Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Özet

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için kullanılır önemli deneysel prosedürleri açıklayacağız Escherichia coii'nin (E. Coli).

Özet

Salgınlar ölüm ve hastaneye milyonlarca yanı sıra muazzam ekonomik kayıpların her yıl gıda kaynaklı ve hastane kökenli patojenlerin hesabına bağlanmıştır. Devam eden bir salgın yerde doğru ilk aşamada suçlu patojenler tespit edebilir analitik yöntemler için giderek artan bir talebin etkisi bu tür salgınların önlenmesi ve azaltılması. Yüksek spesifite (faiz sadece bakteri tespit), yüksek hassasiyeti (düşük olarak tespit edebilen: patojen tespiti için etkili yöntemler büyük bir dizi olmasına rağmen, bunların hiçbiri ideal bir tespit yöntemi için somutlaşan tüm aşağıdaki beş önde gereksinimlerini tatmin edebilir tek bir canlı bakteri hücresi gibi), kısa zaman-sonuçları (saat dakika), büyük bir işlem kolaylığı (uzun örnekleme işlemleri ve özel ekipman kullanımı için gerek yoktur), ve maliyet etkinliği. Örneğin, klasik mikrobiyolojik yöntemlerle son derece özeldir ama uzun bir süre (da gerektirirhafta ys) ^1-PCR ve antikor tabanlı teknikler daha kısa bekleme süreleri (gün saat) sunuyoruz. kesin sonuç elde etmek, ancak pahalı reaktifler ve / veya gelişmiş ekipman kullanımı. Sonuç ^2-4 gerektiren, hala Yukarıda belirtilen şartların bir veya daha fazla gelişmiş özellikler sunan yenilikçi bakteriyel algılama yöntemleri geliştirmeye yönelik bilimsel araştırmalar için büyük bir talep. Laboratuvarımız bakteriyel algılama dahil biyoalgı uygulamalar için moleküler probların yeni bir sınıf olarak DNAzymes potansiyelinin incelenmesi ilgileniyor. ⁵

DNAzymes (ayrıca deoxyribozymes veya DNA enzimleri olarak da bilinir) insan yapımı kimyasal reaksiyonları katalize yeteneği ile tek iplikli DNA molekülleri. ^6-8 Bu moleküller kadar 10 içeren geniş bir rastgele sırası DNA havuzu (izole edilebilir bir işlem ile tek tek ¹⁶ sekansları) o "in vitro seçime" olarak da bilinirr "SELEX" (üstel zenginleştirme tarafından ligandların sistematik evrim). ^9-16 Bu özel DNA molekülleri yaygın biyoalgı uygulamaları için moleküler araçlar olarak son yıllarda incelenmiştir. ^6-8

Laboratuvarımız RNA-yarma floresan DNAzymes (. RFDs; Şekil 1) izole etmek için in vitro seçim prosedürleri kurmuştur ve analitik araçları olarak RFDs kullanımı araştırılmıştır ^17-29 RFDs tek ribonükleotid bir DNA-RNA kimerik substrat bölünme katalize. Bir fluorofor (F) ve bir quencher (Q) tarafından taarruz altında kalır bileşke (R). F ve Q yakın uncleaved substrat minimum floresans vermektedir. Bununla birlikte, bölünme olayı floresans yoğunluğunu ve önemli bir artış eşlik eder F ve Q, bir ayırma yol açar.

Daha yakın zamanlarda, biz bakteriyel tespiti için RFDs izole bir yöntem geliştirdi. ^5. Bu özel RFDs "için izole edilmiştirkendi ortamında ya da kültüre ortama bakteri belirli bir türü (Şekil 1) geride bıraktığı ham ekstraselüler karışımı (CEM) varlığında "yanar. ham karışımının kullanılması arındırıcı süreci sıkıcı circumvents ve biyosensör geliştirme (tamamlamak için aylar veya yıllar sürebilir) için ilgi mikrop uygun bir hedef belirleme. ekstrasellüler hedeflere kullanımı hücre içi hedefleri elde etmek için adımlar için gerek yoktur, çünkü test edilmesinden prosedürü basit anlamına gelir.

Sadece E. tarafından üretilen CEM varlığında; yukarıdaki yaklaşım kullanılarak, (Şekil 2A. FS1) ile alt tabaka parçalayarak bir RFD türetilmiş coli (CEM-AT). ⁵ Bu E. RFD-EC1 (Şek. 2A) adlı coli algılama RFD, sıkı bir şekilde CEM-EC yanıt veren, ancak diğer bakterilerin bir ana (Şekil 3) den CEMS maddelere karşı karşılık vermeyen olduğu bulunmuştur.

Burada PreseE. kurmak için önemli deneysel prosedürleri nt RFD-EC1 ve temsili sonuçları kullanılarak coli algılama testleri.

Protokol

1. Kimyasal Çözümler hazırlanması

1. 0.5 M etilen diaminetetraacetic asit (EDTA): 2 litre içinde (L) plastik bardak, 186,1 g EDTA (EM Bilim) tartmak ve otoklavlanmış deiyonize-damıtılmış su (GKD ₂ O) 800 mililitre (ml) ekleyin. NaOH topakları (EM Science) ile 8,0 pH üzere ayarlanır. GKD ₂ O. kullanarak 1 L son hacmi olun 4 ° C de cam şişe, otoklav ve mağaza çözüm aktarın
2. 10 × Tris-borat EDTA çözeltisi (10 × TBE; 89 mM Tris, 89 mM borik asit, 2 mM EDTA, pH 7.5): 432 Tris-base g (BioShop Kanada) ve borik asit (BioShop Kanada) 220 g tartılır ve 4 L plastik bir behere her ekleyin. 0.5 M EDTA (pH 8.0) 80 mL ölçmek ve behere ekleyin. Bileşenlerin tamamen eriyene kadar iyice manyetik bir karıştırıcı ile karıştırarak solüsyonu 4 L'lik bir son hacme GKD ₂ O ekleyin. 4 ° C de cam şişe, otoklav ve mağaza çözüm aktarın
3. % 10 polyacrylami denatürede jel stok: bir 4 L'plastik kabı için, üre 1681,7 g (BioShop Kanada), 10 ile 400 ml x TBE, 40% akrilamid / bisacrylamide (29:1) solüsyonu (BioShop Kanada) 1 L ekleyebilir. GKD ₂ O 4 L ses seviyesini ayarlama Karıştırma ile üre eritilir. 4 az 1 L kehribar cam şişe ve mağaza ° C çözüm aktarın (Bunu önceden polimerizasyon bir nörotoksin çünkü Dikkat! Akrilamid eldiven, maske, gözlük ve laboratuvar önlüğü ele alınmalıdır).
4. 2 × jel yükleme tamponu (2 × GLB): 200 mL'lik bir cam beher için, üre 44 g, sukroz 8 g (BioShop Kanada), Bromofenol mavi (BioShop Kanada) ve 10 mg, xylenecyanol FF 10 mg (Sigma ekleme -Aldrich),% 10 sodyum dodesil sülfat 400 uL (SDS; BioShop Kanada), ve 10 × TBE 4 mL. GKD ₂ O ile 40 mL son ses seviyesini ayarlama ve hafif ısıtma (50 ° C) ve manyetik çubuğu ile karıştırma ile katıların çözünmesi. 4 az 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza içine 1 ml kısım transfer ° C Bizim dayanarakdeneyim, 2 × GLB depolama koşulu altında katılaşan çünkü kullanmak ° C'ye önceden 90 az ısı 2 × GLB kısa bir süre için gereklidir.
5. 1 M Tris-HCl (pH 7.5): 200 mL'lik bir cam beher içinde Tris-bazlı bir 12.1 g tartılır. GKD ₂ O 60 mL ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı ile karıştırarak katıların çözünmesi. 1 M HCl (Sigma-Aldrich) ile 7.5 'e ayarlamak pH. GKD ₂ O ile 100 mL hacim oluşturan ve bir cam şişe ve otoklav transfer. 4 ° C'de depolamak
6. 5 M NaCl: cam beher içinde NaCl 58,4 g (BioShop Kanada) tartmak ve GKD ₂ O 150 ml ile çözülür GKD ₂ O. ile 200 mL ses seviyesini ayarlama 4 ° C de bir cam şişe, otoklav ve mağaza çözüm aktarın
7. DNA elüsyon tamponuyla: bir cam beher içinde, 2 mL karıştırarak 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5 M NaCl ve 8 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) ile 0.4 ml. GKD ₂ O. ile 200 mL ses seviyesini ayarlama 4 ° C'de otoklav ve mağaza
8. 2 × reaksiyon tampon maddesi (2 × RB; 100 mM HEPES, 300 mM NaCl, 30 mM _MgCl2): bir 50 mL Falcon tüpü (Falcon BD) için, HEPES 1.2 g (BioShop Kanada), NaCl ve 0.88 g _MgCl2, 0.30 g • 6H ₂ O ekleme (Merck) ve GKD ₂ O. 30 ml Bileşenleri tamamen eriyene kadar hafifçe sallayarak karıştırın. 10 N NaOH eklenerek pH 7.5 'e ayarlamak ve GKD ₂ O. ile 50 ml nihai hacme ayarlamak 4 ° C'de bir şırınga filtresi tahrik ünitesi (0.22 mikron, Millipore) ve saklamak kullanılarak çözeltisi saflaştırmak
9. Luria Bertani (LB) Broth: bir cam kapta, GKD ₂ O. 1 L ilavesi takip (Sigma-Aldrich) LB toz 20.0 g ağırlığında Bir manyetik karıştırıcı ile çözümü iyice karıştırın, bir erlene çözüm aktarın. Oda sıcaklığında çözelti ve otoklavlama deposu.
10. 1,5% LB agar: bulunan 250 mililitrelik bir şişe içinde agar 1.5 g (BioShop Kanada) tartılır ve sıvı LB 100 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında ve karışım deposu otoklava.
11. Agar kaplama: Melt mikrodalga LB agar ve ~ 50 ° C serin çözüm Bir alev altında Petri (Fisher Scientific) içine çözüm dökün. Bizim deneyimlerimize göre, LB agar 100 mL 5-6 tabak verebilir.

2. Şablon tarafından RFD-EC1 ve RFSS1 İnşaatı Enzimatik Ligasyonu Yönlendirilen

RFD-EC1 (Şekil 2A) özellikli DNAzyme olduğunu. Bu katalitik sekansı EC1 ve substrat sekansı FS1 (Şek. 2A siyah ve yeşil çizgiler ile gösterilen) oluşur. RFSS1 (Şekil 2A) katalitik dizisi EC1 kısmen SS1 karıştırılan ancak FS1 kısmı değişmeden kalır RFD-EC1 karıştırılmış bir sürümüdür. RFD-EC1 ve RFSS1 (Şek. 2A içinde takılı kutusu bakınız) ligasyon şablon olarak LT1 varlığında oligonükleotid EC1 ya SS1 oligonükleotid FS1 enzimatik ligasyon aracılık şablon tarafından imal edilmiştir. Ligasyon reaksiyonu yürütmek için prosedürü aşağıda verilmiştir.FS1, önceden belirlenmiş protokolü takip, Yale Üniversitesi'nde Keck Oligo Synthesis imkanlar elde koruması giderildi ve jel elektroforez ile saflaştınldı. ^17-24 EC1, SS1 ve LT1 Entegre DNA Technologies satın alınmış ve jel elektroforez ile saflaştırılmıştır.

1. GKD ₂ O. kullanarak FS1, EC1, SS1 ve LT1 bir 100 uM stok solüsyonu hazırlayın Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklayın.
2. Tüp 1 ve Tüp 2 olarak işaretlenen iki 1.5 uL mikrosantrifüj tüplerine FS1 stok solüsyon 5 uL aktarın. Her tüpe, GKD ₂ O 38.5 uL ve daha sonra 10 uL 5 x T4 nükleotid kinaz (PNK) reaksiyon tamponu ilave 500 mM Tris-HCl (pH 7,6, 25 ° C) içeren A (MBI Fermentas), 100 mM _MgCl2, 50 mM DTT, 1.0 mM spermidin. (Birkaç kez aşağı çözümü Pipeti ve) pipetleme tarafından her bir çözeltiyi karıştırın.
3. ATP (100 mM, MBI Fermentas) 1 uL ekleyin ve pipet ile karıştırın.
4. T4 nükleotid kinaz ile 0,5 uL (P eklemeNK; pipetleme tarafından MTE Fermentas) ve karıştırılır; 10 adet / uL. 30 dakika için 37 ° C'da, reaksiyon karışımlarını. Fluorofor ve photobleaching en aza indirmek için alüminyum folyo ile tüpler kapsayacak emin olun.
5. 5 dakika boyunca 90 ° C'de ısıtılarak reaksiyona Quench. 10 dakika oda sıcaklığında tepkime karışımı soğumaya.
6. EC1 5 uL ve Tüp 1 ve Tüp 2 SS1 stok solüsyonu, sırasıyla ekleyin.
7. Pipet ile her bir tüp, karışıma LT1 stok solüsyonu 5 uL ekleyin. 1 dakika ile 10 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar soğutulur için 90 ° C'da, reaksiyon karışımı ısıtılır.
8. GKD ₂ O 118 uL ve daha sonra 10 uL 20 x 400 mM Tris-HCl (25 ° C'de pH 7.8), 100 mM _MgCl2, 100 mM DTT, ve 5 içerir T4 DNA ligaz tamponu (MBI Fermentas), ekleme mM ATP. Pipetleme tarafından çözüm karıştırın.
9. Ve pipetleme karıştırın; 2 T4 DNA ligaz ile uL (MTÖ Fermentas 5 adet / uL) ekleyin. 1 saat süreyle oda sıcaklığında reaksiyon karışımlarını.
10. Her bir tüp, vortex ile 3 M NaOAc (pH 7.0) 20 uL ekleyin ve aşağı doğru döndürün. Her tüpe soğuk% 100 etanol 500 uL ekleme, vorteks ile karıştırarak ve solüsyonu 30 dakika boyunca -20 ° C'de dondurucuda tüpler yerleştirin.
11. ° C soğutmalı santrifüj (Allegra X22-R, Beckman Coulter) 4 20 dakika 11,000 g'de karışımları santrifüjleyin ve dikkatli pipet ile süpernatantı kaldırın.
12. 10 dakika bir DNA konsantratör (Savant DNA Speedvac, Thermo Scientific) kullanılarak DNA pelet kurulayın.
13. Pastör pipetiyle DNA 1 30 uL × kısaca jel yükleme tamponu (GLB), girdap içinde pelet ve bir tezgah üstü santrifüj (Minicentrifuge, VWR Scientific) ile aşağı doğru döndürün. Bağlandı DNA örnekleri% 10 dPAGE jel yüklenmeye hazırız.

3. % 10 dPAGE jel hazırlanması

Aşağıdaki adımları kısaca jel elektroforezi ve set-up cihazı tanımlar. Cihazları, ayarları ve kullanımı hakkında daha ayrıntılı bilgi için lütfen tdaha önce yayınladığımız protokolleri o. ^30,31

1. Yıkayın ve iki cam plaka, iki 0.75 mm pullar ve 16-iyi tarak kurulayın. Klipler ile cam plakalar ve ara birleştirin ve yukarı bakacak çentikli cam plaka ile düz bir yüzeye yatay yatıyordu.
2. 150 ml beher içine% 10 dPAGE karışımı 40 ml aktarın. Bir pipet ile dönen tarafından,% 10 APS 400 uL ve karıştırın; tetramethylethylenediamine 40 uL (Bioshop Kanada TEMED) ekleyin.
3. Plakalar arasında dikkatle karışımı dökün ve hemen tarak yerleştirin. Karışım 10-20 dakika boyunca polimerize izin verir. Polimerizasyon beher kalan kalıntı jel karışımı kontrol ederek teyit edilebilir.
4. Bir kez polimerize, yavaşça tarak kaldırmak ve kuyularda kalan Jel çözüm kaldırmak için GKD ₂ O ile kuyu durulayın.
5. Dışarı bakacak çentiksiz dikdörtgen plaka ile jel elektroforezi aparat üzerine plakaları takın ve taraklı plaka arkasında bir metal plaka koyun. Metal pl kullanımıyedik cam plakalar çatlasa aşırı ısınmayı önlemek için yardımcı olur.
6. Aygıtının üst ve alt odalarına 1 × TBE ekleyin. Kuyu tamponu ile doldurulur ve jel alt kenarı tampon içinde batırılır sağlamak için bakınız.
7. 40 mA (veya 750 V) mevcut ve 10 ila 15 dakika önceden çalıştırın uygulayın.

4. % 10 dPAGE Gel tarafından bağlandı RFD-EC1 ve RFSS1 Saflaştırılması

1. 3.7 adımı takiben, 1 × TBE bir şırınga ve iğne ile kuyu ile durulayın.
2. Bir pipet ve jel yükleme ipuçları (Diamed) kullanarak 2 kuyu (her biri için) içine RFD-EC1 ve RFSS1 bu ligasyon karışımı (2.13) yükleyin. Alt boya kadar akım 40 mA (750 V) uygulayın (Bromophenol Mavi) plakaların alt kenarı üzerinde yaklaşık 5 cm.
3. Jel çalışan cihaz cam plakaları çıkarın, düz tezgah üstü yatmak ve dikkatli aralama çıkarın.
4. Dikkatlice jelden üst cam plakalar kaldırmak veplastik ambalaj malzemesi (jel saran kırışıklık ve katlama kaçınıyorum) ile jel sarın.
5. Bağlanan ürünler UV gölgeleme (260 nm) ya da birkaç santimetre EC1 veya SS1 (EC1 veya SS1 100 pmol üzerinde görünür bir DNA bant üretecek transillüminasyon (360 nm), tarafından da görüntülenebilir bir işaretleyici olarak kullanılabilir ve ) 4.2 adım bir kuyuya yüklenir. Bir işaretleyici ile istenen DNA bantları işaretleyin.
6. Steril tıraş bıçakları ile Özel Tüketim DNA bant, taze bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne küçük parçalar ve transfer içine jel kesti.
7. Steril bir pipet (200 ul uç boyutu) kullanarak mikrosantrifüj tüpü içinde jel parçaları Crush.
8. Her tüpe 500 uL DNA elüsyon tamponunu ekleyin ve ışıktan florofor korumak için alüminyum folyo ile bunları kapatın. 10 dakika boyunca vorteks örnekleri.
9. ° C soğutmalı santrifüj (Allegra X22-R, Beckman Coulter) 4 az 4 dakika 11.000 g de örnekleri santrifüj ve dikkatlice s 350 uL transferitaze bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü (gerekirse, ikinci bir elüsyon başka bir 10 dakika süreyle taze yıkama tamponu 350 uL ile yapılabilir) için upernatant.
10. Her tüpe 3 M sodyum asetat (NaOAc pH 7.0), 35 uL (Örnek hacminin 0.1 x) ekleyin vorteks ile karıştırılır ve aşağı doğru dönmeye başlayacaktır. Her tüpe soğuk% 100 etanol 900 uL ekleyin. Her numune karıştırın birkaç saniye için tüp el sallayarak. En az 1 saat süreyle -20 ° C'de tüpler yerleştirin.
11. 4 az 20 dakika ° C soğutmalı santrifüj içinde için 11,000 g örnekleri santrifüj ve dikkatli pipet ile süpernatantı kaldırın.
12. Soğuk% 70 etanol ile 100 uL ekleyin ve yavaşça tüpün iç duvarına tamamını durulama için kullanır. 4, 7 dakika boyunca 11.000 g'de santrifüj Re-° C. Süpernatan kaldırmak ve 10 dakika süre ile DNA yoğunlaştırıcı kullanılarak pelet kurutun.
13. GKD ₂ O ve vorteks 100 uL DNA pelet eritin. 260 nm'de UV absorbans göre DNA konsantrasyonunun belirlenmesi. Mağaza örnekleri -20° C, kullanılıncaya kadar.

5.. Bakteri hazırlanması

1. Hedef bakteri suşunun E. coli K12 (MG1655) ve ilgili kontrol suşları öncelikle gliserol stoklarından LB agar plaklarına kaplanıyor. Bir alev altında veya biyolojik güvenlik kabini içinde, LB agar zarar görmemesi için plaka yüzeyine steril bir pipet ve yavaşça çizgi ile bakteriyel gliserol stok dokunun.
2. 14 saat boyunca 37 ° C'de inkübe çizgili plakalar ve invert. İnkübasyondan sonra, 4 ° C'de parafilm (PECHINEY Plastik Ambalaj) ve deposu ile plakaların tüm çevresi mühürlemek Bu plakalar 4 en fazla hafta saklanabilir.

6. Ham Ekstrasellüler Karışımlarının Hazırlanması (CEMS)

1. Bir pipet tabancası (Corning) kullanarak steril 14 mL kültür tüpleri (BD Falcon) içine LB 2 mL dağıtın.
2. Steril bir pipet ucu kullanarak, 5.2 aşamasında hazırlanmış agar plak ile tek bir koloni almak ve AC takınulture tüp. Bir inkübatör (New Brunswick Scientific) yer tüpler 37 ° C'de ayarlayın ve 14 saat süreyle 250 rpm'de sallayın.
3. % 1 yeniden aşılama kültürü: adım 6.2 hazırlanmış bakteri kültürlerinin 20 uL ile 14 mL kültür tüpleri ve başak taze LB 2 mL dağıtın. Her bir bakteriyel çözelti yaklaşık 1 bir OD ₆₀₀ (600 nm de ölçüldü optik yoğunluk) 250 ulaşıncaya kadar rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edin. OD ₆₀₀ ölçmek için, bir UV spektrofotometre (Genesys UV 10, Thermo Scientific) ile 600 nm'de bir tek küvet ve ölçü absorbans her kültürün 1 mL aktarın.
4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 11.000 g'de santrifüje edilerek yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü ve pellet hücrelerine her kültür 1 mL transfer edin.
5. Hemen kullanılmaz ise -20 ° C'de yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve mağaza supernatan aktarın.

7. Floresans Spektrofotometre kullanılarak Algılama

1. Floresans spektrometresi açın (Cary Eclipse, Varian Inc) ve 520 nm 488 nm eksitasyon ve emisyon ile veri toplama parametrelerini ayarlamak. Kaynaklar 1 saat süreyle her dakika alınabilir.
2. % 100 etanol takip GKD ₂ O, 3 kuvars kristali küvetler (Varian Cary) yıkayın. Azot gazı yanıp küvetler kurulayın. Etiket küvetler C1 (kontrol 1), C2 (kontrol 2) ve T (test).
3. C1 ve C2 ve T. Her küvet ve floresans spektrofotometre yer onlara 2 25 ul × RB Ekle CEM-EC 24 uL için GKD ₂ O 24 uL aktarın. Ilk 5 dakika boyunca floresans veri toplama başlar.
4. C2 ve T ve C1 RFD-EC1 1 uL (5 mM stok çözeltiden) için RFSS1 1 uL (5 mM stok çözeltiden) ekleyin. Pipetleme tarafından her bir çözeltiyi karıştırın. Bu dikkatle okumaları floresans kesilmez böylece başlatılması gerekir. 1 saat edinimi süresi sonuna kadar devam tepki verin.
5. KurtarmakExcel dosyası veriler, kişisel bilgisayar ve bir grafik görüntüsü oluşturmak için işlem veri veri aktarmak.

8. Jel Elektroforezi ile Algılama

Adım 7,4 hazırlanan aynı reaksiyon karışımı jel elektroforezi ile analiz için kullanılabilir; alternatif olarak yeni bir reaksiyon benzer şekilde hazırlandı ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri içinde inkübe edilebilir. Her iki durumda da:

1. 3 M NaOAc ve% 100 etanol 125 uL 5 ul ilave edilerek reaksiyon söndürmesinden (1 saat sonra). Vorteks ile, her solüsyon karıştırmak ve 1 saat için -20 ° C dondurucuya tüpler yerleştirin.
2. 4 de 20 dakika boyunca 11.000 g'de santrifüje Reaksiyon karışımı ° C ve dikkatli bir şekilde pipet ile süpernatan kaldırın.
3. 10 dk için DNA yoğunlaştırıcı kullanılarak granül kurutun.
4. 1 20 uL yılında Pastör pipetiyle pelet × kısaca vortekslendi tarafından GLB. Bir tezgah üstü santrifüj (Minicentrifuge, VWR Bilimsel) ile çok kısa bir süre tüpler aşağı Spin. Bu örnekler okunurBir dPAGE jel yüklenmek için y.
5. 3,1-3,7 olarak tanımlanan bir 10% dPAGE jel hazırlanması. Bir pipet ve jel yükleme ipuçları (Diamed) kullanarak kuyulara reaksiyon örnekleri (Adım 8.4) yükleyin. Alt boya kadar akım 40 mA (750 V) uygulayın (Bromophenol Mavi) plakaların alt kenarı üzerinde yaklaşık 5 cm.
6. Cam plakalar çıkarın ve herhangi bir jel parçaları kaldırmak için musluk suyu ile iyice yıkayın. Bir kimwipe (Kimberly-Clark Professional) ile plakaları silin.
7. Bir Typhoon Tarayıcı (Typhoon 9200, Değişken modu, GE Healthcare) kullanarak floresan için jel plaka tarayın. ImageQuant yazılım (Moleküler Dinamik) kullanarak verileri analiz edin.

9. Algılama Özgünlük

1. Bakteriyel özgüllük test etmek için aynı usul kültür E. için yukarıda anlatılan coli, da CEM hazırlanması ve bir ayrılma reaksiyonu yürütmek gibi tahlil B. gibi farklı bakteri suşlarına bir dizi yapılabilir subtilis, P. Peli, Y. ruckeri, L. planturum, P. acidilactici (Şek. 3A'da gösterildiği gibi).

10. Tek Hücre Algılama

1 ml E. hazırlayın coli gliserol 2 CFU / mL (CFU: koloni oluşturan birim) stok seri seyreltme ile ve kaplama ile CFU konsantrasyonu onaylayın ⁵ Bu stok 0.2 CFU/100 uL içermelidir.. -80 ° C'de saklayın kullanılıncaya kadar.

1. LB 2 mL içeren 10 kültür tüplerinin hazırlayın.
2. 250 rpm çalkalama ile 37 ° C'de 2 CFU / mL gliserol stok ve inkübe 100 uL her kültürü inoküle. Tüm gliserol stokunun kullanım (1 mL) içinde 10 kültürler vermelidir.
3. 4, 8, 12, 16 ve 24 saat: şu zaman noktalarında, her inoküle kültür tüpü ile hasat 300 uL. 24 saat boyunca büyümeye kalan kültür bırakın.
4. OD ₆₀₀ ölçmek ve 5 dakika boyunca 11.000 g'de santrifüje edilerek hücreleri çöktürmek.
5. -20 & D taze 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza için CEMS aktarınörneğin; kullanımı kadar C.
   Not: Saat puan 4, 8 ve 12 hasat numuneler için herhangi bir tespit OD ₆₀₀ olabilir bu yana, kalan kültür bakteri (bulanıklık ve OD ölçümü ile belirlenen) içeren kültürleri tanımlamak için 24 saat boyunca büyümeye olanak sağlar. 10 kültürlerin yalnızca bir ya da iki E. içerebilir aşılama sonrası coli ve geriye kalan herhangi bir tüp hücreleri içermez.
6. Bölüm 8'de tarif edildiği gibi dPAGE jel elektroforezi ile analiz Reaksiyon karışımı daha sonra RFD-EC1 ile bölünme reaksiyonları hazırlamak için belirlenen timepoints pozitif kültürleri (-20 ° C de muhafaza) geri kazanılan CEMS kullanmak ve.

11. Konsept ve Temsilci Sonuçlar

Bakteriyel saptanması için bir RNA-yarma flüoresan DNAzyme (RFD) zayıflık kavramı Şekil 'de gösterilmiştir. 1. RFD etiketli iki nükleotidler çevrili yalnız bir RNA bağlantı (mavi R) bir kimerik DNA / RNA substrat parçalayarakBir fluorofor (F) ve sırasıyla bir quencher (Q) ile karşılaştırın. Ilgi bir bakteri (E. coli gibi) medya olarak büyürken, bir ham ekstraselüler karışımı (CEM) bırakacak. Bir bütün olarak, bu daha sonra CEM CEM özellikle duyarlı bir RFD elde etmek için in vitro deney seçimi bir kullanılır; tahminen RFD bakterinin bir imza moleküldür CEM belirli bir molekülün (mor yıldız) ile etkileşime girer. CEM RFD içeren tepkime çözeltisine ilave edilir, bu RFD bir RNA-yarma aktivitesi tetikler. Bölünme olay bir veya fluorimeter jel elektroforezi ile kullanılarak da tespit edilebilir bir sinyal flüoresan ile sonuçlanan, Q ile F ayırır.

Yukarıda kavramının deneysel doğrulama E. gelen CEM ile yapıldı coli (CEM-EC). Biz vitro seçimi üzerinden 3 RFD moleküller elde edilen ve en verimli bir RFD-EC1 (Şekil 2A) olarak belirlenmiştir. ⁵ We CEM-EC yanıt olarak RFD-EC1 bölünme aktivitesi (RFSS1 adlı bir mutant dizisi ile birlikte) test ettik. Her iki RFD-EC1 ve RFSS1 substrat FS1 (tüm sekansları Şekil 'de gösterilmiştir. 2A) DNAzyme kısımlarının enzimatik ligasyonu ile hazırlandı. Floresans ölçümleri deneyi (Şek. 2B) içinde, CEM-EC RFD-EC1 ya RFSS1 eklenmesi, ardından 5 dakika için 55 ve daha fazla dakika daha inkübe edilerek tek başına inkübe edildi. Çözüm floresan yoğunluğu sürekli her dakika okundu ve veri (RF; t zamanında floresans şiddetinin oranı vs 0 zamanında floresan yoğunluğu olarak hesaplanır) göreceli floresans hesaplamak için kullanıldı. Kuluçka sırasında vs Rf değerleri Şekil olarak çizilmiştir. 2B. Bu RFD-EC1 CEM-AT ilavesi üzerine floresans sinyali yüksek seviyede üretilen bulundu; tezat, RFSS1 güçlü bir floresan sinyal vermedi. Böylece, floresans üreten fuCEM-EC temas halinde RFD-EC1 nction dizisi özgüdür.

Gözlemlenmiştir floresans artar RNA bağlantının bölünme bağlı olduğunu doğrulamak için, bu dPAGE ile reaksiyon karışımı analiz edilmiştir. RFD-EC1 yarılması İki DNA parçası, bir 5 'fluorofor tutma parçası ve 3' parçası quencher istinat üretmek için beklenmektedir. Sadece RFD-EC1 (unclv) uncleaved ve 5 'parçası (CLV) floresans görüntüleme ile tespit edilebilir. DPAGE sonucu Şek. 2C RFSS1/CEM-EC karışımı olmadığı belirlendi RFD-EC1 ve CEM-EC Reaksiyon karışımı aslında, beklenen ayrışma ürünü imal ortaya koymaktadır.

RFD-EC1 spesifisite diğer çeşitli Gram negatif ve Gram pozitif bakteriler toplanmıştır ve veri Şek CEMS kullanılarak tespit edildi. 3A. CEM-EC (mavi eğrisi) ihtiva eden tek Örnek floresans bir artış üretilir. CEMS ile çapraz reaksiyon olmamasıDiğer bakterilerden RFD-EC1 E. için son derece seçici bir olduğunu gösterir coli.

Aynı zamanda, tek bir kültür E. için gerekli süre ele coli hücre RFD-EC1 bölünme uyarabilir yeterli CEM üretmek için. Bu deney, bir E. için Örnek coli (koloni oluşturucu birimler) CFU tanımlandığı içeren yeterince 1 CFU / ml 'lik konsantrasyonu elde etmek için seyreltilmiştir. Bu, 4, 8, 12, 16 ve 24 saat için büyüme ortamı ve kültürleme onunla seyreltilmiş bakteriyel örnek 100 uL karıştırma izledi. CEMS sonra her timepoint için toplanan ve RFD-EC1 bölünme aktivitesini uyararak test edilmiştir. DPAGE sonucu Şek. 3B, 12 saatlik bir süre kültürlenmesi gerekli olduğunu gösterir.

Kırmızı curv; Bu ilk küçük sinyal artışı (Şekil 2B CEM-AT RFSS1 dizisi (negatif kontrol olarak) ilave edildikten sonra floresans ölçümlerde gözlenen dikkat etmek önemlidire) veya diğer bakteriyel CEMS (Şekil 3B için RFD-EC1; mavi hariç tüm eğrileri) FRQ modülünün intrinsik floresans (Q ile F eksik soğutmadan dolayı) atfedilir. Böylece, F-, S-etiketli sekansları ilave bir başlangıç ​​floresans artış üretecektir beklenmektedir. Bununla birlikte, sadece RFD-EC1/CEM-EC karışımları zamanla floresans yüksek düzeyde bir üretme yeteneğine sahiptirler.

Şekil 1. RNA-yarma floresan DNAzyme (RFD) prob şematik ilgilendiren belirli bakteri hücreleri tarafından üretilen ham ekstraselüler karışımı (CEM) ile temas ettiğinde fluoresces. RFD, sırasıyla, bir fluorofor (F) ve bir içki (Q) ile etiketli iki nükleotidleri tarafından taarruz altında yalnız bir RNA bağlantı (mavi R) azından bir şimerik DNA / RNA substrat parçalayarak. Bölünme reaksiyondan önce, RFD bir floresans düzeyde yakın prox nedeniyle minimalbölünme sonra F ve Q imity, Q F yola; bir sonucu olarak, güçlü bir floresans sinyal üretilir.

Şekil 2,. E. coli-algılama RFD. (A) RFD-EC1 CEM-AK tarafından aktive edilebilir DNAzyme prob. RFSS1, bir kontrol olarak kullanılan RFD-EC1 bir yayını karıştırılmış sekansıdır. RFD-EC1 ve RFSS1 şablon olarak LT1 varlığında sırasıyla EC1 ve SS1 FS1 bağlanarak tarafından üretilmiştir. F: floresein modifiye deoksitimidin. S: Dabcyl modifiye deoksitimidin. R: adenin ribonükleotid. (B) Floresans CEM-EC varlığında RFD-EC1 ve RFSS1 profilleri sinyalleşme. B bölünme reaksiyon karışımının (C) dPAGE analizi (Reaksiyon süresi: 60 dak.) Resimde Typhoon tarayıcı tarafından elde edilen dPAGE jel flöresanlı bir görüntüdür. Lane NC: Tek başına reaksiyon tampon içinde RFD-EC1 ya RFSS1; Lane CEM-EC: CEM-EC içeren reaksiyon tampon içinde RFD-EC1 ya RFSS1. Işaretleyici: RFD-CE1 0.25 N NaOH, RNA tam bölünme neden olduğu bilinen bir prosedür ile muamele edilmiştir. unclv: RFD-EC1 uncleaved. CLV: fluorofor içeren bölünme parçası.

Şekil 3. (A) Floresans çeşitli bakteri hücrelerinden hazırlanan CEMS RFD-EC1 profili sinyalizasyon. EC: Escherichia coli-K12, PP: Pseudomonas Peli; BD: Brevundimonas diminuta; HA: Hafnia alvei; YR: Yersinia ruckeri; RG: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans; MO: Moraxella osloensis; AI: Acinetobacter lwoffi; SF: Serratia fonticola; BS: Bacillus subtilis; LM: Leuconostoc mesenteroid; LP: Lactobacillus planturum; PA: Pediococcus acidilactici; AO: Actinomyces orientalis. Her bir numune RFD CEM-EC1 eklenmesi, ardından 5 dakika inkübe edildi. (B) dPAGEBir 60-dk sonra reaksiyon karışımı RFD-EC1/CEM-EC analizi. Lane NC1: reaksiyon tamponu tek başına RFD-EC1. Lane NC2: CEM-BS (Bacillus subtilis hazırlanan CEM) içeren reaksiyon tampon içinde RFD-EC1. Tek bir E. içeren bakteri kültürü alınan CEM-EC içeren reaksiyon tampon içinde RFD-EC1: 4, 8, 12, 16 ve 24 ile etiketlenmiş şeritlerinin 4 büyüyen bir süre sonrasında coli hücresi, 8, 12, 16 ve 24 saat idi.

Tartışmalar

Sık görülen bakteriyel algılama yöntemleri çoğu bugün de yavaş (klasik mikrobiyal) veya teknik olarak zor bir (antikor, PCR) vardır. Böylece, algılama araçları yeni nesil hız ve basitlik doğru hitap gerektiğine inanıyoruz. Bu amaçla, bir RNA-kesici, ve bir floresans sinyalinin üretilmesi yoluyla bakteri varlığında bildirmek için basit bir deneyleri geliştirmek için de kullanılabilir floresans-sinyalleşme DNAzyme oluşturduk. Özellikli DNAzyme probu, RFD-EC1, E. büyümesi sırasında üretilen CEM aktive edilir kültür ortamına coli. Bizim yöntemi algılama hedef olarak bir bakterinin ham ekstrasellüler karışımları kullanan ve zahmetli hedef çıkarma ve güçlendirme adımları atlar olduğundan, çok basit kurmak için kullanılabilir, bakteriyel tespiti için testlerin tipi "mix-ve-oku". Bizim DNAzyme kullanımına dayalı floresans saptama yöntemi ile sınırlı değildir. Örneğin, kolorimetrik tespiti aynı DNAzyme sistem testi kullanarak cBir organik boya ile birlikte yuvarlanma daire amplifikasyon yararlanan önceden bildirilen yöntem kullanılarak tasarlanabilir. ³² Biz büyük işlem kolaylığı ile yeni bakteriyel biyosensörler oluşturmak için çekici bir cadde gibi bakteriyel tespiti için DNAzymes kullanımını öngörüyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası veya model
Agar	BioShop Kanada	AGR003
Amonyum persülfat (APS)	BioShop Kanada	AMP001
Akrilamid / Bis-akrilamit (% 40, 29:1)	BioShop Kanada	ACR004
Asit borik	BioShop Kanada	BOR001
Bromofenol mavi	Sigma-Aldrich	B8026
EDTA	EM Bilim	EXO539-1
HCl	Sigma-Aldrich	38281
HEPES	Bioshop Kanada	HEP001
LB broth	Sigma-Aldrich	L3022
MgCl2	EMDKimyasallar	B10149-34
NaCl	BioShop Kanada	SOD002
NaOAc	Merck Kimyasallar	SXO255-1
NaOH	Merck Kimyasallar	SXO590-1
SDS	BioShop Kanada	SDS001
TEMED	BioShop Kanada	TEM001
Tris-bazlı	BioShop Kanada	BST666
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Üre	BioShop Kanada	URE001
Xylenecyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126
DNA konsantratör	Thermo Scientific	Savant DNA SpeedVac 120
Millex filtre ünitesi	Millipore	SLGP033RS
Jel yükleme ipuçları	DiaMed	TEC200EX-K
ImageQuant yazılım	Moleküler Dinamik	Sürüm 5.0
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34705
Mini Vortexer	VWR	58816-121
Parafilm	PECHINEY Plastik Ambalaj	PM996
Petri	Fisher Scientific	Fisherbrand 08-757-12
Stripettor Plus (Pipet tabancası)	Corning	07764714
Quartz küvetler	Varian Inc	66-100216-00
Shaker / İnkübatör	New Brunswick Scientific	Classic Serisi C24
Typhoon Tarayıcı	GE Healthcare	9200 Değişken modu
Santrifüj	Beckman Coulter	Allegra X22-R
UV Spektrofotometre	Thermo Scientific	GenesysUV 10
Floresans Spektrofotometre	Varian Inc	Cary Eclipse