A Parasite Rescue and Transformation Assay auf leishmanientötende Screening gegen intrazelluläre<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Menschliche Akute Monozytenleukämie Cell Line

Zusammenfassung

Ein Parasit-Rettungs-und Transformations-Assay mit THP1 Zellen infiziert In vitro Mit Leishmania donovani Hat für anti-Leishmania Wirkstoff-Screening optimiert. Der Test beinhaltet Differenzierung THP1 Zellen, Infektion mit Promastigoten Behandlung mit Testarzneimitteln, kontrollierte Lyse der infizierten Makrophagen, Rettung Amastigoten, Umwandlung in Promastigoten und Überwachung promastigote Wachstum und die Vermehrung mit einem fluorimetrischen Assay.

Zusammenfassung

Leishmaniose ist eine der weltweit am meisten vernachlässigten Krankheiten, vor allem Auswirkungen auf die Ärmsten der Armen, vor allem in den Entwicklungsländern. Über 350 Millionen Menschen sind gefährdet, sich mit Leishmaniose angesehen, und rund 2 Millionen neue Fälle auftreten, jährlich ^1. Leishmania donovani ist der Erreger für die viszerale Leishmaniose (VL), die meisten tödlichen Form der Krankheit. Die Auswahl der Medikamente zur Behandlung von Leishmaniose ist begrenzt ^2; aktuellen Behandlungen bieten begrenzte Wirksamkeit und viele sind giftig in therapeutischen Dosen. Darüber hinaus haben die meisten der First-Line Behandlung Medikamente bereits ihren Nutzen durch die zunehmende multiple drug resistance ³ verloren. Die aktuelle Pipeline von Anti-Leishmania Medikamenten ist ebenfalls stark dezimiert. Nachhaltige Anstrengungen sind nötig, um ein neues Anti-Leishmania Wirkstoffforschung Pipeline zu bereichern, und dieses Bestreben beruht auf der Verfügbarkeit von geeigneten in vitro-Screening-Modelle.

In vitro Promastigoten ⁴ und axenischen Amastigoten Assays ⁵ sind in erster Linie für anti-Leishmania Wirkstoff-Screening verwendet jedoch möglicherweise nicht geeignet wegen erheblicher zellulären, physiologischen, biochemischen und molekularen Unterschiede im Vergleich zu intrazellulären Amastigoten. Assays mit Makrophagen-Amastigoten Modelle sind als am nächsten zu den pathophysiologischen Bedingungen der Leishmaniose und sind daher die am besten geeignete für die in vitro-Screening. Differenzierte, nicht teilende menschliche akuten monozytären Leukämie-Zellen (THP1) (eine attraktive) Alternative zu isolierten primären Makrophagen und können zum Testen anti-Leishmania Aktivität verschiedener Verbindungen gegen intrazelluläre Amastigoten verwendet werden.

Hier präsentieren wir ein Parasit-Rettungs-und Transformations-Assay mit differenzierten THP1 Zellen in vitro mit Leishmania donovani für das Screening von reinen Verbindungen und Naturstoffen infiziertdukten Extrakte und Bestimmen der Wirksamkeit gegen die intrazelluläre Leishmania Amastigoten. Der Assay umfasst die folgenden Schritte: (1) die Differenzierung von THP1-Zellen, nicht teilende Makrophagen, (2) Infektion von Makrophagen mit L. donovani metazyklische Promastigoten, (3) Behandlung von infizierten Zellen mit Testarzneimitteln, (4) kontrollierte Lyse von infizierten Makrophagen (5) release / Rettung Amastigoten und (6) Umwandlung von Live Amastigoten um Promastigoten. Der Assay wurde unter Verwendung optimierter Detergensbehandlung zur kontrollierten Lyse von Leishmania-infizierten THP1-Zellen eine nahezu vollständige Rettung lebensfähiger intrazellulären Amastigoten mit minimalen Auswirkungen auf ihre Fähigkeit, an Promastigoten Transformation zu erreichen. Verschiedene Makrophagen: Promastigoten Verhältnisse wurden getestet, um maximale Infektion zu erreichen. Die Quantifizierung der Infektion durch die Transformation von Live durchgeführt wurde, Amastigoten geretteten Leishmania um Promastigoten und Auswertung ihres Wachstums durch eine alamarBlue fluorimetrischen Assay in 96-Well-Mikroplatten. Dieser Assay ist vergleichbar mit dem gegenwärtig verwendeten mikroskopische, transgene Reportergen und digitale Bildanalyse-Assays. Dieser Assay ist robust und misst nur die Live intrazellulären Amastigoten Vergleich zu Reportergen und Bildanalyse-Assays, die nicht zwischen lebenden und toten Amastigoten kann differenzieren. Außerdem wurde der Test mit einem aktuellen Panel von Anti-Leishmania Medikamente validiert und wurde erfolgreich auf gross angelegte Screening von reinen Verbindungen und eine Bibliothek von Naturprodukten Fraktionen (Tekwani et al. Unveröffentlicht) angewendet.

Protokoll

Ein. Pflegen und Subculture THP1 Cell Culture

1. Pflegen THP1-Zellen in RPMI-1640-Medium (mit 10% FBS und pH 7,4) bei 37 ° C in einem 5% CO _2-Inkubator.
2. Subculture Zellen zweimal in der Woche Zellzahl von mehr als 1x10 ⁶ Zellen / ml zu verhindern. Dies ist wichtig, um ihre Wandlungsfähigkeit zu halten.

2. Pflegen und Subculture Leishmania donovani Promastigoten Kultur

1. Pflegen Sie die L. donovani Promastigoten (S1, sudan Stamm) in RPMI-1640-Medium (ohne Sodium Bicarbonate und Natriumpyruvat) mit 10% FBS bei 26 ° C.
2. Subculture L. donovani Promastigoten zweimal pro Woche, mit höchster Zellen Konzentration im Bereich von 20-25x10 ⁶ Promastigoten / ml.Caution: Alle Medien und Lösungen sollte die Raumtemperatur vor Gebrauch gebracht werden.

3. Seeding und Differenzierung der THP1 Zellen in einem 96-well Mikrotiterplatten und 16-Kammer Glass Kultur Slide.

1. Bereiten Sie eine verdünnte THP1 Kultur mit Zellzahl von 2.5x10 ⁵ Zellen / ml aus einer vier Tage alten Zellkultur (Zellzahl sollte nicht mehr als 10 ⁶ Zellen / ml) in RPMI-1640 mit 10% Hitze-inaktiviertem FBS. Vorbereitet 20 ml der Kultur für jeden 96-Well-Platte und 4 ml der Kultur für jeden 16-Well-Kammer Folie.
2. Fügen Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA) (zur Unterscheidung von THP1) gegen verdünnte Zellkultur Suspension (10 μl/20 ml Kultur aus dem Bestand von 50 ug / ml in DMSO) (final PMA-Konzentration im verdünnten Zellen Kultur sollte 25 ng / ml).
3. Um das Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay zu vergleichen, richten Sie die Tests gleichzeitig klar, mit flachem Boden, 96-Well-Platte und 16-Kammer-, Glas-, mikroskopische Kultur Folie.
4. Geben Sie 200 ul THP1-PMA-behandelte Zellen in jede Vertiefung oder Kammer.
5. Inkubieren Sie die 96-well plates und 16-Well Chamber Slides in einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator über Nacht fast vollständige Differenzierung der Zellen zu ermöglichen.

Anmerkung: Die THP1-Zellen, die in Suspension wachsen normalerweise werden in adhärente Makrophagen differenziert.

4. Infektion der transformierten THP1 Zellen mit Leishmania donovani Promastigoten

1. Für die Infektion von differenzierten THP1 Zellkultur mit Leishmania donovani Promastigoten, sollte die Mehrheit der Parasiten im infektiösen metazyklische Stufe (lange zylindrische Formen, ~ 5-6 Tage alten Kultur) sein.
2. Eine 1:10 THP1 Zelle Parasiten-Verhältnis ist optimal für die Infektion sowohl im Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und der promastigoten-Rescue-Transformation-Assay.
3. Bereiten Sie eine verdünnte Kultur von L. donovani Promastigoten mit einem Parasiten Graf von 2.5x10 ⁶ Parasiten / ml (für THP1 Zellen: Parasiten-Verhältnis = 1:10) vomein 5 bis 6 Tage alten Kultur in RPMI-1640-Medium mit 2% FBS.
4. Von dem Schritt 3.5 (nach nächtlichem Differenzierung THP1 Zellkultur) herausnehmen die Platten und Chamber Slides, Entfernen des Mediums und waschen die Zellkulturen einmal mit serumfreiem RPMI-1640-Medium.
5. Nach sorgfältigem Waschen der PMA-behandelten THP1 Zellen mit serumfreiem, warm RPMI-1640 (~ 37 ° C)-Medium, ersetzen Sie die Serum-freiem Medium mit 200 ul der verdünnten Kultur von L. donovani-Promastigoten (2.5x10 ⁶ Parasiten / ml) aus Schritt 4.3. Richten Sie die Vertiefungen mit der THP1 Zellen ohne den Parasiten und den Parasiten ohne THP1 Zellen in jeder Platte und 16-Well-Kammer-Objektträgern.
6. Nach der Zugabe von Parasiten der THP1 Zellkultur, inkubieren Sie die Platte und Rutschen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 24 Stunden, damit die Parasiten, die differenzierten THP1 Zellen zu infizieren.

5. Die Behandlung von infizierten Makrophagen mit Test Drugs / Compounds

1. TestAmphotericin B, Pentamidin und Miltefosin als Standard-Anti-Leishmania Medikamente für das Screening. Stammlösungen der Medikamente / test Verbindungen in Wasser oder DMSO in Reagenz Tabelle erwähnt. Testen Sie jedes Medikament Verbindung bei 6-Konzentrationen.
2. Serienmäßig verdünnen (1:5) die Standard-Medikamente und Testverbindungen in einem frischen 96-Well-Platte oder 2-ml-Röhrchen (für Kammer-Objektträgern) mit RPMI-1640-Medium mit 2% FBS. Die Drogen / Testverbindung Konzentrationen in dieser Platte sind 2X von Endkonzentrationen.
3. Waschen Sie die Kultur Platten und Kammer-Objektträgern mit L. infiziert donovani-Promastigoten (aus Stufe 4.5) mindestens 5-mal mit serumfreiem RPMI-1640-Medium. Fügen Sie 100 ul Kulturmedium (RPMI-1640 mit 2% FBS) in jedes Well / Kammer. Die mehrfachen Wäschen sind notwendig, um eine vollständige Entfernung des nicht internalisierten Promastigoten gewährleisten.
4. Fügen Sie 100 ul Medium aus seriell verdünnte Standardlösung anti-Leishmania Drogen oder der Testverbindungen in jede Vertiefung oder Kammer. Richten Sie die Infektionted THP1 Zellen steuert ohne Drogen gleichzeitig in jeder Platte / Kammermusik Folie.
5. Die Platten-und Kammer-Objektträgern bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 48 Stunden.

6. Chamber Slide Färbung, Fluoreszenz-Mikroskop Imaging und Bildanalyse zur Quantifizierung von Infection and Effect of Drug Treatment

1. Nach einer 48-stündigen Inkubation wäscht den Kammerobjektträgers 3 mal mit serumfreiem RPMI-1640-Medium. Ziehen Sie die Kunststoff-Kammern von den Rutschen und fixieren die Zellen durch Eintauchen der Objektträger in Methanol für 30 Sekunden. Lassen Sie die Folien in bio-Haube unter Luftstrom zum Trocknen.
2. Bereiten Sie eine SYBR Green I-Färbelösung (5fach) durch Verdünnung (1:2000) den Bestand (10.000 X) mit Wasser.
3. Flecken auf den Objektträger unter dunklen Bedingungen mit der verdünnten SYBR Green I Fleck-Lösung für 15 min bei Raumtemperatur, einmal mit Wasser und lassen Sie die Objektträger unter dem Luftstrom zum Trocknen.
4. Legen Sie eine volle Deckglas über die stained Schieber mit Hilfe von Eindeckmedium.
5. Erfassen Sie die digitalen Bilder der THP1 Zellen: ohne Infektion (leer), mit einer Infektion (Kontrolle), infizierten Zellen mit verschiedenen Standard-Medikamente oder Testverbindungen in unterschiedlichen Verdünnungen (Abbildung 3, 5 und 6)) mit einem Nikon Eclipse 90i Fluoreszenzmikroskop begleitet behandelt von NIS Elements AR 3,2 Software.
6. Zählen Sie die Makrophagen Kerne (groß) und den Parasiten Kerne (klein mit Kinetoplast) mit ImageJ (Abbildung 7), die eine öffentlich verfügbare, Java-basierte Bildverarbeitung Programm an der National Institutes of Health (entwickelte http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html ). Ausdruck der Daten die Anzahl der Amastigoten pro 100 verwandelt THP1 Zellen.

7. Der Parasit-Rescue-Transformation-Assay: Controlled Lyse von L. donovani Amastigoten-infizierten Makrophagen

1. Wäscht den 96-Well-Mikroplatte aus Schritt 5,5 dreimal mit serumfreiem RPMI-1640 Kulturmedium.
2. Unter verschiedenen Detergentien bei verschiedenen Konzentrationen, 0,05% SDS-Behandlung für 30 sec. getestet ist optimal für kontrollierte Lyse (maximal Zelllyse mit minimalem Verlust der geretteten Parasiten 'Lebensfähigkeit).
3. Entfernen Sie die Serum-freiem Medium aus jedem Well nach der letzten Wäsche und fügen Sie 20 ul RPMI-1640 (mit 0,05% SDS) in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Platte für 30 sec und fügen Sie 180 ul komplettem RPMI-1640 (mit 10% FBS) in jede Vertiefung.
4. Die Inkubation erfolgt bei 26 ° C für 48 Stunden zur Umwandlung der geretteten Amastigoten zu Promastigoten.

8. Quantitative Analyse von transformierten promastigoten (alamarBlue assay)

1. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 26 ° C werden alle lebenden Amastigoten gerettet werden in Promastigoten (1D) transformiert. Fügen Sie 10 ul alamarBlue in jede Vertiefung der 96-Well-pliert.
2. Die Inkubation bei 26 ° C über Nacht.
3. Nach Inkubation über Nacht, lesen die Platten für Standard-Fluoreszenz auf einer Fluostar Galaxy Fluorimeter (BMG Lab Technologies) bei 544 nm Anregung, 590 nm Emission.
4. Bereiten Sie die Dosis-Wirkungs-Kurven (Prozent Wachstum gegen die Konzentration des Medikaments oder Testverbindung) mit ExcelFit (Abb. 7-9) und Compute IC ₅₀ / IC _90-Werte aus diesen Kurven (Tabelle 1).

9. Standardisierung von THP1 Cells Parasiten Verhältnis

1. Standardisierung der THP1-Zellen, Parasiten-Verhältnis, um die Empfindlichkeit des Assays zu bestimmen. Hinweis: Low / High Parasiten Zahlen / Infektion kann mit einer Empfindlichkeit und Selektivität des Screening zu kompromittieren.
2. Standardisieren Sie die THP1 Zellen Parasiten-Verhältnis, indem Sie die oben beschriebenen Protokoll für THP1 Zellen Aussaat und Leishmania promastigote Infektion (Abschnitt 3 und 4) außer Gebrauch diffErent Verhältnisse von THP1-Zellen, Parasiten wie 1:1,25, 1:2,5, 1:5 und 1:10.
3. Der Versuchsaufbau ist sowohl in 16-Kammer Dia (Bildanalyse) und 96-Well-Platte (für Parasiten-rescue-Assay)-Formate, um den Parasiten Rettungs-und Bildanalyse-Assays zu vergleichen.

10. Standardisierung der verschiedenen Reinigungsmitteln für kontrollierte Zelllyse

1. Das primäre Ziel dieses Experiments ist es, das Protokoll für die kontrollierte Lyse der THP1 Zellen maximale / complete THP1 Zellen Lyse hin zu optimieren ohne nennenswerte Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der geretteten amastigote Parasiten.
2. Testen verschiedener Detergenzien wie Tween 20, Tween 80, Triton X-100, NP-40 und SDS bei verschiedenen Konzentrationen und unterschiedliche Dauer der Behandlung (Abb. 2).
3. THP1-Zellen, um Parasiten beträgt 1:10 und andere Bedingungen sind ähnlich wie oben Abschnitte 1-8.
4. Testen Sie die 0,05% SDS Behandlung weiter für eine unterschiedliche Behandlung der Zeits zur weiteren Optimierung der gesteuerten Zelllyse.

Ergebnisse

Eine quantitative Analyse wurde sowohl für Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay für 24, 48, 72 und 96 Stunden nach-medikamentöse Behandlung durchgeführt

In der direkten Zählmethode, Infektion von L. donovani infizierten Makrophagen (THP1-Zellen) wurde durch die folgende Gleichung berechnet:

Die Amastigoten (ermittelt durch Auszählung Amastigoten Kerne) / 100 transformiert THP1-Zellen (ermittelt durch Auszählung an THP1 Zellkernen gezählt) (Abbildung 7) ein genaueres Maß, um die Wirkung von unterschiedlichen Standard-oder Testverbindungen als der Anteil der infizierten Zellen zu analysieren THP1 , wie in einigen früheren Arbeiten berichtet, da diese Anzahl ist direkt mit Gesamteffekt der verwandten Verbindungen, entweder durch eine Abnahmein Parasiten in Makrophagenzellen oder vollständige Entfernung der Parasit aus der Makrophagen cells.Infection wurde aus digitalen Bildern von infizierten Zellen mit unterschiedlichen THP1 Standardarzneimittel bei unterschiedlichen Verdünnungen für verschiedene Zeitintervalle (Abbildung 10 und Tabelle 1) behandelten berechnet. Das Auslesen des Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay wurde Amastigoten infection/100 verwandelt THP1 Zellen, während das Auslesen der Parasite-Rescue-Transformation-Assay war relativen Fluoreszenz Einheiten (RFU), das direkt proportional zur Anzahl lebender Leishmania Amastigoten von den infizierten Makrophagen gerettet und wandeln sich in Promastigoten. Die alamarBlue Test wird routinemäßig für Leishmania Promastigoten anti-Leishmania Wirkstoff-Screening verwendet.

Der Test wurde zunächst standardisiert und optimiert für die kontrollierte Lyse von Leishmania-infizierten THP1 Zellen. Ziel war es, die Bedingungen für Waschmittel tre optimierenatment, die fast vollständige Lyse THP1 Zellen Ausbeute mit minimalen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der geretteten Amastigoten. Abbildung 1 zeigt eine mikroskopische Ansicht der kompletten Testprotokoll. Intakte THP1-Zellen mit Leishmania infiziert Amastigoten kann in 1A zu sehen. 1B zeigt Lyse der Zellen nach THP1 Detergensbehandlung. 1C zeigt gerettet Leishmania Amastigoten, die die teilweise in Promastigoten und 1D zeigt transformiert nahezu vollständige Umwandlung in Amastigoten Promastigoten und deren anschließende Proliferation. Das Wachstum dieser transformierten Promastigoten kann quantitativ unter Zusatz von alamarBlue und Messen der Fluoreszenz an einem Mikroplattenleser überwacht werden. Die Behandlung mit NP-40 (2A) und Triton X-100 (2B) lysiert die infizierten THP1 Zellen, aber es beeinflusste auch die Lebensfähigkeit undTransformation der geretteten Amastigoten. Behandlung mit Tween 20 (2C) und Tween 80 (2D) verursachte keine optimalen Lyse THP1-Zellen, resultierend in einer unvollständigen Rettung von Amastigoten wie durch niedrigen Zahlen von transformierten Promastigoten. Die Behandlung mit 0,05% SDS für 30 sec (2E) ergab fast vollständige Lyse von Leishmania-infizierten THP1 Zellen und hatte keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit und Transformation von geretteten Amastigoten. Weitere Optimierung zeigten, dass die Behandlung der Zellen mit 0,05% SDS für 20 bis 30 sec ergibt höchsten Rettung lebensfähiger Leishmania Amastigoten (2F). In nachfolgenden Experimenten wurde die Behandlung mit 0,05% SDS für 30 sec wurde verwendet. Verfahren für die SDS-Behandlung ist die gleiche für einzelne oder mehrere Platten. In mehreren Platten wurde SDS-Behandlung Spalte für Spalte mit einer Mehrkanalpipette umgesetzt. Serumfreiem Medium wurde aus allen 8 Wells einer Spalte der Platte und 20 & mu entfernt; L 0,05% SDS wurde in 8 Vertiefungen der gleichen Kolonne zugesetzt und verdünnt nach 30 sec mit RPMI-1640 mit 10% FBS. Während der anfänglichen Standardisierung des Assays wurden die Platten unter dem Mikroskop auf nicht internalisierten Promastigoten überprüft. Ein Minimum von fünf Waschungen waren notwendig für die Entfernung von Parasiten vor Schritt 5 der Behandlung von infizierten Makrophagen mit Standard-Verbindungen und drei Waschungen waren notwendig, bevor Schritt 7 SDS Behandlung. Dadurch wurden die Zellen 8 mal gewaschen und keine sichtbaren nicht internalisierten Promastigoten blieb bevor die Kontrolle der Lyse der infizierten THP1-Zellen.

Digital Image Analysis und Direct Counting

Die digitalen Bilder von Leishmania-infizierten Zellen wurden auf THP1 Nikon Eclipse 90i Fluoreszenzmikroskop nach Färbung mit SYBR Green I. Sowohl Makrophagen Kerne und intrazellulären Leishmania Kerne mit charakteristischen Kinetoplast DNA wurden unter den fluoreszierenden Filter eingefangen beobachtet (Abbildung 3). Ferner wurden die Bilder der infizierten THP1-Zellen auch unter DIC eingefangen. Wenn beide Bilder zusammengeführt wurden, wurden die Umrisse THP1-Zellen mit intrazellulärem Amastigoten deutlicher (Figur 4) gesehen. Die ImageJ Software wurde verwendet, um diese Bilder zu analysieren. ImageJ ist ein public domain, Java-basierte, Bildverarbeitungs-Programm an der National Institutes of Health (entwickelt http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). ImageJ wurde mit einer offenen Architektur, die Erweiterbarkeit über Java Plugins und beschreibbare Makros zur Verfügung stellt konzipiert. Benutzerdefinierte Erfassung, Analyse und Verarbeitung Plugins können unter Verwendung von ImageJ den eingebauten Editor und einen Java-Compiler werden. Für Differential Zählen von THP1 Zellen Kerne und Parasiten Kerne durch ImageJ wurde das Bild in ImageJ geöffnet. Zellzähler wurde im Analysieren Option im Plugin der Software gefunden. Das Bild wurde initialisiert und Zellzählers Typ 1 wurde für THP1 c gewähltell Kerne und Zellzählers Typ 2 wurde für Parasiten Kerne (Abbildung 3) ausgewählt. Differenzzählung wurde für mindestens 200 THP1 Zellkerne und die intrazellulären Amastigoten in diesen THP1 Zellkernen durchgeführt. Ein Vergleich der Parasit-Rettungs-Assay und Bildanalyseverfahren wurde zur Bewertung der Infektiosität von THP1-Zellen mit unterschiedlichen Makrophagen hergestellt:. Promastigoten Verhältnisse (Abbildung 4) Abbildung 5 stellt die Differential Infektiosität in THP1-Zellen bei unterschiedlichen Makrophagen: Promastigoten Verhältnissen. Beide Methoden zeigten vergleichbare Ergebnisse und die Makrophagen: promastigote Verhältnis von 1:10 ergab eine optimale und reproduzierbare Infektiosität.

Nachdem die Bedingungen für parasite-rescue/transformation Assay und dem digitalen Bildanalyse wurden optimiert wurde die Nützlichkeit dieser Assays für anti-Leishmanien-Wirkstoff-Screening ausgewertet. Die Leishmania-infizierten THP1-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Standard ein behandeltesnti-Leishmanien Medikamente nämlich Amphotericin B, Pentamidin und Miltefosine für verschiedene Zeitintervalle von 24 bis 96 Stunden. Das Experiment für Parasiten befreit / Transformations-Assay in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurde und das Experiment zur direkten Zellen Zählweise wurde in Doppelbestimmung durchgeführt. Abbildung 6 zeigt mikroskopische Aufnahmen von der Kontrolle nicht infizierten, Kontrolle infiziert unbehandelt und Leishmania-infizierten behandelt THP1 Zellen. Die Dosis-Wirkungs-Kurven wurden aus dem Parasit-Rettungs-und Transformations-Assay (Konzentration des Wirkstoffs über transformierte Parasiten) und der Bildanalyse-Assay (Anzahl der amastigotes/100 THP1-Zellen) (Figuren 7-9) hergestellt. Der IC ₅₀ der Medikamente wurden von ExcelFit berechnet und sind in Tabelle 1 dargestellt. Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay zeigte vergleichbare Ergebnisse. Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay war weniger optimal in den frühen Zeitpunkten 24 und 48 hr Drogen treatments, während der Parasite-Rescue-Transformation-Assay zeigten die Ergebnisse mehr im Einklang mit den gemeldeten Werten bei allen Zeitpunkten während der 24-96 Stunden nach medikamentösen Behandlungen. Dieser Unterschied in den Ergebnissen mit Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay kann aufgrund des Vorhandenseins von nicht lebensfähigen Amastigoten während der frühen Phasen der medikamentösen Behandlung in Digital-Image-Analyse-Direct-Counting -Assay.

Abbildung 1. Eine mikroskopische Ansicht des Leishmania donovani Amastigoten Rettung und Umwandlung in Promastigoten. A - Adhärente THP1-Zellen mit Leishmania infiziert Amastigoten; B - Adhärente, infizierten THP1-Zellen nach kontrollierter Lyse C - Leishmania donovani-Promastigoten aus den Amastigoten von infizierten THP1 Makrophagenzellen D gerettet Transformierte - Wachstum und Proliferation von transformed Leishmania donovani Promastigoten.

Abbildung 2. Optimierung der kontrollierten Lyse von infizierten THP1 Zellen maximale Rettung von Live Leishmania donovani Amastigoten und ihre Umwandlung in Promastigoten erreichen. Analyse der Lyse von THP1 Zellen und Rettung von Amastigoten aus den Leishmania-infizierten THP1 Zellen mit verschiedenen Reinigungsmitteln. Zwei Konzentrationen (0,05% und 0,1%) des Waschmittels und zwei Zeitperioden (30 sec und 60 sec) für die Behandlung wurden getestet. RFU = relative Fluoreszenz-Einheiten. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert von doppelten Beobachtungen. [A] NP-40 Behandlung Lyse THP1 Zellen verursacht und auch Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der geretteten amastigote Parasiten. [B] Triton X-100 treatment verursachte Lyse von Zellen und THP1 auch Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der geretteten Amastigoten Parasiten [C] Tween 80 verursachte partielle Lyse THP1-Zellen, die Amastigoten zu retten. [D] Tween 80 verursachte partielle Lyse THP1-Zellen, die Amastigoten zu retten. [E ] SDS Behandlung verursacht fast vollständige Lyse THP1 Zellen und hatte keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der geretteten Amastigoten bei 0,05% / 30 sec. [F] Die Behandlung mit 0,05% SDS für 20-30 sec verursacht fast vollständige Lyse THP1 Zellen und gerettet lebensfähige Parasiten Amastigoten in Promastigoten verwandeln. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3. Fluorescent Digitalbild einer differenzierten THP1 Zelle in vitro mit Leishmani infizierta donovani Amastigoten. Die charakteristische KDNA können auch miteinander Parasiten Kern gesehen werden. Die Makrophagen-Nukleus (mN) (1) und der Parasit Kerne (pN) (2) können differentiell gekennzeichnet und gezählt durch differentiell ImageJ Auswertesoftware für quantitative Auswertung der Infektion. Die Quantifizierung wurde als Anzahl der amastigotes/100 THP1 Zellen durchgeführt.

Abbildung 4. Vergleich zwischen Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay (unten) und Parasite-Rescue-Transformation-Assay (oberes Bild). Der Makrophage: promastigote Verhältnis von 1:10 ergab optimale Infektion. Beide zeigten vergleichbare Ergebnisse. Der Parasit-rescue-Assay zeigte einige Hintergrundinformationen Werte. Jeder Balken zeigt die mittlere von doppelten Werten.

Abbildung 5 THP1 Zellen mit Leishmania Promastigoten von verschiedenen THP1 infiziert:. Promastigote Verhältnis. Die quantitativen Ergebnisse in Form von amastigotes/100 THP1-Zellen, sind in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 6. Digitale Bilder (Fluorescent + DIC) der THP1-Zellen mit Leishmania donovani infizierten Amastigoten nach Behandlung mit anti-Leishmanien-Standard Medikamenten für verschiedene Zeiträume. Die Ergebnisse wurden als Zahl von amastigotes/100 THP1-Zellen quantifiziert und dazu verwendet, den prozentualen Wachstum gegenüber dem unbehandelten Kontrollen zu berechnen und zu bestimmen, der die IC _50-Werte.

Abbildung 7. Vergleich von Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay für anti-Leishmania Wirkstoff-Screening (Amophotericin B). Die infizierten Makrophagen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der anti-Leishmanien-Standard Medikament für unterschiedliche Zeiträume behandelt. IC ₅₀ (pg / ml) wurden aus der Dosis-Wirkungs-Kurve, die durch Excelfit berechnet. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 8. Vergleich von Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay für einenti-Leishmanien Wirkstoff-Screening (Pentamidin). Die infizierten Makrophagen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der anti-Leishmanien-Standard Medikament für unterschiedliche Zeiträume behandelt. IC ₅₀ (pg / ml) Werte wurden aus den Dosis-Wirkungs-Kurven durch Excelfit berechnet. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 9. Vergleich von Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay für anti-Leishmania Wirkstoff-Screening (Mitefosine). Die infizierten Makrophagen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der anti-Leishmanien-Standard Medikament für verschiedene Zeiträume behandelt. IC ⁵⁰ (pg / ml) Werte wurden aus den Dosis-Wirkungs-Kurven durch Excelfit berechnet.Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Testarzneistoft	24 Stunden ein		48 hr a		72 hr a		96 hr a
	IACA b	PRTA c	IACA b	PRTA c	IACA b	PRTA c	IACA b	PRTA c
Amphotericin B	0,24 ± 0,03	0,17 ± 0,01 *	0,12 ± 0,04	0,20 ± 0,07	0,06 ± 0,01	0,06 ± 0,01	0,11 ± 0,03	0,10 ± 0,03
Pentamidin	> 10	2,55 ± 1,16 *	2,88 & plusmn; 0,58	1,43 ± 0,91	1,24 ± 0,35	1,52 ± 0,16	0,71 ± 0,63	0,98 ± 0,33
Miltefosine	0,38 ± 0,02	0,19 ± 0,08 *	0,24 ± 0,06	0,30 ± 0,08	0,36 ± 0,02	0,16 ± 0,06	0,21 ± 0,15	0,17 ± 0,10

Tabelle 1. Vergleich von Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay für anti-Leishmania Wirkstoff-Screening. Die infizierten Makrophagen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der anti-Leishmanien-Standard Medikament für unterschiedliche Zeiträume behandelt. IC ₅₀ (pg / ml) Werte wurden aus den Dosis-Wirkungs-Kurven durch Excelfit (Abbildungen 7-9) berechnet ^a Hours Beitrag medikamentöse Behandlung;. ^B IACA = Bildanalyse und direkte ZählungAssay; ^c PRTA = Parasite-Rescue and Transformation Assay. Angegebenen Werte sind _IC50 (Konzentration des Wirkstoffs, die 50% Hemmung bei Parasitenwachstums) als ug / ml und sind die Mittelwerte ± SD von mindestens drei Experimenten. * Statistisch unterschiedlich (<0,05) zur IC _50-Werte mit IACA verglichen.

Diskussion

Es gibt mehrere Methoden zur Verfügung für anti-Leishmania Wirkstoff-Screening auf Makrophagen-amastigote Modellen. Assays können mit den Makrophagen von Wirtstieren gesammelt nämlich Peritonealexsudat-Zellen (PEC), periphere Blutmonozyten (PBMC) erfolgen ⁶ oder Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMM) oder in monozytischen Zelllinien wie Maus (J774 und RAW264.7 ) ⁷ und menschliche (THP1, U937 und HL-60) ⁸ monozytären Zellen. Die Assays, die Teilung Wirtszellen verwenden, müssen sicherstellen, dass die verwirrende Auswirkungen von Drogen-Aktivität auf beiden Parasiten und Wirtszellen Zahl betrachtet werden. Die differenzierten primären Makrophagen aus verschiedenen Quellen, wie Mäusen und Ratten gesammelt sind nicht teilende in der Natur, aber diese Zellpräparationen möglicherweise keine homogene Zellpopulationen. Monozyten-abgeleitete Zellinien sind homogen in der Natur sind und ein besseres Modell für die Makrophagen-Amastigoten-basierten Screening. Aus verschiedenen monozytären Zelllinien, unterschiedrentiated THP1 Zellen (menschliche akuten monozytären Leukämie-Zelllinie) können eine nicht-teilenden Monoschicht und bieten eine attraktive Alternative zur primären isolierten Makrophagen.

Die Makrophagen-Amastigoten-basierten Screening kann auf verschiedene Arten erfolgen. Klassische mikroskopische Auswertung der direkten Zell-und Parasiten Zählen ⁹ basiert, ist arbeitsintensiv. Das Fehlen der Automatisierung begrenzt die Nützlichkeit dieser Assay. Zählen von Zellen ist zeitaufwendig und kann zu ungenauen Bestimmung der IC _50-Werte, da die Bestimmung von Parasiten Lebensfähigkeit durch eine Färbung zu geben, ist schwierig. Viele Fluoreszenzfarbstoffe und monoklonale Antikörper können für die durchflusszytometrische Assays ^{10, 11} eingesetzt werden, aber diese Assays sind ebenfalls aufgrund der geringeren Empfindlichkeit und Begrenzung des Zeitintervalls von Arzneimittel-Behandlung, um nur einen Tag beschränkt. Es gibt mehrere verfügbare Reportergenassays zur Quantifizierung des Wachstums von intrazellulären Amastigoten ^12,13,14. Ein Automated Screening kann möglich sein, mit Reportergene, aber diese Tests auch gewisse Nachteile. Erstens erfordern Mehrzahl dieser Assays Wirkstoffselektion zum Aufrechterhalten der episomalen Expression der Reportergene, die möglicherweise nicht ideal für ein Wirkstoffscreening Experiment. Der Weg, um den der Reportergen eingeführt könnte auch Einfluss auf die physiologischen Eigenschaften der Parasiten und haben einen Einfluss auf die Screening. Wenn der Reporter-Gen ist der Teil von einem episomalen Plasmid kann die relative Leistung von Reportergen über die Kopienzahl des transfizierten Plasmid (die je von Zelle zu Zelle) anstatt auf die Aktivität des Medikaments ¹⁴ abhängen. Einige Reporter Parasiten, die transformierten Parasiten brauchen keine selektive Druck, um das Reportergen zu halten sind, aber es könnte biologischen Folgen entweder durch Unterbrechung der genomischen Architektur oder nur durch die Anwesenheit der fremden Reporterproteine ^​​15. In einigen Reportergen basierten Assays bestehenFragen der Empfindlichkeit und Hintergrund-Aktivität ^16. Am wichtigsten ist, können viele der Reportergenexpression Assays, besonders diejenige mit GFP-Reporter gene15, nicht zwischen den lebenden und toten intrazellulären Amastigoten differenzieren. Assays auf Luciferasereportergens Basis kann zwischen lebenden und toten intrazellulären Amastigoten erkennen, aber Substrat und Zelllysepuffer für diese Assays sind für gross angelegte ^Screening-17 teuer. Um diese Nachteile und Einschränkungen der bisherigen Makrophagen-amastigote-basierte Screening-Assays zu überwinden, haben wir entwickelt und diesen Parasiten-Rettungs-und Transformations-Assay optimiert. Dieser Assay basiert auf THP1-Zellen, die eine gute Homogenität aufweisen und nicht-teilenden in der Natur, als Wirtszellen basiert.

Der Parasit-Rescue-Transformation-Assay-Test hier beschriebenen ist vergleichbar mit dem Assay auf Digital-Image-Analyse-Direct-Zählen der intrazellulären Amastigoten basiert. Leuchtstoff-und DIC-Mikroskopie, digitale image Analysen ImageJ für Differential Zählen der Makrophagen Kernen und den Parasiten Kerne haben ferner die mikroskopische Zählung Assay verfeinert. Aufnehmen der Bilder unter Fluoreszenzlicht Filter und Differential-Interferenz-(DIC)-Filter haben die Qualität des digitalen Bildes für eine genauere Zählung der intrazelluläre Parasiten verbessert. Sowohl fluoreszierenden und DIC Bilder können zusammengeführt, um die digitalen Bilder mit klaren Makrophagenzelllinie Umrisse und fluoreszierenden intrazellulären Kerne zu erhalten. Die Makrophagen Kerne und der Parasit Kerne unterschiedlich mit ImageJ erkannt werden. Daher müssen sowohl Digital-Image-Analyse-Direct-Counting-Assay und Parasite-Rescue-Transformation-Assay das Potenzial für die Automatisierung und Anwendung in großem Maßstab Screening. Die kritischen Schritte in der Parasite-Rescue-Transformation-Assay sind: (a) wiederholtes Waschen des THP1 Zellkulturen nach Exposition mit Leishmania Promastigoten, eine nahezu vollständige Abtrennung der nicht-intern sicherzustellen,sierte Promastigoten und (b) gesteuerte Lyse der infizierten Zellen mit THP1 SDS. Sowohl die Schritte können auch mit Automatisierung gesteuert werden und sollten nicht mit den Durchsatz des Assays beeinträchtigen. Der zweite Schritt der Wäschen nach der Exposition der Leishmania infiziert THP1-Zellen zu den Testarzneimitteln / Verbindungen entfernt die verbleibenden nicht internalisierten Parasiten, wenn überhaupt. Der Parasit-Rescue-Transformation-Assay bietet deutliche Vorteile gegenüber bestehenden mikroskopische Reportergen und Bildanalyse-Assays. Der Test ist einfach, robust und reproduzierbar, kann für eine groß angelegte Screening automatisiert werden und sollten daher wichtige Anwendung im Screening von großen Verbindungen Bibliotheken für neue Anti-Leishmania Wirkstoffforschung haben. Ferner kann der Assay auch zur Auswertung klinischer Infektiosität aufgebracht werden, sowie, Labor Isolate von Leishmania in vitro.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz	Firma	Catalog Number	Kommentare
Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA)	Sigma-Aldrich USA	P1585	Erforderlich für die Differenzierung von THP1 Zellen.
RPMI-1640 Medium	Invitrogen	23400021
Lab-Tek Chamber Slide System (16 Kammer)	Thermo Scientific Nunc	178599
Klar, Flat-Bottom, 96-Well-Platten	BD Falcon	353075	Platten durchzuführen 96-Well-Platten-Assay
Amphotericin B	Sigma-Aldrich USA	A4888	Standard-Anti-Leishmanien-Droge in DMSO auflösen (2 mg / ml)
Pentamidin Isothionat Salt	Sigma-Aldrich USA	P 0547	Standard-Anti-Leishmanien-Droge in DMSO auflösen (2 mg / ml)
Miltefosine	EMD Biosciences USA	475841	Standard-Anti-Leishmania Medikament in serumfreiem RPMI-1640-Medium (frisch ansetzen) (2 mg / ml) auflösen
Natriumstibogluconat	EMD Biosciences USA	567565	Standard-Anti-Leishmania Drogen vorzubereiten in RPMI-1640 mit 4% FBS. (1 mg / ml)
Natriumdodecylsulfat	Sigma-Aldrich USA	L 5750
Fluoreszenzmikroskop	NIKON	ECLIPSE 90i
Fluoreszenz Mikroplatten-Reader	BMG	Polar Star Galaxy
Eindeckmedium	Sigma-Aldrich USA	M 1289
einlamarBlue	AbD Serotec	BUF012 B
SYBR Green I	Sigma-Aldrich USA	S 9430
Sodium Bicarbonate	Fisher Sci.	523500
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich USA	P2256
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich USA	M6250
Fötales Rinderserum	Atlanta Biologicals	S11050H
Tween 20	Sigma-Aldrich USA	P9416
Tween 80	Sigma-Aldrich USA	P6474
Triton X-100	Sigma-Aldrich USA	T8787
NP-40	Calbiochem	492016