Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Özet

Enfekte THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm testi In vitro Ile Leishmania donovani Anti-leishmanial ilaç tarama için optimize edilmiştir. Tahlil THP1 hücreleri, promastigotlar enfeksiyonu, testi ilaçlar, infekte makrofajların kontrollü lizis, amastigotes kurtarılması promastigotlar ve izleme promastigote büyüme dönüşüm ve florometrik tayini ile yayılması ile tedavi farklılaşma içerir.

Özet

Leishmaniasis çoğunlukla özellikle gelişmekte olan ülkelerde, yoksulların en yoksulları etkileyen, dünyanın en ihmal edilen hastalıklardan biridir. 350 milyondan fazla insan leishmaniasis yakalanma riski olarak kabul edilir ve yaklaşık 2 milyon yeni vaka yılda ¹ meydana gelir. Leishmania donovani Visseral leishmaniasis (VL), hastalığın en ölümcül formu etkeni. Leishmaniasis tedavisinde kullanılan ilaçların tercih ² sınırlıdır; mevcut tedavilerin sınırlı etkinlik sağlar ve tedavi edici dozlarda pek çok zehirlidir. Buna ek olarak, ilk basamak tedavi ilaçların çoğu zaten çoklu ilaç direnci ³ artan nedeniyle programı kaybetti. Anti-leishmanial ilaçların mevcut boru hattı da ciddi tükenmiş. Sürekli çabaları yeni bir anti-leishmanial ilaç keşfi boru hattı zenginleştirmek için gerekli, ve bu çaba in vitro tarama modellerinde uygun mevcudiyetine bağlıdır vardır.

in vitro promastigotlar ⁴ ve axenic amastigotes deneyleri ⁵ öncelikle Ancak, hücre içi amastigotes ile karşılaştırıldığında, önemli hücre, fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler farklılıklar için uygun olmayabilir anti-leishmanial ilaç taraması için kullanılır. Makrofaj-amastigotes modelleri ile Tahliller leishmaniasis patofizyolojik durumlarda en yakın olarak kabul edilir ve bu nedenle in vitro tarama için en uygun vardır. Ayrılmış, non-bölme insan akut monositik lösemi hücreleri (THP1) izole birincil makrofaj alternatif olarak (bir çekici hale) ve hücre içi amastigotes karşı farklı bileşiklerin anti-leishmanial etkinliğinin test edilmesi için kullanılabilir.

Burada, biz saf bileşiklerin taranması ve eşya doğal için Leishmania donovani ile in vitro enfekte farklılaşmış THP1 hücreleri ile bir parazit-kurtarma ve dönüşüm tahlil sunmakucts özü ve hücre içi Leishmania amastigotes karşı etkinliğinin belirlenmesi. Dışı bölme makrofajlar, THP1 hücreleri (1) farklılaşma, L. ile makrofajların (2) enfeksiyonu: tahlil aşağıdaki adımları içerir donovani metacyclic promastigotlar, test ilaç, enfekte makrofajlar (4) kontrollü parçalanması, (5) serbest / amastigotes kurtarma ve promastigotlar canlı amastigotes (6) dönüşümü ile enfekte hücrelerin (3) tedavi. Tahlil promastigotlar dönüşümü yeteneklerini üzerinde minimal etkisi ile canlı intraselüler amastigotes neredeyse komple kurtarma ulaşmak için Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin kontrollü lizis deterjan tedavisi kullanılarak optimize edildi. Farklı makrofaj: promastigotlar oranları maksimum enfeksiyon elde etmek için test edildi. Enfeksiyon Kantitasyonu canlı dönüşümü yoluyla yapıldı, kurtarılan Leishmania bir alam kendi büyüme promastigotlar ve değerlendirilmesinde amastigotes96-mikroplatelerde arBlue florometrik tahlil. Bu testte, şu anda kullanılmakta mikroskobik, transgenik muhabir gen ve dijital görüntü analizi testleri ile karşılaştırılabilir. Bu testte sağlam ve sadece canlı ve ölü amastigotes ayırd edemeyebilirler muhabiri gen ve görüntü analizi testleri ile karşılaştırıldığında canlı intrasellüler amastigotes ölçer. Ayrıca, tahlil anti-leishmanial ilaç mevcut panel ile doğrulandı ve başarılı bir şekilde büyük ölçekli saf bileşiklerin tarama ve doğal ürün türevleri (Tekwani ve ark. Yayınlanmamış) bir kütüphane ile tatbik edilmiştir.

Protokol

1. THP1 Hücre Kültürü koruyun ve Altkültür

1. _Bir% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de RPMI-1640 ortamı içinde THP1 hücreleri (% 10 FBS ve pH 7.4 ile) uygun olmalıdır.
2. Altkültür hücreleri 1x10 ⁶ hücre / ml aşmasını hücre sayımı önlemek için haftada iki kez. Bu onların dönüşüm yeteneğini korumak için önemlidir.

2. Korumak ve Altkültür Leishmania donovani promastigotlar Kültür

1. L. koruyun RPMI-1640 yılında donovani promastigotlar (S1, Sudan suşu) 26% 10 FBS ile orta (Sodyum Bikarbonat ve Sodyum Piruvat olmadan) ° C
2. Altkültür L. donovani 20-25x10 ⁶ promastigotlar / ml.Caution aralığında en yüksek konsantrasyon hücreleri ile, haftada iki kez promastigotlar: Bütün ortam ve çözümler kullanımdan önce oda sıcaklığına getirilmesi gerekmektedir.

3. A 9 tohumlama ve THP1 hücrelerinin farklılaşma6-Mikroplaka ve 16 odası Cam Kültür Slayt.

1. % 10 ısı inaktive FBS ile RPMI-1640 yılında dört günlük bir hücre kültürü 2.5x10 ⁵ hücre / ml (hücre sayısı 10 ⁶ hücre / ml 'yi geçmemelidir) ve hücre sayımı ile seyreltilmiş THP1 kültür hazırlayın. Her bir 16-kuyu oda slaydı için her bir 96 kuyulu plaka ve kültür 4 ml kültür 20 ml hazırlandı.
2. Forbol 12-miristat seyreltilmiş hücre kültürü süspansiyon 13-asetat (PMA) (THP1 ayrımında) (50 mikrogram / DMSO ml stok 10 μl/20 ml kültür) (seyreltilmiş hücreler kültürde nihai PMA konsantrasyon olmalıdır ekle 25 ng / ml).
3. Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay karşılaştırmak için, açık, düz dipli, 96-plaka ve 16 odası, cam, mikroskopik kültürü slayt eşzamanlı deneyleri kurmak.
4. Her iyi veya odasına THP1-PMA-tedavili hücrelerde 200 ul dağıtın.
5. 96-p inkübehücrelerin hemen hemen tam bir türev sağlamak için% 5'lik _CO2 kuluçka makinesi, bir gece boyunca 37 ° C de ilişkilidir ve 16-iyi oda slaytlar.

Not: Normalde süspansiyon büyümeye THP1 hücreler, yapışık makrofajlar ayrılır.

4. Leishmania donovani promastigotlar ile dönüştürülmüş THP1 hücrelerinin enfeksiyon

1. Leishmania donovani promastigotlar ile farklılaşmış THP1 hücre kültürü enfeksiyon için, parazitlerin çoğunluğu infektif metacyclic aşaması (uzun silindirik formlar, ~ 5-6 gün eski kültür) olmalıdır.
2. Parazit oranı 1:10 THP1 hücre Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Promastigote-Kurtarma-Dönüşüm-Testi hem de enfeksiyon için en uygunudur.
3. L. seyreltilmiş bir kültür hazırlayın dan: donovani 2.5x10 ⁶ parazit / ml bir parazit sayısı (parazit oranı = 1:10 THP1 hücreleri) ile promastigotlar% 2 FBS ile RPMI-1640 ortamı içinde bir 5-6 günlük bir kültür.
4. Adım 3.5 (THP1 hücre kültürü gece boyunca farklılaşma sonra), ve levhalar oda slaytlar çıkarmak orta kaldırmak ve serum içermeyen RPMI-1640 ortamı ile bir defa hücre kültürleri yıkayın.
5. Dikkatli bir şekilde yıkamadan sonra PMA ile tedavi edilen serum içermeyen, sıcak, RPMI-1640 (~ 37 ° C) orta, L. seyreltilmiş 200 ul kültür ile serum içermeyen aracı madde ile yerine THP1 hücreleri donovani promastigotlar (2.5x10 ⁶ parazitler / ml) aşamasında 4,3. Her plaka ve 16-kuyu odası slaytlar THP1 hücreleri olmadan THP1 parazit olmaksızın hücreleri ve parazitlerin kontrol kuyuları ayarlayın.
6. THP1 hücre kültürüne parazit ilave edildikten sonra, 37 plaka ve slaytlar inkübe ° C,% 5 parazitler THP1 farklılaşmış hücreleri enfekte izin verecek şekilde 24 saat boyunca _CO2.

5. Testi Uyuşturucu / Bileşikleri ile Enfekte makrofajlar Tedavisi

1. TestAmfoterisin B, pentamidin ve tarama için standart anti-leishmanial ilaç olarak Miltefosine. Su ya da DMSO gibi reaktif tabloda belirtilen içinde ilaç / Test bileşiklerinin stok solüsyonları hazırlanır. 6 konsantrasyonlarda her ilaç bileşik sınayın.
2. Seri olarak% 2 FBS ile RPMI-1640 ortamı ile yeni bir 96-kuyucuklu levha ya da 2 ml'lik tüp (oda slaytlar için) olarak (1:5) standart ilaç ve test bileşiklerinin seyreltik. Bu plaka ilaçlar / test bileşiği konsantrasyonları nihai konsantrasyonlar 2X vardır.
3. L. ile enfekte kültür plakları ve oda slaytlar yıkayınız donovani promastigotlar (adım 4.5 'dan itibaren) serumsuz, RPMI-1640 ortamı ile en az 5 kez. Her kuyu / odasına 100 ul kültür ortamı (% 2 FBS ile RPMI-1640) ekleyin. Birden yıkama olmayan içselleştirilmiş promastigotlar tümüyle kaldırılmasını sağlamak için gereklidir.
4. Her iyi veya odasına seri-seyreltilmiş standart anti-leishmanial ilaçlar veya test bileşikleri 100 ul orta ekleyin. Enfeksiyonu ayarlamated THP1 hücreler her plaka / kamara slayt eşzamanlı ilaçlar olmadan denetler.
5. 37 plakaları ve oda slaytlar inkübe ° C, 48 saat _boyunca% 5 CO2.

6. Odası Slayt Boyama, Floresan Mikroskop Görüntüleme ve Görüntü Analiz Enfeksiyon miktarının ve İlaç Tedavi Etkisi

1. 48 saat inkübasyondan sonra, serum içermeyen RPMI-1640 ortamı ile oda kayar 3 kez yıka. Slaytlardan plastik odaları soyun ve 30 saniye süreyle metanol slaytlar daldırarak hücreleri düzeltmek. Kurutma için hava akımı altında biyo-kukuleta slaytlar bırakın.
2. (1:2,000) stok (10.000 X) su ile seyrelterek bir SYBR Green I boyama çözüm (5X) hazırlayın.
3. I, oda sıcaklığında 15 dakika için çözelti leke seyreltilmiş SYBR Yeşil ile karanlık koşulları altında slaytlar Leke, su ile bir kez yıkama ve kurutma için hava akış altında slaytlar bırakın.
4. Stai üzerinde tam bir cam lamel yerleştirinmontaj orta yardımıyla ned slayt.
5. THP1 hücrelerin dijital görüntüler yakalayın: enfeksiyon (boş) olmadan, enfeksiyonu olan (kontrol), enfekte hücreleri eşliğinde Nikon Eclipse 90i floresan mikroskop kullanılarak dilüsyondan farklı standart ilaçlar veya test bileşikleri (Şekil 3, 5 ve 6)) ile tedavi NIS eleman AR 3.2 yazılımı tarafından.
6. Makrofaj çekirdekleri (büyük) ve parazit çekirdekleri (kinetoplast küçük), Ulusal Sağlık Enstitüleri (geliştirilen bir yayım-mevcut, Java tabanlı görüntü işleme programıdır ImageJ (Şekil 7), kullanarak Kont http://rsb. info.nih.gov / ij / download ). Başına 100 amastigotes sayısını THP1 hücreleri gibi dönüştürülmüş veri ifade eder.

7. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay: L. Kontrollü lizis donovani Amastigotes ile enfekte makrofajlar

1. Adımdan 96 çukurlu bir mikrolevhadaki yıkanır 5.5 üç serum içermeyen RPMI-1640 kültür ortamı ile kez.
2. Farklı konsantrasyonlarda, 30 için% 0.05 SDS tedavi test ayrı deterjanlar arasında sn kontrollü lizis (kurtarıldı parazit 'canlılığı minimum kayıpla maksimum hücre lizis) için en uygunudur.
3. Son yıkamadan sonra her kuyudan serum içermeyen aracı madde çıkarın ve her bir kuyucuğa RPMI-1640 20 ul (% 0.05 SDS) ekleyin. 30 sn için çalkalanır ve plaka her bir kuyucuğa (% 10 FBS) ile RPMI-1640 180 ul komple ekleyin.
4. Promastigotlar kurtularak amastigotes dönüşüm için 48 saat için 26 ° C sıcaklıkta inkübe plakaları.

8. Dönüştürülmüş Promastigote Kantitatif Analiz (alamarBlue assay)

1. 26, bir 48 saat inkübasyondan sonra ° C, bütün canlı kurtarılmış amastigotes promastigotlar (Şekil 1B) dönüştürülür. 96-p her oyuğuna alamarBlue 10 ul eklelates.
2. 26 ° C'da gece boyunca plaka inkübe edin.
3. Gecede inkübasyondan sonra, 544 nm eksitasyon, 590nm emisyon bir Fluostar Galaxy fluorimeter (BMG Lab Technologies) standart floresan plakaları okuyun.
4. ExcelFit (Şekil 7-9) ile işlem IC bu eğriler ₅₀ / IC ₉₀ değerleri (Tablo 1) ile doz tepki eğrileri (ilaç ya da test bileşiğinin konsantrasyon yüzde büyüme vs) hazırlayın.

9. Parazitler Oranı THP1 Hücrelerinin Standardizasyon

1. Testin duyarlılığı belirlemek için parazit oranı THP1 hücreleri standartlaştırın. Not: Düşük / parazitler numaraları / yüksek enfeksiyon duyarlılığı ve tarama seçicilik ile tehlikeye atabilir.
2. Protokol kullanılması dışında fark (bölüm 3 ve 4) THP1 hücreleri tohumlama ve Leishmania promastigote enfeksiyon için yukarıda tarif izleyerek parazit oranı THP1 hücreleri standardize1:1.25, 1:2.5, 1:5 ve 1:10 gibi parazitler THP1 hücrelerin erent oranları.
3. 16 kamaralı slayt (görüntü analizi için) ve 96-plaka (parazit-kurtarma tahlil için) parazit kurtarma ve görüntü analizi testleri karşılaştırmak formatlarda hem deney hazırla.

10. Kontrollü hücre lizis için ayrı deterjanlar Standardizasyon

1. Bu deneyin temel amacı anlamlı kurtarıldı amastigote parazitlerin canlılığı etkilemeden tamamlandı / maksimum THP1 hücreleri lizis ulaşmak için THP1 hücrelerin kontrollü lizis protokolü optimize etmektir.
2. Farklı konsantrasyonları ile muamele farklı süreler (Şekil 2) bu tür Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 ve SDS gibi değişik deterjanlar test edin.
3. Parazit oranı THP1 hücreleri 1:10 'dur ve diğer koşullar, yukarıda bölüm 1-8 kadar benzerdir.
4. Farklı tedavi süresi için% 0.05 SDS tedavi daha test edins daha kontrollü hücre lizis optimize etmek.

Sonuçlar

Bir kantitatif analiz 24, 48, 72 ve 96 saat sonrası ilaç tedavisi için Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Testi hem yapıldı

L. doğrudan sayma yöntemi, enfeksiyon donovani-enfekte makrofajlar (THP1 hücreleri), aşağıdaki denklem ile hesaplandı:

Amastigotes (amastigotes çekirdeğinin sayma ile belirlenir) / 100 THP1 hücreleri (THP1 hücre çekirdekleri altında sayıldı sayma ile belirlenir) (Şekil 7) ile enfekte olan THP1 hücrelerinin yüzdesi farklı standart veya test bileşiklerinin etkisi incelemek için, daha doğru bir ölçüsüdür transforme bu sayı, doğrudan bileşiklerin genel bir etki ile ilgili olduğu için, bazı önceki kağıtlar de bildirildiği gibi, ya da bir azalma sayesindemakrofaj cells.Infection gelen makrofaj hücreleri veya parazit toplam kaldırma parazitler çeşitli zaman aralıklarında (Şekil 10 ve Tablo 1) için farklı dilüsyonlarda farklı standart ilaçlarla tedavi enfekte THP1 hücrelerin dijital görüntüleri hesaplandı. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Testi için ise bağıl floresans birimleri (RFU) idi okuması ise okuma-out Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Testi için amastigotes infection/100, THP1 hücreleri dönüştürüldü doğrudan infekte makrofajların kurtarıldı canlı Leishmania amastigotes sayısıyla orantılıdır ve promastigotlar dönüşür. AlamarBlue tahlil rutin Leishmania promastigotlar anti-leishmanial ilaç taraması için kullanılır.

Testi başlangıçta standart ve Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin kontrollü lizis için optimize oldu. Amaç için deterjan tre koşulları optimize etmek için yapıldıKurtarılan amastigotes canlılığı üzerine minimal etki THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis verim, olgunun,. Şekil 1 tam tahlil protokolü bir mikroskopik görünümü gösteriyor. Leishmania amastigotes ile enfekte olan bozulmamış THP1 hücrelerinde Şekil 1A 'da görülebilir. Şekil 1B deterjan tedaviden sonra THP1 hücrelerinin lizisi gösterir. Şekil 1C kısmen promastigotlar ve Şekil 1B dönüştürülmüştür Leishmania amastigotes, kurtarılan göstermektedir içine amastigotes hemen hemen tam bir dönüşüm göstermektedir promastigotlar ve sonraki yayılması. Bu dönüştürülmüş promastigotlar büyüme kantitatif alamarBlue eklenmesi ve bir mikroplak okuyucu üzerinde floresans ölçümleri ile izlenebilir. NP-40 (Şekil 2A) ve Triton X-100 (Şekil 2B) ile muamele enfekte THP1 hücreleri lize, fakat aynı zamanda canlılığı etkilemiş veKurtarılan amastigotes dönüşümü. Tween 20 (Şekil 2C) ve Tween 80 (Şekil 2D) ile muamele transforme promastigotlar düşük sayılar ile gösterildiği gibi amastigotes tamamlanmamış bir kurtarma içine çıkan, THP1 hücrelerinin lizisi en uygun yol açmamıştır. 30 sn için% 0.05 SDS (Şekil 2E) ile tedavi Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis vermiştir ve kurtarılan amastigotes canlılığı ve dönüşüm etkilemedi. Diğer optimizasyon sn canlı Leishmania amastigotes (Şekil 2F) en yüksek kurtarma vermiştir 20-30 için% 0.05 SDS ile hücrelerin tedavisinin gösterdi. Sonraki deneylerde, 30% 0.05 SDS ile muamele san kullanılmıştır. SDS tedavisi için prosedür, tek ya da çoklu plakalar için de aynıdır. Birden plaklarda SDS tedavi kanallı pipet ile sütun sütun uygulanmıştır. Serum içermeyen aracı madde tüm 8 levhanın bir sütun kuyuları ve 20 ve mu çıkarıldı,% 0.05 SDS l, sütun 8 kuyu içinde ilave edildi ve% 10 FCS içeren RPMI-1640 ile 30 saniye sonra seyreltildi. Testin ilk standardizasyon sırasında, plaka olmayan içsel promastigotlar için mikroskop altında kontrol edildi. Beş yıkamanın bir asgari standart bileşikler ve üç yıkamalar SDS tedavi adım 7'den önce gerekli olduğu ile enfekte makrofaj hücrelerinin tedavisinde 5 adımda önce parazitlerin giderilmesi için gerekli idi. Bu yüzden, hücreler, 8 kez yıkanmış ve herhangi bir görünür olmayan içsel promastigotlar enfekte THP1 hücrelerinin lizisi kontrol önce kaldı.

Sayısal Görüntü Analizi ve Doğrudan Sayma

Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerin dijital görüntüleri (Şekil 3 SYBR Green I ile boyanma özelliği kinetoplast DNA ile makrofaj çekirdekler ve intraselüler Leishmania çekirdekleri Hem floresan filtreleri altında gözlendi sonra Nikon Eclipse 90i floresan mikroskop yakalandı). Ayrıca, enfekte THP1 hücrelerin görüntüleri de DIC altında ele geçirildi. Görüntüler hem birleşti edildiğinde, intrasellüler amastigotes ile THP1 hücrelerin anahatları (Şekil 4) daha net görüldü. ImageJ yazılımı bu görüntüleri analiz etmek için kullanılmıştır. ImageJ Sağlık (National Institutes of geliştirilen bir kamu alanı, Java tabanlı, görüntü işleme programıdır http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). ImageJ Java eklentileri ve kaydedilebilir makroları aracılığıyla genişletilebilirlik sağlayan bir açık mimarisi ile dizayn edilmiştir. Özel toplama, analiz ve işleme eklentileri ImageJ built-in editörü ve bir Java derleyicisi kullanılarak geliştirilebilir. ImageJ tarafından THP1 hücrelerin çekirdeklerinde ve parazit çekirdeklerin sayma diferansiyel için, görüntü ImageJ açıldı. Hücre sayacı Yazılımı eklenti Çözümle seçenek bulundu. Görüntü başlatıldı ve hücre sayacı tip 1 THP1 c için seçildiell çekirdek ve hücre sayacı tip 2 parazitin çekirdeği (Şekil 3) için seçildi. Diferansiyel sayma en az 200 THP1 hücre çekirdeğine ve bu THP1 hücre çekirdeğinde mevcut hücre içi amastigotes için yapıldı. Parazit-kurtarma tahlil ve görüntü analiz yöntemi ile karşılaştırılması farklı makrofaj ile THP1 hücreleri enfektivite değerlendirmek için yapılmıştır:. Promastigote oranları: promastigotlar oranları (Şekil 4) Şekil 5, farklı makrofaj de THP1 hücrelerinde diferansiyel enfektivite temsil eder. Her iki yöntem de benzer sonuçlar ve makrofaj gösterdi: 1:10 promastigote oranı optimum ve tekrarlanabilir enfektivite vermiştir.

Parasite-rescue/transformation tahlil ve dijital görüntü analizi için koşulları optimize edildiğinde, bu ölçümlerin yarar anti-leishmanial ilaç taraması için değerlendirildi. Leishmania ile enfekte THP1 hücreleri standart bir farklı konsantrasyonları ile tedavi edilmiştiryani nti-leishmanial ilaçlar Amfoterisin B, 24 ile 96 saat arasında değişen farklı zaman aralıkları için pentamidin ve Miltefosine. Parazit için deneme / dönüşüm testi üç nüsha olarak yapıldı kurtarıldı ve sayma yöntemi ile doğrudan hücrelerin deney iki kopya halinde yapıldı. Şekil 6 işlenmemiş ve Leishmania-enfekte bulaşmış bulaşmamış, kontrol, THP1 hücreleri tedavi kontrolü mikroskobik görüntüleri gösterir. Doz tepki eğrileri, parazit-kurtarma ve dönüşüm tahlil (transforme parazitler vs ilaç konsantrasyonu) ve görüntü analizi deneyi (amastigotes/100 THP1 hücrelerinin sayısı) (Şekil 7-9) elde edildi. Ilaçların IC ₅₀ ExcelFit göre hesaplanmıştır ve Tablo 1'de sunulmaktadır. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay benzer sonuçlar gösterdi. Dijital Görüntü-Analiz-Direk-Sayım-Assay erken 24 zaman noktalarında ve 48 saat ilaç t sırasında daha az uygun olduğureatments, Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay ilaç tedavileri sonrası 24-96 saat boyunca tüm zaman noktalarında bildirilen değerleri ile daha tutarlı sonuçlar gösterirken. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay ile sonuçlarda bu fark Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma ilaç tedavisinin erken dönemlerinde cansız amastigotes varlığı nedeniyle olabilir -Testi.

Şekil 1. Leishmania donovani bir mikroskopik görünümü promastigotlar için kurtarma ve dönüşüm amastigotes. A - Leishmania amastigotes ile enfekte Bağlanan THP1 hücreleri, B - kontrollü parçalanması C sonra yapışkan, enfekte THP1 hücreleri - enfekte THP1 makrofaj hücreleri D kurtarıldı amastigotes itibaren Leishmania donovani promastigotlar dönüşenler - tran Büyüme ve çoğalmasformed Leishmania donovani promastigotlar.

Farklı deterjan ile Leishmania ile enfekte THP1 hücrelerinden amastigotes arasında THP1 hücreleri ve kurtarma lizis Şekil 2. Promastigotlar canlı Leishmania donovani amastigotes ve dönüşümün maksimum kurtarma ulaşmak için enfekte THP1 hücrelerin kontrollü lizis optimizasyonu. Analizi. İki deterjan konsantrasyonu (% 0.05 ve% 0.1) ve arıtma için iki zaman dilimi (30 saniye ve 60 saniye) test edilmiştir. RFU = rölatif floresan birimleri. Her bir çubuk yinelenen gözlemler ortalama temsil eder. [A] NP-40 ile tedavi edilen THP1 hücrelerinin lizisi neden olur ve ayrıca kurtarılan amastigote parazitlerin canlılığı etkilenir. [B] Triton X-100 treatment THP1 hücrelerinin lizisi neden olur ve ayrıca kurtarılan amastigote parazitlerin canlılığı etkilenmiş [C] Tween 80 amastigotes kurtarmak için THP1 hücrelerinin lizisi kısmi neden olmuştur. [D] Tween 80 amastigotes kurtarmak için THP1 hücrelerinin lizisi kısmi neden olmuştur. [E ] SDS tedavi THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis neden ve% 0.05 / 30 kurtarıldı amastigotes canlılığı etkilemez vermedi sn. [F 20-30 için% 0.05 SDS] Tedavi sn THP1 hücrelerin neredeyse tam lizis neden ve yaşayabilir bir parazit kurtarıldı promastigotlar dönüşmek amastigotes. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. Leishmani ile in vitro enfekte farklılaşmış bir THP1 hücrelerinin Floresan dijital görüntübir donovani amastigotes. Karakteristik kDNA ayrıca her bir parazit çekirdek ile görülebilir. Makrofaj çekirdeği (mN) (1) ve parazit çekirdekleri (pN) (2) enfeksiyon nicel değerlendirmesi için ImageJ analiz yazılımı tarafından farklı olarak işaretlenmiş ve farklı olarak sayılabilir. Miktar amastigotes/100 THP1 hücrelerinin sayısı olarak yapıldı.

Şekil 4. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay (alt panel) ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay (üst panel) arasında karşılaştırma. Makrofaj: 1:10 promastigote oranı optimal infeksiyon vermiştir. Hem benzer sonuçlar gösterdi. Parazit-kurtarma denemesi bazı arka plan değerleri gösterdi. Her çubuk gösterileri yinelenen değerleri ortalamasıdır.

Şekil 5 farklı THP1 tarafından Leishmania promastigotlar ile enfekte THP1 hücreleri:. Promastigote oranı. Amastigotes/100 THP1 hücrelerinin sayısı olarak nicel sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir.

Şekil 6. Leishmania donovani ile enfekte THP1 hücrelerin Dijital görüntüler (Floresan + DIC) değişik süreler için standart anti-leishmanial ilaçlarla tedavi sonrasında amastigotes. Sonuçlar amastigotes/100 THP1 hücre sayısı gibi niceliksel ve arıtılmamış kontrollere kıyasla yüzde büyüme hesaplamak ve IC ₅₀ değerlerini belirlemek için kullanılmıştır.

Şekil 7. Karşılaştırılması Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve anti-leishmanial uyuşturucu taraması (Amophotericin B) Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Testi. Infekte makrofajların farklı dönemler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC ₅₀ (mg / ml) değerleri Excelfit tarafından doz yanıt eğrisi hesaplanmıştır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 8., Bir Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay Karşılaştırılmasınti-leishmanial uyuşturucu taraması (pentamidin). Infekte makrofajların farklı dönemler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC ₅₀ (mg / ml) değerleri Excelfit tarafından doz yanıt eğrileri hesaplandı. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 9. Karşılaştırılması Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve anti-leishmanial uyuşturucu taraması (Mitefosine) için Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Testi. Infekte makrofajların değişik süreler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. ^IC50 (ug / ml) değerleri Excelfit ile doz tepki eğrilerinden yola çıkılarak hesaplanmıştır.Büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Testi İlaç	24 saat bir		48 saat bir		72 saat bir		96 saat bir
	IACA b	PRTA c	IACA b	PRTA c	IACA b	PRTA c	IACA b	PRTA c
Amfoterisin B	0.24 ± 0.03	0.17 ± 0.01 *	0.12 ± 0.04	0.20 ± 0.07	0.06 ± 0.01	0.06 ± 0.01	0.11 ± 0.03	0.10 ± 0.03
Pentamidin	> 10	2.55 ± 1.16 *	2.88 & plusmn; 0.58	1.43 ± 0.91	1.24 ± 0.35	1.52 ± 0.16	0.71 ± 0.63	0.98 ± 0.33
Miltefosine	0.38 ± 0.02	0.19 ± 0.08 *	0.24 ± 0.06	0.30 ± 0.08	0.36 ± 0.02	0.16 ± 0.06	0.21 ± 0.15	0.17 ± 0.10

Tablo 1. Dijital Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve anti-leishmanial ilaç tarama için Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay Karşılaştırılması. Infekte makrofajların farklı dönemler için standart anti-leishmanial ilacın farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. IC ₅₀ (mg / ml) değerleri Excelfit (Şekil 7-9) ile doz yanıt eğrileri hesaplandı ^bir saati sonrası ilaç tedavisi, ^b. IACA = Görüntü Analizi ve Doğrudan SaymaAssay; ^c PRTA = Parazit-Kurtarma ve Dönüşüm Testi. Verilen değerler ug / ml olarak IC ₅₀ (parazit büyüme içinde en az% 50 inhibisyonuna neden olan ilaç konsantrasyonu) olan ve en az üç deneyin ortalaması ± SD vardır. * (<0.05) istatistiksel olarak farklı IACA ile _IC50 değerleri karşılaştırıldı.

Tartışmalar

Makrofaj-amastigote modellere dayalı anti-leishmanial ilaç tarama için kullanılabilecek birkaç yöntem vardır. Tahliller ana hayvanlardan yani peritoneal eksuda hücreleri (PEC), periferik kan monosit hücrelerinde (PBMC) toplanan makrofajlar ile yapılabilir ⁶ ya da kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM) veya fare gibi monositik hücre hatları (J774 ve RAW264.7 ) ⁷ ve insan (THP1, U937, HL-60) ⁸ monositik hücreleri. Konak hücreler bölünerek kullanmak testleri, parazit ve konak hücre sayısı hem de ilaç aktivitesi karıştırıcı etkisi dikkate alınmasının sağlanması gerekmektedir. Bu tür fareler ve sıçanlar gibi çeşitli kaynaklardan toplanan farklılaşmış birincil makrofajlar doğada olmayan bölünmesi, ancak bu hücre hazırlıkları homojen hücre popülasyonlarının olmayabilir. Monositik hücre-kaynaklı hücre hatları doğal olarak homojen olan ve makrofaj-amastigote bazlı tarama için iyi bir modeldir. Farklı monositik hücre hatları dışında, sorumluluk yönünrentiated THP1 hücrelerinin (insan akut monositik lösemi hücre hattı) olmayan bir bölme monolayer oluştururlar ve primer izole makrofajlara cazip bir alternatif sunabilir.

Makrofaj-amastigote tabanlı tarama çeşitli şekillerde yapılabilir. ⁹ sayma doğrudan hücre ve parazit dayalı klasik mikroskopik değerlendirme emek yoğundur. Otomasyon yokluğu Bu testin yararlılığı sınırlar. Hücrelerinin sayımı zaman alıcı ve bir boyama işlemi ile parazit hayatiyetinin saptanması bu yana IC ₅₀ değerleri arasında yanlış tayin verebilir zordur. Birçok flüoresan boyalar ve monoklonal antikorlar akış sitometrik deneyleri ^{10, 11} için hesaplanan olabilir, bu testler aynı zamanda bağlı olarak tek bir gün için ilaç muamele zaman aralığının daha az hassaslık ve sınırlama ile sınırlıdır. Hücre içi amastigotes ^12,13,14 büyümesi miktarının belirlenmesi için çeşitli haberci gen deneyleri bulunmaktadır. Bir otomated tarama muhabiri genleri kullanarak mümkün olabilir, ancak bu ölçümlerin de bazı dezavantajları var. Öncelikle, bu ölçümlerin çoğunluğu ilaç tarama deney için ideal olmayabilir muhabiri genlerin episomal ifadesi, bakımı için ilaç seçimi gerektirir. Muhabir gen tanıtıldı hangi yolu da parazitin fizyolojik özelliklerini etkiler ve tarama üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Raportör gen bir episomal plazmid parçası ise, raportör nispi çıkış yerine ilaç ¹⁴ aktivitesine göre transfekte edilen plasmidin kopya sayısı (hücreden hücreye göre değişir) bağlı olabilir. Bununla birlikte, ya da genomik mimari bozarak veya sadece dış raportör proteinlerin ¹⁵ varlığı ile biyolojik etkileri olabilir; parazitler raportör gen sağlamak için seçici basınç gerekmez dönüştürülür Bazı raportör parazitleri. Bir raportör gen temelli analizlerde, oradaduyarlılık ve zemin aktivitesi ¹⁶ sorunlar. En önemlisi, muhabir gen ifadesi deneyleri, GFP muhabiri gene15 ile özel bir, çok canlı ve ölü hücre içi amastigotes ayırd edemeyebilirler. Lusiferaz muhabiri gen esas Tahliller canlı ve ölü hücre içi amastigotes arasındaki ayırt edebilir, ancak bu testler için substrat ve hücre lizis tamponu büyük ölçekli tarama ¹⁷ için pahalıdır. Bu dezavantajları ve makrofaj-amastigote tabanlı önceki tarama testlerinin sınırlamaları aşmak için, bu parazit-kurtarma ve dönüşüm testi geliştirilmiş ve optimize ettik. Bu testte iyi bir homojenlik olması ve konak hücreleri gibi, doğal olmayan bölme vardır THP1 hücreleri, esas alınmaktadır.

Burada anlatılan Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay testi intrasellüler amastigotes Dijital-Görüntü-Analiz-Direk Sayma dayalı test karşılaştırılabilir. Floresan ve DIC mikroskop, dijital imagMakrofaj çekirdekler ve parazit çekirdeklerin sayma diferansiyel için ImageJ tarafından e analizleri, mikroskobik sayım testi rafine var. Floresan ışığı filtreler ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) filtreler altındaki görüntüleri yakalama intrasellüler parazit daha doğru sayma için dijital görüntü kalitesi iyileştirilmiştir. Floresan ve DIC Hem görüntü net makrofaj hücre hatları ve floresan intrasellüler çekirdekleri ile dijital görüntüler elde etmek için birleştirilebilir. Makrofaj çekirdekler ve parazit çekirdekleri ayirt ImageJ ile tanınabilir. Bu nedenle, Sayısal-Görüntü-Analiz-Direk Sayma-Assay ve Parasite-Kurtarma-Dönüşüm-Assay hem otomasyon ve büyük ölçekli tarama uygulaması için potansiyel var. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Analizinde kritik adımlar şunlardır: (a) Leishmania promastigotlar maruz kaldıktan sonra THP1 hücre kültürlerinde tekrarlanan yıkamalar, olmayan stajyer neredeyse tümüyle kaldırılmasını sağlamak içinalized promastigotlar ve SDS ile enfekte THP1 hücreleri (b) kontrollü bir parçalama. Adımları Hem de otomasyon ile kontrol edilebilir ve testin throughput ile ödün vermemelidir. Varsa test ilaç / bileşiklere Leishmania enfekte THP1 hücrelerinin maruz kaldıktan sonra yıkamanın ikinci adım, kalan olmayan içselleştirilmiş parazitleri kaldırır. Parazit-Kurtarma-Dönüşüm-Assay mevcut mikroskobik, muhabir gen ve görüntü analizi testleri üzerinde önemli avantajlar sunuyor. Testi, Basit, sağlam ve tekrarlanabilir olması büyük ölçekli tarama için otomatik olabilir ve bu nedenle yeni anti-leishmanial ilaç keşfi için büyük bileşiklerin kitaplıkları taramasında önemli uygulama olmalıdır. Bundan başka, aynı zamanda in vitro tahlil Leishmania laboratuar izolatlarına, hem de klinik enfektivite değerlendirmek için kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA)	Sigma-Aldrich USA	P1585	THP1 hücrelerin farklılaşması için gereklidir.
RPMI-1640 ortamı	Invitrogen	23400021
Lab-TeK Odası Sürme Sistemi (16 Daire)	Thermo Scientific Nunc	178599
Berrak, Düz Tabanlı, 96-Well Tabaklar	BD Falcon	353075	Plakalar 96-kuyucuklu plak deneyi gerçekleştirmek
Amfoterisin B	Sigma-Aldrich USA	A4888	Standart anti-leishmanial ilaç (2 mg / ml) DMSO içinde çözülür
Pentamidin izotionat Salt	Sigma-Aldrich USA	P 0547	Standart anti-leishmanial ilaç (2 mg / ml) DMSO içinde çözülür
Miltefosine	EMD Biosciences ABD	475841	Standart anti-leishmanial ilaç serum içermeyen RPMI-1640 ortamı (taze hazırlamak) (2 mg / ml) içinde çözülür
Sodyum stiboglukonat	EMD Biosciences ABD	567565	Standart anti-leishmanial ilacın% 4 FBS ile RPMI-1640 hazırlamak. (1 mg / ml)
Sodyum dodesil sülfat	Sigma-Aldrich USA	L 5750
Floresan Mikroskop	NIKON	ECLIPSE 90i
Floresans Mikroplaka Okuyucu	BMG	Polar Star Galaxy
Orta Montaj	Sigma-Aldrich USA	M 1289
BirlamarBlue	Abd Serotec	BUF012 B
SYBR Green I	Sigma-Aldrich USA	S 9430
Sodyum bikarbonat	Fisher Sci.	523500
Sodyum piruvat	Sigma-Aldrich USA	P2256
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich USA	M6250
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biyolojik	S11050H
Tween 20	Sigma-Aldrich USA	P9416
Tween 80	Sigma-Aldrich USA	P6474
Triton X-100	Sigma-Aldrich USA	T8787
NP-40	Calbiochem	492016