren bir boyama kavanoza daldırarak iki kez yıkayın. Slaytlar sıkıştırılmış azot gazı bir jet kullanarak kağıt havlu (kağıt tozu üretmek için değil sağlanması), ve kuru kullanarak temizleyin.

NOT: ince kağıt tozu üretecek olarak slayt silmek için Kim-Mendil kullanmayın.

2. Gece boyunca oda sıcaklığında konsantre sülfürik asit ve inkübe ile doldurulmuş bir boyama kavanoz slaytlar içeren kayar raf batırmak.

NOT: Konsantre asitlere ve toksik ve korozif kimyasallar ile çalışırken Deri ile teması engellemek için, kimyasala dayanıklı eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.

3. 30 dakika boyunca Milli-Q ile 30 dk ve yıkama (MΩ 18) su kaydırağı sonikasyon, bir başka yıkama ile takip edin5 dk için cetone. Bu tedavi Camdaki silanol grupları ortaya koyar.
4. Coat, 30 dakika boyunca APTES içinde kayar raf daldırarak her bir yıkama 15 dakika süreyle Milli-Q su ile 3 defa, yıkama ve kabartma tarafından 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) çözeltisi,% 2.5 'i ile temiz bir kaydırak (su içinde hacim / hacim) 110 azından bir fırın içerisinde slaytlar ° C'de 15 dakika süreyle. Pişirme yüzeyinin-NH2-fonksiyonlandırmalar sonuçlanan APTES bir çapraz bağlantı sağlar.

NOT: tercihen cam kap duvarlarında APTES mevduat yana plastik bir kapta APTES çözüm olun.

5. Hidrofobik kaplama ⁶ arasında bir mono-tabaka elde etmek için% 1 (toluen içinde ağırlık / hacim) polistiren-Co-maleyik anhidrid (PS-MA) (Sigma) ile bir sıkma kaplayıcı, kaplama slaytlar kullanılması. 30 s için 3000 rpm'de bir spin lak ve kat üzerine monte temiz bir cam slayt üzerine PS-MA 2.0 mL ekleyin. Bu koşullar, kaplama gibi spin kaplama parametreleri yüzden göre değişebilirDirekt Ekspres, zemin, kaplama kalınlığı ve aşağıdaki denklemi ⁷ tarafından yönetilir

h film kaplama kalınlığı burada, E buharlaşma oranı, η, C ve ρ, sırasıyla, kaplama solüsyonu viskozite, konsantrasyon ve yoğunluğu, ve ω açısal hız olup.

NOT: çeker ocak uzun bir zaman ve kullanım için solunduğunda Toluen zararlıdır önerilir.

6. 8 ° C - slaytlar 2 kuru ve tozsuz bir ortamda bir ay kadar bir slayt rafta saklanabilir

2. Maya inokulum ve Kollajen Encapsulation hazırlanması

1. C. bir gecede kültür hazırlayın Maya pepton dekstroz albicans soyu SC5314, [YPD; 10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton ve 20 g / L dekstroz] C. tek bir koloni inokulastonu ile sıvı ortamın al10 içine bicans - YPD ^8, 20 mL. 30 ° C'da - orbital çalkalayıcı (200 rpm 150) kültür inkübe edin. 10 mM fosfat tamponu, 2.7 mM potasyum klorid,; Hasat 1 mL Candida albicans maya gece boyunca YPD kültürleri (5-10 dakika boyunca 5000 rpm'de santrifüje edilerek) hücreleri ve steril 1 ml fosfat içinde 10 dakika süreyle iki defa yıkayıp (PBS tamponlu salin 137 mM sodyum klorid, yıkama başına pH 7.4) (Sigma). Hasat 10 dakika boyunca 1900 rpm'de santrifüje edilerek ayrıca hücreleri yıkanmıştır. 1 ml yeniden tampon (2.2% (ağırlık / hacim) sodyum bikarbonat ve% 4.8 (ağırlık / hacim) HEPES, pH 7.2 ile 0.2 N NaOH) içinde yıkanmış hücreleri yeniden süspanse edin.

NOT: C. albicans Risk Grubu 1/BSL1 mikroorganizmadır. Her zaman bu mikroorganizma ile çalışmak için iyi aseptik / steril teknikler kullanmak ve biyolojik tehlikeli malzemelerin uygun şekilde bertaraf edilmesi için kurumsal prosedürleri takip etmeyi unutmayın.

2. Bir hemocyt kullanarak hücreleri hesaplamaparlak bir alan mikroskobu Ometer ve 5 hücre yoğunluğu × 10 ⁷ hücre / ml için ayarlayın.
3. Daha da 10 ilavesiyle süspansiyonu on kat seyreltik × RPMI-1640 L-glutamin ve takviye morpholinepropanesulfonic (MOPS) asit (pH 7.2) ile tampon.
4. Kolajen (1.8 mg / mL) ile RPMI-1640 yılında hücre süspansiyonu ile karıştırılması kollajen maya hücrelerinin saklanması (fare kuyruk gelen tipi 1, BD Biosciences, Bedford, MA) / 4 arasında bir nihai konsantrasyon x 10 hücreleri ⁶ elde etmek için ml. Yazdırmadan önce kollajen jelleşme önlemek için buz üzerinde kollajen-hücre süspansiyonu tutun.

3. Ca BChip hazırlanması

1. Temizleyin ve% 70 izopropanol silerek kaynak plaka istasyonu, yıkama ve vakum istasyonu, vakum slayt tabağı ve baskı odası da dahil olmak üzere microarrayer tüm yüzeyleri, dezenfekte edin.
2. Mic slayt güvertesinde PS-MA-kaplı cam istenilen sayıda koyun ve vakum ile tutunroarrayer.
3. Vorteks hücre kuvvetlice kollajen süspansiyon ve sadece baskı öncesinde, bir 96-kuyulu plakalı bir kuyuya iyi karıştırılmış süspansiyonun 100 uL aspire. Yükleme istasyonu bu kaynak plaka yerleştirin.
4. Baskı sürecinde mikroarray odasında% 100 bağıl nem korumak için nemlendirici açın.
5. Konik konik 190 mikron delikli seramik ipuçlarını kullanarak temassız birikimi sonucu mikroarray gözcü (Omnigrid Micro, Digilab Inc, Holliston, MA) kullanılarak 1.2 mm aralıklı noktalar ile 48 satır ve 16 sütun bir dizi hücre süspansiyonu 50 nL yazdır (Digilab).
6. Başbakan baskı her turdan sonra uçları iki kez durulayın ve vakum-kurulayın.
7. Hemen baskıdan sonra, bir hava-sıkı, nemli odasına (Hibridizasyon kaset, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) slayt koyun ve 37 ° C biyofilm oluşumuna imkan vermek için 24 saat inkübe edin.

4. Pr Duyarlılık TestiAntifungal Ajanlar Karşı Ca BChip içinde eformed Biyofilmler

1. Antifungal ilaçların stok solüsyonları veya toz itibaren, RPMI-1640 ortamı içinde çalışan bir solüsyon hazırlanır. Çalışma çözeltisi, tipik maksimum konsantrasyon 1024 ug / ml ve flukonazol için amfoterisin B ⁵ için 16 ug / ml 'dir. Diğer konsantrasyonları farklı ajanlar için kullanılabilir.
2. Ortasında bileşiğinin yaklaşık _IC50 ile bir aralık yayılma, iki misli dilüsyonları içinde stok çözeltisi seyreltilmesiyle bileşiğin farklı konsantrasyonları sekiz hazırlayın.
3. Biyofilm büyüme 24 saat sonra, en azından, (20 dakika süreyle sodyum hipoklorit ile muamele) pozitif (sadece ortam hiçbir ilaç, yani hücre) ve negatif birlikte, kontrol ilaçların sekiz farklı konsantrasyonları 50 nL yazdırmak için microarrayer kullanımı Altı biyofilmlerin üstüne çoğaltır.

NOT: add ise lekelerin kurumasını önlemek için% 100 nispi nemi koruyunilaçlar ing.

4. Kısa bir süre ilaç eklendikten sonra, 24 saat süreyle 37 ° C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir odacık içinde ilaçları ile çip inkübe edilir.
5. CaBChip 2 dakika 3-5 kez PBS içinde her zaman dunking tarafından uyuşturucu yıkayın ve 37 0.5 mM FUN1 ile 30 ° C min ⁹ Ca BChip kuluçkaya leke.
6. Yıkayın her dunk 1-3 dakika PBS Ca BChip 3-5 kez smaç tarafından kapalı leke ve bir azot akımı kullanarak Ca BChip kurulayın. 380 PMT kazancı ile 532 nm dalga boyunda bir mikroarray tarayıcı (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) kullanılarak floresans yoğunluğu okuyun.
7. Pozitif kontrol (ilaç) ve% 100 ve% 0 ölü (çamaşır suyu ile tedavi) biyofilm lekelerin floresans şiddeti, sırasıyla ayarlayın.
8. Aşağıdaki denklem kullanılarak kontrol lekelerin ortalama göreli floresans yoğunluğunu (F) 'in redüksiyon oranı ile inhibisyonunu belirleme

F, F _max ve F _o çiğ floresan uyuşturucu tedavi yoğunluk, hiçbir ilaç kontrolü ve çamaşır suyu ile tedavi edilen noktalar, sırasıyla nerede. Tarayıcı ayarlarını sırasıyla F _max ve 30000 ve 4000 RFU F _o, elde etmek ayarlandı.

9. GraphPad Prism Software (La Jolla, CA) kullanılarak değişken eğimi Tepesi denklemi takılması ile% 50 inhibitör konsantrasyonu veya _IC50 hesaplamak.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

48 oluşan bir temsilci Ca BChip, × C nano-biyofilmlerin 16 dizi albicans, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Aydınlık alan mikroskobu nano-biyofilm genel bir mimari özellik gösterir. Mantar hifleri matris içinde gömülü olduğu biyofilm göstermektedir taramalı elektron mikroskobik görüntüleriçapı yaklaşık 2 um ile 100 nm olan elyafları kolajen, sırasıyla. FUN1 lekeli mikroarray tarayıcı görüntüleri fungal biyofilm karakteristik maya ve hifal formlar, göstermektedir. FUN1 lekeli biyofilmlerin 2D ve 3D-konfokal floresans görüntüleri dışı matriks (tarafından da üretilen exopolymeric malzeme kapsülleme malzemesi ve büyük ihtimalle de kollajen oluşmaktadır içinde serpiştirilmiş metabolik olarak aktif hücre bölgeleri ile, mekansal heterojen olması görülebilir metabolik boya ile boyanan değildir biyofilm hücreleri). Biyofilm kalınlığı yaklaşık 50 mikron olarak tahmin edilmiştir. Ca BChip iki ilaç, flukonazol ve amfoterisin B antifungal duyarlılık tahmin etmek için kullanıldı ve sonuçları Şekil 3 'de gösterilmiştir. Endüstri standardı 96-plaka deneyleri yayınlanan raporlar ile uyumlu olarak, biyofilm flukonazol ¹⁰ ve hesaplanan IC ₅₀ dayanıklı amfoterisin B 0.3 mg / mL ^11'dir.

Ca BChip imalatı için Şekil 1. Akış çizelgesi.

Şekil 2. Baskılı yüksek thoughput Ca BChip, bir resmi bir robot microarrayer kullanarak ve PS-MA-kaplı slaytlar üzerinde 768 lekeler içeren. Her yarım küre spot çapı yaklaşık 700 mikron ve noktalar arasında 1.2 mm ayrılması ile, hacmi 50 nL olduğunu. Ayrıca (saat yönünde) gösterilen ışık mikroskobu, mikroarray tarayıcı, 2D ve 3D-floresan mikroskobu ve Ca BChip üzerinde bireysel biyofilmlerin elektron mikroskobu görüntüleri taramak vardır. 25.000 x yüksek büyütmede SEM rakam genişliği 2 um hifal filament gösterir.

Şekil 3 "src =" / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg "/>
Şekil 3. Ca BChip kullanarak (A) flukonazol ve (B) amfoterisin B için _IC50 değerleri antifungal duyarlılık testi ve kararlılık Sonuçları. Amfoterisin B-arıtılmış biyofilmlerin floresans mikroskobu görüntüleri (C) 'de gösterilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart hata 10 içeren iki ayrı yongaları için ortalama olarak her bir durum için çoğaltır.

Tartışmalar

Biz Candida albicans biyofilmlerin nanoliter ciltten oluşan hücre tabanlı yüksek yoğunluklu mikroarray, Ca BChip geliştirdik. Mikroarray olmayan yayılan, hemisferik 3D jel için gerekli hidrofobluğu sağlarken kollajen jel lekelerin sağlam eki için izin modifiye cam malzeme üzerine basılmıştır. A tek bir Ca BChip yaklaşık sekiz 96-kuyucuklu plaklar yerini alabilir ve birkaç yongaları aynı anda basılır ve işlenebilir. Çip, nano ölçekli kültürler kullanır kolay ve h?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	440140
Polistiren-Co-maleyik anhidrid (PS-MA)	Sigma-Aldrich	426946
Cam mikroskopi slaytlar	Fisher Scientific	12-549-3
Fare kuyruk kolajeni tip I	BD Biosciences	354236
Robotik Microarrayer	Omnigrid Micro	MICROSYS4000/4100A
Mikroarray Tarayıcı	Genepix Kişisel 4100A	GENEPIX4100A
Hibridizasyon Kaset	ArrayIt Şirketi	AHCXD
FUN1 [2-klorro-4-(2,3-dihidro-3-metil-(benzo -1,3-tiyazol-2-il)-metilliden)-1-fenil quinoliniumiodide]	Invitrogen Corp	F-7030
Flukonazol	Sicor Pharmaceuticals, Inc	J02AC01
Amfoterisin B	Sigma	A2411
RPMI-1640	Mediatech, Inc	50-020-PC
Seramik İpucu 190 mikron orifis	Digilab	60020441-00
GraphPad Prism Yazılımı	GraphPad Software, Inc
Genepix Pro V4.1	Molecular Devices